Lo screening per Endocrine attività in acqua mediante disponibili in commercio In Vitro Transattivazione Bioassays

Sommario

Un protocollo per lo screening dell'attività endocrina negli estratti organici di campioni d'acqua, compresi gli effluenti delle acque reflue trattate e l'acqua superficiale (ricevente), è stato adattato utilizzando i biosaggi di transattivazione in vitro disponibili in commercio con arresto di divisione ("congelamento e scongelamento").

Abstract

Nel test biologici transattivazione in vitro hanno mostrato risultati promettenti come strumenti di monitoraggio della qualità delle acque, ma la loro adozione e l'applicazione diffusa è stata ostacolata in parte a causa della mancanza di metodi e disponibilità di robusta, tecnologia user-friendly standardizzati. In questo studio, disponibili in commercio, linee cellulari di divisione-arrestati sono stati impiegati per lo screening quantitativo per l'attività endocrina di sostanze chimiche presenti nei campioni di acqua di interesse per i professionisti di qualità ambientale. Un unico, protocollo standardizzato che comprendeva garanzia della qualità / controllo della qualità (QA / QC) controlli è stato sviluppato per l'attività degli estrogeni e glucocorticoidi recettore (ER e GR, rispettivamente) con un saggio basato su cellule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). I campioni di trattamento degli effluenti acque reflue urbane e delle acque di superficie dai sistemi di acqua dolce in California (USA), sono stati estratti con estrazione in fase solida e analizzati per l'attività endocrina utilizzando il proto standardizzatocol. Background e dose-risposta per le sostanze chimiche di riferimento specifici per endpoint soddisfatte le linee guida QA / QC ritenute necessarie per la misurazione affidabile. La risposta di screening test biologico per i campioni d'acqua di superficie non era in gran parte rilevabile. Al contrario, i campioni effluenti degli impianti di trattamento secondario hanno avuto la più alta attività misurabile, con concentrazioni equivalenti stimata saggi biologici (BEQ) fino a 392 ng desametasone / L per GR e 17 ng 17β-estradiolo / L per ER. La risposta saggio biologico per un campione effluente terziaria era inferiore a quello misurato per effluenti secondari, che indica un residuo inferiore di sostanze chimiche attive a livello endocrino dopo il trattamento avanzato. Questo protocollo ha dimostrato che nei biotest transattivazione vitro che utilizzano disponibili in commercio, Divisione cellulare-arrestato "kit", può essere adattato per lo screening per l'attività endocrina in acqua.

Introduzione

monitoraggio della qualità dell'acqua corrente si basa sulla capacità di misurare con precisione e con precisione la presenza di contaminanti chimici come proxy per l'esposizione per la fauna selvatica e gli esseri umani. Tuttavia, questo monitoraggio chimico-by-chimiche e paradigma di valutazione non può tenere il passo con la continua evoluzione dell'universo chimico che abbiamo di fronte. Come impariamo di più sul destino e gli effetti delle sostanze chimiche di sintesi e naturali, continuiamo a cercare strumenti di misurazione che si rivolgono attesi impatti biologici, e che allo stesso tempo sono immuni da cambiamenti nella produzione di prodotti chimici, l'utilizzo e l'ingresso ambientale. Tali strumenti sono particolarmente rilevanti per la comprensione se sconosciute o nuove sostanze chimiche e prodotti di trasformazione, meritano la nostra attenzione. Inoltre, miscele complesse di sostanze chimiche presenti nell'acqua sono scarsamente affrontate da monitoraggio chimico individuale. Così, ci troviamo di fronte alla sfida di modernizzazione degli strumenti di monitoraggio esistente per affrontare meglio questi problemi nelle acque superficiali that ricevere scarico degli effluenti acque reflue trattate e deflusso / acque piovane urbane.

Negli ultimi anni, le tecniche bioanalitici hanno mostrato risultati promettenti come strumenti di screening per la valutazione della qualità delle acque. In particolare, biotest in'vitro che rispondono alle sostanze chimiche che agiscono tramite noto, i modi d'azione specifici ^1,2 sono di grande interesse per la comunità monitoraggio ambientale ^3. Numerose indagini hanno impiegato in test biologici in vitro per quantificare l'attività endocrina di bere, di superficie e acque di scarico ^{4 -6.} Inoltre, una serie di saggi biologici bersaglio eventi scatenanti molecolari (ad esempio, il recettore di attivazione) che potenzialmente possono essere associati ad effetti deleteri via via negativo esito analisi ^7,8.

L'evoluzione della bioscreening per la valutazione della qualità delle acque è stato relativamente rapido, con centinaia di diverso in endpoint saggi biologici in vitro sono state esaminate per la loroutility ^9,10. Attualmente, solo una manciata di test biologici hanno dimostrato di ottenere una buona precisione di misura (nei laboratori), dimostrando la capacità di differenziare tra qualità dell'acqua ^5,6. Per effluenti acque reflue trattate, in particolare, la presenza di estrogeni e steroidi glucocorticoidi è stata valutata con successo nei test in vitro di transattivazione ^11,12. test biologici Tuttavia, la maggior parte degli studi fino ad oggi hanno dipendenti la cui cella linee sono di proprietà (e quindi non largamente disponibile), necessitano di cure continue e di manipolazione, o entrambi. Di conseguenza, la capacità di standardizzare i protocolli, eseguire interlaboratorio esercizi di calibrazione, e in ultima analisi, di trasferire questa tecnologia di screening per le risorse idriche della comunità rimane ostacolato.

Almeno un fornitore di test biologici in vitro controllati attraverso il programma degli Stati Uniti ToxCast è disponibile in commercio in ¹³ facili da usare "gelo e disgelo4; formati. Queste cellule "kit" di divisione-arrestati hanno dimostrato di essere robusto in misurando l'attività di sostanze chimiche estratte dall'acqua che rappresentano diversi livelli di trattamento ^14. Sebbene i protocolli vendor sono disponibili per schermare la bioattività di singoli prodotti chimici o miscele, alcuni di essi richiedono la modifica prima che possano essere applicati a campioni di acqua. Trattata acque reflue effluenti ^15, deflusso delle acque piovane ^16, ricevendo le acque ^17,18 e, più recentemente riciclato ^19,20 acqua sono i principali esempi di mezzi acquosi che sono di interesse per la comunità della qualità delle acque.

Questo studio presenta un unico protocollo standardizzato per misurare l'attività endocrina in campioni di acqua utilizzando disponibili in commercio, divisione arrestato in saggi biologici transattivazione vitro. Abbiamo dimostrato la robustezza del protocollo attraverso una valutazione globale di sfondo, responsività dose e la ripetibilità di risposta per twO endpoint di particolare interesse e di estrogeni glucocorticoidi recettore transattivazione (ER e GR, rispettivamente). Il protocollo è stato applicato a campioni dello schermo di effluenti acque reflue trattate e delle acque di superficie dai sistemi d'acqua dolce in California.

Protocollo

1. Raccogliere e Sample Water Process (Modificata da Escher et al. ⁹⁾

1. Riempire un 1 L bottiglia di vetro ambra pulita contenente 1 g di sodio azide e acido ascorbico 50 mg verso l'alto con il campione di interesse. Conservare il campione a 4 ° C e di processo all'interno di 72 ore.
   NOTA: Il sodio azide è altamente tossico e deve essere maneggiato con cautela. Utilizzare equipaggiamento protettivo (per occhi / viso, guanti, abbigliamento) e pesare in un corretto funzionamento dei fumi-cappuccio. Non utilizzare una spatola di metallo per la pesatura.
2. Passare il campione attraverso un filtro in fibra di vetro 1,6 mM e poi attraverso una cartuccia precondizionato Estrazione in fase solida (SPE) ad una portata di 5-10 ml / min. Regolare la pressione della pompa a vuoto per controllare la portata.
3. Vacuum asciugare la cartuccia per 15 min.
4. Eluire la cartuccia con 10 ml di metanolo, seguiti da 10 ml di acetone: esano (1: 1, v / v).
5. Concentrato eluato a ~ 1 ml sotto una leggera corrente di azoto ad alta purezza. Solventescambio aggiungendo 500 ml di dimetilsolfossido (DMSO) ed evaporando l'estratto fino a 500 microlitri.
6. Trasferire l'estratto di un campionatore automatico fiala di vetro ambra. Conservare a -20 ° C.

2. Preparare diluizioni del test specifico chimica di riferimento e estrarre l'acqua

1. Preparare diluizioni 9 per la curva di calibrazione.
   1. Fare una soluzione madre della specifica sostanza chimica di riferimento del test in 100% DMSO. La concentrazione finale deve essere 2 mM 17β-estradiolo per il dosaggio ER, e 100 pM desametasone per il dosaggio GR. Conservare le soluzioni madre a -20 ° C.
   2. Aggiungere 15 ml di brodo chimico di riferimento appropriato per 285 ml di terreno di coltura in una provetta sterile (tubo # 1). Mescolare il campione pipettando su e giù.
   3. Aggiungere 200 ml di una soluzione di 5% DMSO in terreno di coltura in 8 provette (tubi # 2-9).
   4. Trasferire un'aliquota di 100 microlitri dal tubo # 1 a tubo # 2 con vascae # 9 per eseguire una serie di diluizioni di 3 volte. Ogni campione diluito deve essere accuratamente miscelato con pipetta prima di prendere una aliquota e aggiungendolo al tubo successivo.
2. Preparare un campione di controllo di solvente miscelando 10 ml di DMSO in 190 ml di terreno di coltura.
3. Preparare quattro diluizioni per ogni estratto di acqua.
   1. Nel primo tubo, aggiungere 5 ml di estratto d'acqua in 95 ml di terreno di coltura e mescolare accuratamente. Aggiungere 50 ml di 5% DMSO in terreno di coltura in altri tre tubi.
   2. Eseguire una diluizione 2 volte trasferendo 50 ml di soluzione da una provetta all'altra.

3. Preparare la sospensione cellulare di condurre l'FRET Bioassay

1. Preparare il supporto specifico test in base alle istruzioni del produttore. terreno di coltura deve essere conservato a 4 ° C e riscaldato a 37 ° C in un bagno d'acqua prima dell'uso.
2. Prendere una fiala di cellule divisione arrestato ER o GR fuori della libera criogenicozer e scongelare le cellule rapidamente ponendo il flacone a 37 ° C bagnomaria per 2 minuti con agitazione. Decontaminare la fiala con il 70% di etanolo e collocarlo in una cappa di sicurezza biologica di Classe II.
3. Aprire il flacone usando tecniche asettiche e trasferire le cellule in 10 ml di terreno di coltura.
4. Centrifugare a 200 g per 5 min.
5. Aspirare il supernatante utilizzando una pipetta di vetro sterile e risospendere il pellet cellulare in 6 ml di terreno di coltura.
6. Mescolare 5 ml di sospensione cellulare con 5 ml di una soluzione di colorazione vitale e aggiungere una aliquota in una camera di conteggio.
7. Contare il numero di cellule vive usando un microscopio ottico o un contatore automatico di cellule e stimare la densità di cellule vive nella sospensione cellulare. Diluire se necessario, per ottenere una densità finale di 550.000 cellule vive per ml di terreno di coltura.

4. Cellule piatto in un pozzo-96 Black Plate parete Clear-bottom e Aggiungere diluito estrarre l'acqua

1. Creare un piattolayout che include un test della curva a 9 punti taratura specifica, i campioni di QA / QC e molteplici diluizioni per ogni estratto di acqua. Un esempio di un layout di piastra a 96 pozzetti è mostrato in Figura 1.
2. Aggiungere 90 ml di terreno di coltura per i pozzetti di controllo privi di cellule replicate.
3. Versare la sospensione cellulare in un serbatoio pipettaggio sterile e aggiungere 90 ml di sospensione cellulare agli altri pozzetti usando una pipetta multicanale.
4. Aggiungere 10 ml di campioni diluiti preparati durante la fase 2 nei rispettivi pozzetti. La concentrazione finale di DMSO per pozzetto deve essere di 0,5% al ​​massimo.
5. Coprire la piastra con un coperchio e metterlo in un incubatore CO ₂ 5% a 37 ° C per 16 ore.

Figura 1:. Esempio di layout delle piastre a 96 pozzetti La piastra multi-pozzo è progettato per includere una curva di taratura specifica dosaggio, 3 tipidi controlli QA / QC (media only, cellule in terreno pulito e cellule in DMSO a spillo di media) e 4 diluizioni per ogni estratto di acqua. Ogni controllo e diluizione di estratto di acqua viene analizzata nei pozzi triplice copia. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

5. Preparare la Loading Solution e Aggiungere ad ogni pozzetto

1. Dopo l'incubazione, lasciare la piastra per equilibrare a RT. Per questo saggio biologico FRET, passi 5.2 attraverso 5.6 dovrebbe essere condotta in assenza di luce diretta.
2. Preparare una soluzione 6x carico secondo le istruzioni del produttore.
3. Aggiungere 20 ml di soluzione 6x carico a ciascun pozzetto.
4. Aggiungere 10 ml di reagente di vitalità cellulare in ciascun pozzetto di valutare la citotossicità dell'estratto diluito con acqua.
5. Sigillare la piastra con pellicola adesiva in alluminio.
6. Incubare la piastra al buio a temperatura ambiente per 2 ore.

6. citotossicità Misurare e endocrino attività di risposta

1. Impostare il lettore di micropiastre con capacità di fondo di lettura seguito le istruzioni del produttore.
2. Per la transattivazione saggio biologico FRET, misurare la fluorescenza nel blu (409/460 nm, di eccitazione (Ex) / emissione (Em) di lunghezza d'onda) e verde (409 Es / 530 Em nm) canali.
3. Per il test di citotossicità, misurare la fluorescenza a 560 Ex / 590 Em nm.

7. Valutare QA / QC controlli per determinare la qualità dei dati

1. Confrontare la fluorescenza grezza media del cell-free (media only) i controlli e le cellule soli (cellule nel terreno di coltura pulita). La fluorescenza di fondo media-solo dovrebbe essere inferiore di almeno il 25% rispetto alla risposta del controllo cellule soli.
2. Elaborare i dati grezzi FRET. Per entrambi i 'blu' e set di dati "verdi", sottrarre la fluorescenza media dei pozzetti di controllo privi di cellule da ogni cella contenente bene. calcolare ilblu / verde il rapporto per ogni bene sperimentale.
3. Confronto blu Rapporto / verde delle cellule soli e le cellule con controlli DMSO. valori di fluorescenza di questi controlli devono essere entro il 15% deviazione standard relativa (RSD).
4. Tracciare la curva di calibrazione specifica saggio come blu rapporto / verde contro la concentrazione del campione espressa come una massa molecolare di registro (log M). Calcolare la pendenza, R ² e log EC ₅₀ (50% Effect Concentration). Parametri di taratura devono essere all'interno del range previsto elencati nella tabella 1.
5. Calcolare la RSD per tutti i pozzetti in triplicato. La variabilità tra le repliche deve essere inferiore al 20%.
6. Per i dati di citotossicità (560 Ex / 590 Em nm), sottrarre la media di controllo cell-free (cioè sfondo media) da tutti i pozzetti di cellule contenenti.
7. Calcolare la fluorescenza di fondo media-sottratto per ogni campione. Tracciare i dati di fluorescenza risultante come percentuale del controllo DMSO. diluizioni campione non deveesporre mortalità cellulare più del 20% rispetto alle cellule sola e DMSO controlli.

8. Analisi dei dati

1. Calcolare il limite del test di rilevamento (LOD) come la risposta minima di taratura più due deviazioni standard della media di quella risposta.
2. Per i campioni che mostrano una risposta alla dose, ricavare il ₅₀ CE   dell'estratto dell'acqua utilizzando la pendenza di una regressione lineare della curva di calibrazione tra 10 e 50% Concentrazioni di effetto della sostanza chimica di riferimento.
3. Calcolare la concentrazione Bioanalitica Equivalente (BEQ) mediante la formula: BEQ = EC ₅₀ di chimica di riferimento / CE ₅₀ del campione di acqua.

Risultati

Nel presente studio, 4x 24 hr campioni compositi di trattamento degli effluenti acque reflue urbane, 6 campioni prelevati di acque superficiali provenienti da sistemi di acqua dolce nel sud della California e un campo vuoto costituito da acqua ultrapura sono stati selezionati per illustrare questo protocollo. 3 dei campioni 4 effluenti provenivano da impianti convenzionali di trattamento dei fanghi attivati ​​acque reflue ( "effluente secondario"), e il quarto da una pianta avanzata depu...

Discussione

La potenza ben documentata di estrogeni ambientali, come 17β-estradiolo (E2), lo screening mandati di queste sostanze chimiche in ng / L concentrazioni ^23,24. In questo studio, la risposta ER per gli effluenti di acque reflue (gamma BEQ: 2,3-17 ng E2 / L) era un po 'superiore a quello riportato per effluente secondario da WWTPs australiani ^20, mentre i BEQ per le acque superficiali (<0,5 a 4 ng E2 / L ) erano nel range riportato per superficie e delle acque piovane altrove (<1 a 11 ng E2 ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Kit per il test GeneBLAzer ER alpha DA	Il kit ThermoFisher	K1393	include celle di arresto della divisione ER (DA) e kit di caricamento LiveBLAzer FRET.
Kit di analisi GeneBLAzer GR DA	Il kit ThermoFisher	K1391	include celle con arresto a divisione GR (DA) e kit di caricamento LiveBLAzer FRET.
Reagente per la vitalità cellulare PrestoBlue	ThermoFisher	A-13261
Trypan blue, 0,4% in PBS	Sigma-Aldrich	T8154	Disponibile anche presso ThermoFisher
Corning Parete nera a 96 pozzetti, piastra a fondo trasparente	Corning	3603	Confezionato singolarmente, sterile con coperchio
Filtri in fibra di vetro Whatman, GF/A, 1,6 e micro; M	Sigma-Aldrich
Pellicola sigillante in alluminio per micropiastre	E& K Scientific	T592100
Oasis HLB cartuccia 6 cc, 200 mg assorbente	Acque	WAT106202
17β Estradiolo	Sigma-Aldrich	E2758	CAS #50-28-2
Acido ascorbico	Fisher Scientific	A61-100	Disponibile anche presso Sigma-Aldrich
Desametasone	Sigma-Aldrich	D4902	CAS #50-02-2
Dimetil solfossido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418	Solventi di grado molecolare
(acetone, esano, metanolo)	Fisher Scientific		HPLC grado
di azide di sodio	Sigma-Aldrich	S2002	è altamente tossica e deve essere maneggiata con cautela. Utilizzare indumenti protettivi e pesare sotto una cappa aspirante. Disponibile anche presso EMD Millipore.
Contatore di cellule o emocitometro automatizzato	Vari*		I fornitori includono Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich e ThermoFisher.
Cabina di sicurezza biologica di classe II	Varie*
sub>2 incubatore	Vario*
Congelatore criogenico	Si		consiglia di utilizzare il dewar per lo stoccaggio dell'azoto liquido.
Lettore di micropiastre a fluorescenza	Various*		Il lettore deve avere capacità di lettura dal basso.
* Nessuna fonte consigliata, la scelta di questa attrezzatura dipende dal budget, dalla frequenza di utilizzo e dallo spazio del laboratorio.