trappole extracellulari dei neutrofili (NET) sono reti di DNA, istoni e proteine neutrofili. Sebbene un componente della risposta immunitaria innata, NET sono implicati in autoimmunità e trombosi. Questo protocollo descrive un metodo semplice per l'isolamento dei neutrofili canina e la quantificazione di NET utilizzando un saggio micropiastra fluorescenza.
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Articolo metodologico
Un semplice test di fluorescenza per la quantificazione del Canine neutrofili extracellulare Trappola di uscita
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le trappole extracellulari dei neutrofili sono reti di DNA, istoni e proteine neutrofile rilasciate in risposta a stimoli infettivi e infiammatori. Sebbene siano un componente della risposta immunitaria innata, i NET sono implicati in una serie di processi patologici, tra cui l'autoimmunità e la trombosi. Questo protocollo descrive un metodo semplice per l'isolamento dei neutrofili canini e la quantificazione dei NET utilizzando un saggio di fluorescenza su micropiastra. Il sangue viene raccolto utilizzando tecniche convenzionali di venipuntura. I neutrofili vengono isolati utilizzando la sedimentazione del destrano e un gradiente di densità utilizzando condizioni ottimizzate per il sangue del cane. Dopo aver lasciato il tempo per l'attaccamento ai pozzetti di una piastra a 96 pozzetti, i neutrofili vengono trattati con agonisti che inducono NET come il forbolo-12-miristato-13-acetato o il fattore di attivazione piastrinica. Il rilascio di DNA viene misurato dalla fluorescenza di un colorante di acido nucleico impermeabile alle cellule. Questo test è un metodo semplice ed economico per quantificare il rilascio di NET, ma la formazione di NET piuttosto che altre cause di morte cellulare deve essere confermata con metodi alternativi.
Introduzione
Ci sono oltre 70 milioni di cani negli Stati Uniti da solo 1. Come membri della famiglia stimati, questi animali spesso ricevono cure mediche taglio bordo. Altrettanto perché condividono il nostro ambiente, i cani possono fornire intuizioni nella patogenesi e nel trattamento delle malattie umane 1. Tuttavia, se traducendo scoperte in medicina umana in trattamenti veterinari o viceversa, è importante caratterizzare accuratamente variazioni specie anche in sistemi altamente conservati quali la risposta immunitaria innata. Esempi di differenze tra il cane e il sistema immunitario innato umano includono l'alta espressione CD4 sui neutrofili cane....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti con il permesso etico da parte del Comitato Istituzionale dell'Università cura degli animali e Usa Iowa State.
Raccolta 1. Sangue
- Disegnare 9 ml di sangue da una safena, la vena cefalica o giugulare direttamente in anticoagulante (ad esempio, l'acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 1,8 mg K 2 EDTA / ml di sangue) vacutainer, o in una siringa con il trasferimento immediato di provette di sangue EDTA contenenti. Delicatamente rotolare o invertire i tubi di sangue per assicurare un'adeguata miscelazione del sangue e anticoagulante.
2. Isolamen....
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Risultati
Usando questo protocollo, dovrebbe esserci una forte variazione piega in fluorescenza dopo stimolazione neutrofili con i controlli positivi, PMA e PAF. Come illustrato nella Figura 1B, la stimolazione dei neutrofili canino con 31 pM PAF per 1 hr, comportano un aumento medio di 4,0 volte della fluorescenza rispetto alle cellule non stimolate (range 2,0-5,8, n = 5 cani) 18. PMA a 0,1 micron (Figura 1A) è un agonista più lento che non si traduca .......
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Discussione
Il saggio di rilascio del DNA presentato è un test facilmente quantificabile per il DNA extracellulare. Il metodo è stato adattato da tecniche simili utilizzati per valutare la formazione di NET in altre specie, ma la velocità di centrifugazione, le concentrazioni di agonisti e tempi di incubazione sono state modificate per ottimizzare il metodo per l'utilizzo con i neutrofili canini 8,17,18. regolazioni simili potrebbero essere fatte per adattare il metodo per le altre specie. Il test è semplice e poco c.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano i dottori James Roth, William Nauseef e Kayoko Kimura e il signor Tom Skadow per l'assistenza nello sviluppo dei protocolli dei neutrofili canini. RDG è supportato da una Wellcome Trust Fellowship rif: WT093767MA.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provetta di sangue intero in plastica con rivestimento a spruzzo K2EDTA | BD | 367835 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Dextran-500 | Accurato corp. | ||
| Soluzione salina tamponata con fosfato | ThermoFisher scientific | 20012043 | |
| Siero fetale di vitello bovino, inattivato al calore | ThermoFisher scientific | 10100139 | |
| RPMI Media 1640, senza rosso fenolo o L-glutammina | ThermoFisher scientific | 32404-014 | Deve essere privo di rosso fenolo |
| 96 piastra in polistirene sterile a fondo piatto | Falcon | ||
| Phorbol 12-miristato 13-acetato | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Fattore di attivazione piastrinica | Sigma-Aldrich | P4904 | |
| SYTOX Macchia di acido nucleico verde | ThermoFisher scientific | S7020 | |
| Synergy 2 Lettore multimodale | BioTek | NA |
Riferimenti
- Schiffman, J. D., Breen, M. Comparative oncology: what dogs and other species can teach us about humans with cancer. Philos Trans Rl Soc B Biol Sci. 370, 1673(2015).
- Williams, D. L. Studies of canine leucocyte antigens: a significant a....
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Ristampe e permessi
