Un protocollo per lo screening dell'attività endocrina negli estratti organici di campioni d'acqua, compresi gli effluenti delle acque reflue trattate e l'acqua superficiale (ricevente), è stato adattato utilizzando i biosaggi di transattivazione in vitro disponibili in commercio con arresto di divisione ("congelamento e scongelamento").
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Lo screening per Endocrine attività in acqua mediante disponibili in commercio
In questo articolo
Sommario
Abstract
Nel test biologici transattivazione in vitro hanno mostrato risultati promettenti come strumenti di monitoraggio della qualità delle acque, ma la loro adozione e l'applicazione diffusa è stata ostacolata in parte a causa della mancanza di metodi e disponibilità di robusta, tecnologia user-friendly standardizzati. In questo studio, disponibili in commercio, linee cellulari di divisione-arrestati sono stati impiegati per lo screening quantitativo per l'attività endocrina di sostanze chimiche presenti nei campioni di acqua di interesse per i professionisti di qualità ambientale. Un unico, protocollo standardizzato che comprendeva garanzia della qualità / controllo della qualità (QA / QC) controlli è stato sviluppato per l'attività degli estrogeni e glucocorticoidi recettore (ER e GR, rispettivamente) con un saggio basato su cellule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). I campioni di trattamento degli effluenti acque reflue urbane e delle acque di superficie dai sistemi di acqua dolce in California (USA), sono stati estratti con estrazione in fase solida e analizzati per l'attività endocrina utilizzando il proto standardizzatocol. Background e dose-risposta per le sostanze chimiche di riferimento specifici per endpoint soddisfatte le linee guida QA / QC ritenute necessarie per la misurazione affidabile. La risposta di screening test biologico per i campioni d'acqua di superficie non era in gran parte rilevabile. Al contrario, i campioni effluenti degli impianti di trattamento secondario hanno avuto la più alta attività misurabile, con concentrazioni equivalenti stimata saggi biologici (BEQ) fino a 392 ng desametasone / L per GR e 17 ng 17β-estradiolo / L per ER. La risposta saggio biologico per un campione effluente terziaria era inferiore a quello misurato per effluenti secondari, che indica un residuo inferiore di sostanze chimiche attive a livello endocrino dopo il trattamento avanzato. Questo protocollo ha dimostrato che nei biotest transattivazione vitro che utilizzano disponibili in commercio, Divisione cellulare-arrestato "kit", può essere adattato per lo screening per l'attività endocrina in acqua.
Introduzione
monitoraggio della qualità dell'acqua corrente si basa sulla capacità di misurare con precisione e con precisione la presenza di contaminanti chimici come proxy per l'esposizione per la fauna selvatica e gli esseri umani. Tuttavia, questo monitoraggio chimico-by-chimiche e paradigma di valutazione non può tenere il passo con la continua evoluzione dell'universo chimico che abbiamo di fronte. Come impariamo di più sul destino e gli effetti delle sostanze chimiche di sintesi e naturali, continuiamo a cercare strumenti di misurazione che si rivolgono attesi impatti biologici, e che allo stesso tempo sono immuni da cambiamenti nella produzione di prodotti chi....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Raccogliere e Sample Water Process (Modificata da Escher et al. 9)
- Riempire un 1 L bottiglia di vetro ambra pulita contenente 1 g di sodio azide e acido ascorbico 50 mg verso l'alto con il campione di interesse. Conservare il campione a 4 ° C e di processo all'interno di 72 ore.
NOTA: Il sodio azide è altamente tossico e deve essere maneggiato con cautela. Utilizzare equipaggiamento protettivo (per occhi / viso, guanti, abbigliamento) e pesare in un corretto funzionamento dei fumi-cappuccio. Non utilizzare una spatola di metallo per la pesatura. - Passare il campione attraverso un filtro in fibra di vetro 1,6 m....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Nel presente studio, 4x 24 hr campioni compositi di trattamento degli effluenti acque reflue urbane, 6 campioni prelevati di acque superficiali provenienti da sistemi di acqua dolce nel sud della California e un campo vuoto costituito da acqua ultrapura sono stati selezionati per illustrare questo protocollo. 3 dei campioni 4 effluenti provenivano da impianti convenzionali di trattamento dei fanghi attivati acque reflue ( "effluente secondario"), e il quarto da una pianta ava.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
La potenza ben documentata di estrogeni ambientali, come 17β-estradiolo (E2), lo screening mandati di queste sostanze chimiche in ng / L concentrazioni 23,24. In questo studio, la risposta ER per gli effluenti di acque reflue (gamma BEQ: 2,3-17 ng E2 / L) era un po 'superiore a quello riportato per effluente secondario da WWTPs australiani 20, mentre i BEQ per le acque superficiali (<0,5 a 4 ng E2 / L ) erano nel range riportato per superficie e delle acque piovane altrove (<1 a 11 ng E2 .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Il finanziamento è stato fornito dal Consiglio di Controllo delle Risorse Idriche dello Stato (Accordi n. 10-096-250 e 14-090-270). Ringraziamo S. Abbasi, M. Connor, S. Engelage, K. North, J. Armstrong, S. Asato, M. Dojiri, D. Schlenk, S. Snyder, S. Westerheide, B. Escher, F. Leusch, G. Pelanek, K. Bi e J. Printen. Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse e il riferimento ai nomi commerciali non implica l'approvazione.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit per il test GeneBLAzer ER alpha DA | Il kit ThermoFisher | K1393 | include celle di arresto della divisione ER (DA) e kit di caricamento LiveBLAzer FRET. |
| Kit di analisi GeneBLAzer GR DA | Il kit ThermoFisher | K1391 | include celle con arresto a divisione GR (DA) e kit di caricamento LiveBLAzer FRET. |
| Reagente per la vitalità cellulare PrestoBlue | ThermoFisher | A-13261 | |
| Trypan blue, 0,4% in PBS | Sigma-Aldrich | T8154 | Disponibile anche presso ThermoFisher |
| Corning Parete nera a 96 pozzetti, piastra a fondo trasparente | Corning | 3603 | Confezionato singolarmente, sterile con coperchio |
| Filtri in fibra di vetro Whatman, GF/A, 1,6 e micro; M | Sigma-Aldrich | ||
| Pellicola sigillante in alluminio per micropiastre | E& K Scientific | T592100 | |
| Oasis HLB cartuccia 6 cc, 200 mg assorbente | Acque | WAT106202 | |
| 17β Estradiolo | Sigma-Aldrich | E2758 | CAS #50-28-2 |
| Acido ascorbico | Fisher Scientific | A61-100 | Disponibile anche presso Sigma-Aldrich |
| Desametasone | Sigma-Aldrich | D4902 | CAS #50-02-2 |
| Dimetil solfossido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Solventi di grado molecolare |
| (acetone, esano, metanolo) | Fisher Scientific | HPLC grado | |
| di azide di sodio | Sigma-Aldrich | S2002 | è altamente tossica e deve essere maneggiata con cautela. Utilizzare indumenti protettivi e pesare sotto una cappa aspirante. Disponibile anche presso EMD Millipore. |
| Contatore di cellule o emocitometro automatizzato | Vari* | I fornitori includono Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich e ThermoFisher. | |
| Cabina di sicurezza biologica di classe II | Varie* | ||
| sub>2 incubatore | Vario* | ||
| Congelatore criogenico | Si | consiglia di utilizzare il dewar per lo stoccaggio dell'azoto liquido. | |
| Lettore di micropiastre a fluorescenza | Various* | Il lettore deve avere capacità di lettura dal basso. | |
| * Nessuna fonte consigliata, la scelta di questa attrezzatura dipende dal budget, dalla frequenza di utilizzo e dallo spazio del laboratorio. |
Riferimenti
- Dix, D. J., Houck, K. A., Martin, M. T., Richard, M. A., Setzer, R. W., Kavlock, R. J. The ToxCast program for prioritizing toxicity testing of environmental chemicals. Toxicol. Sci. 95 (1), 5-12 (2007).
- Reif, D. M., et al. Endocrin....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
Tag
Saggio biologico di transattivazione in vitroscreening dell attivit endocrinamonitoraggio della qualit dell acquasaggio del recettore degli estrogenisaggio del recettore dei glucocorticoiditrasferimento di energia per risonanza di fluorescenzaestrazione in fase solidacellule con arresto della divisioneconcentrazione equivalente del saggio biologicoassicurazione della qualit e controllo della qualit
