Automated quantificazione e analisi di procedure di conteggio delle cellule Uso ImageJ Plugin

Summary

Questo articolo descrive la quantificazione dell'emocitometro e delle micrografie di migrazione/invasione attraverso due nuovi plugin open-source di ImageJ Cell Concentration Calculator e Migration assay Counter. Inoltre, descrive i protocolli di acquisizione e calibrazione delle immagini e discute in dettaglio i requisiti di input dei plug-in.

Abstract

L'Istituto Nazionale di ImageJ di salute è una potente suite di software, liberamente disponibile l'elaborazione delle immagini. ImageJ ha algoritmi di analisi delle particelle complete che possono essere utilizzati in modo efficace per contare varie particelle biologiche. Quando il conteggio gran numero di campioni di cellule, l'emocitometro presenta un collo di bottiglia per quanto riguarda il tempo. Allo stesso modo, contando le membrane da saggi di migrazione / invasione con la ImageJ plug cellulare contatore, anche se precisa, è il lavoro eccezionalmente intenso, soggettiva, e famoso per causare dolore al polso. Per rispondere a questa esigenza, abbiamo sviluppato due plugin all'interno ImageJ per il solo compito di emocitometro automatizzata (o volume noto) e il conteggio delle cellule migrazione / invasione. Entrambi i plugin si basano sulla capacità di acquisire micrografie di alta qualità con il minimo di sfondo. Sono facili da usare e ottimizzato per il conteggio rapido e l'analisi di campioni di grandi dimensioni con strumenti di analisi integrati per aiutare la calibrazione dei conteggi. Combinando il principio di bases of Cell Contatore con un'analisi automatizzata algoritmo di conteggio e post-conteggio, questo aumenta notevolmente la facilità con cui saggi di migrazione possono essere elaborati senza alcuna perdita di precisione.

Introduction

Nel conteggio delle cellule in vitro è un'importante tecnica di base in una vasta gamma di esperimenti di coltura tissutale. Accuratamente determinare il numero di cellule in una coltura è essenziale per la riproducibilità sperimentale e standardizzazione ^1,2. Conteggio cellulare può essere eseguita manualmente utilizzando un emocitometro e utilizzando una varietà di metodi automatizzati, ciascuno con i propri vantaggi e svantaggi ^3,4,5. La maggior parte dei metodi automatizzati per il conteggio delle cellule appartengono ad una delle due classi, quelli che utilizzano il principio Coulter o citometria a flusso. Contaglobuli....

Protocol

1. Microscopio e Camera Setup (Cell Concentrazione Calculator)

1. Aumentare la lampadina luminosità completa con la manopola di regolazione della luce, passare alla lente dell'obiettivo 4X, e garantire filtri contrasto di fase vengono selezionati.
   NOTA: Qualsiasi microscopio a contrasto di fase invertito per coltura di tessuti con uno sfondo scuro, ad esempio, PHP fase di contrasto, può essere utilizzato seguendo le procedure del microscopio e della fotocamera standard.
2. All'interno del software del microscopio, impostare le impostazioni di cattura di immagini ai valori predefiniti.
   NOTA: Vedere manuale d'uso del mi....

Results

Calcolatrice cellulare Concentrazione

La figura 1 presenta il processo globale di calibrazione CCC e l'acquisizione di immagini numerabile. Figura 1A e 1B rappresentano l'immagine di calibrazione P-Square e calcolo della lunghezza del P-square in pixel. CCC determina concentrazione cellulare in un dato volume utilizzando la formula:

Discussion

Passaggi critici, risoluzione dei problemi e limitazioni

La natura stessa di metodi computazionali automatizzati, in particolare quelle di analisi delle particelle, richiede la capacità matematiche per definire queste particelle. Di conseguenza, la precisione di entrambi Calcolo cellulare Concentrazione e contatore dosaggio migrazione majorly dipende fedeltà dell'immagine, cioè quanto strettamente l'immagine catturata assomiglia membrana campione cellulare o dosaggio migrazione. È quind.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Terreni liquidi classici HyClone: RPMI 1640 - Con L-Glutammina	Fisher Scientific	SH3002702	Terreni di coltura cellulare
Siero fetale boviano (FBS)	GIBCO BRL	P00015	Integratore multimediale
HTR8/SVneo linea cellulare trofoblasto	Le cellule sono state ottenute dal Dr. Charles Graham (Queen' s University, Kingston, Canada)		Il software è progettato per funzionare con qualsiasi linea cellulare.
Tripsina	GIBCO BRL	27250-018	Preparato allo 0,20% (p/v) in 10 & micro; M EDTA 1x PBS
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
Piastre per colture cellulari da 10 cm	SARSTEDT	833902	Tutte le piastre trattate per colture tissutali saranno adatte
Inserti in membrana in poliestere Transwell - 8.0  µ m Dimensione dei pori	Costar 3422 ordinato da Fisher Scientific	7200150	Per piastre a 24 pozzetti; Dimensione dei pori: 8,0 & micro; m; diametro 6,5 mm; 0,33 cm2 area
di crescita Coloranti e reagenti per ematologia HARLECO, EMD Millipore - Soluntions 1, 2 & 3	EMD Millipore e ordinati da VWR	65044A, B, & C	Il set di coloranti Hemacolor è composto da tre flaconi di polietilene da 500 ml (16,9 once) e include un fissativo al metanolo (Soluzione 1), un colorante eosina o acido (Soluzione 2) e un blu di metilene o un colorante basico (Soluzione 3)Applicatore
con punta in cotone	Puritan Medical	806-WC
Lame di rasoio industriali a filo singolo	VWR	55411 - 055	Spessore: 0,30 mm (0,012")
Vetrini per microscopio - Prepuliti/Semplici	Fisher Scientific	12550A3	Dimensioni: 25 mm x 75 mm x 1,0 mm
Fisherbrand Cover Glasses - Rettangoli n. 1	Fisher Scientific	12-545E	Spessore: da 0,13 a 0,17 mm; Dimensioni: 50 mm x 22 mm
Fisher Chemical Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-500
Leica Microscopio stereo da dissezione	Leica Microsystems		Il microsope è dotato di fotocamera per microscopio Leica Modello MC170 HD e il software della fotocamera è Leica App. Suite (LAS E2) Versione 3.1.1 [Build: 490]. Parti del microscopio:  LED3000 Illuminazione spot Modello: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Obiettivo acromatico 1.0X, WD=90  mm Modello: MOB306 & Acromatico obiettivo 0,32X, WD=303  mm Modello: MOB315, obiettivo video 0,5X Modello: MTU-293
Assistente ematocitometro	Germania		0,100 mm Profondità - 0,0025 mm2
Microscopio a luce invertita Olympus	Corporation CKX41SF		Il microsope è dotato di Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS La fotocamera e il software della fotocamera sono Infinity analyze Versione 6.5.2
Armadio a flusso laminare 1300 Serie A2	Thermo Scientific	Modello: 1375	Qualsiasi cappa a flusso laminare per il lavoro di coltura cellulare sarà adatta
Incubatore per coltura cellulare	Thermo Scientific	Modello: 370	Qualsiasi incubatore per colture cellulari sarà adatto - Le cellule sono state coltivate in ambiente umido, 5% CO2, 37 gradi; C
ImageJ	NIH	Versione 1.50e	Versione minima richiesta
Java Runtime Environment	Oracle	Versione 1.8.0_66	Versione minima richiesta