Articolo metodologico

Produzione semplici ed efficaci e Purificazione di topo mielina Oligodendrocyte glicoproteina di encefalomielite autoimmune sperimentale Studi

DOI:

10.3791/54727

⸱

27 ottobre 2016

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Western University

In questo articolo

Sommario

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Descriviamo un semplice protocollo che utilizza solo attrezzature di laboratorio di base per generare e purificare grandi quantità di una proteina di fusione che contiene glicoproteina oligodendrocitaria della mielina di topo. Questa proteina può essere utilizzata per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale guidata da cellule T e B.

Abstract

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La sclerosi multipla (SM) è una malattia infiammatoria cronica del sistema nervoso centrale (SNC), che si pensa si verifichi a seguito di risposte autoimmuni che colpiscono la mielina. L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è il modello animale più comune di malattia autoimmune del SNC ed è tipicamente indotta tramite immunizzazione con peptidi corti che rappresentano epitopi immunodominanti delle cellule T CD4+ delle proteine della mielina. Tuttavia, le cellule B riconoscono direttamente le proteine non trasformate e l'immunizzazione con peptide corto non attiva le cellule B che riconoscono la proteina nativa. Poiché recenti studi clinici sulle terapie che deplevano le cellule B nella SM hanno suggerito un ruolo delle cellule B nel guidare la malattia nell'uomo, c'è un urgente bisogno di modelli animali che incorporino il riconoscimento dell'autoantigene da parte delle cellule B. A tal fine, abbiamo generato una nuova proteina di fusione contenente il dominio extracellulare della versione murina della glicoproteina oligodendrocitaria della mielina (MOG) e fusioni N-terminali di un His-tag per scopi di purificazione e la proteina tioredossina per migliorare la solubilità (MOG tag). È stato incorporato un sito di scissione della proteasi del virus dell'etch del tabacco (TEV) per consentire la rimozione di tutte le sequenze di tag, lasciando solo il dominio extracellulare MOG1-125 puro. Qui, descriviamo un semplice protocollo che utilizza solo apparecchiature di laboratorio standard per produrre grandi quantità ditag MOG puro o MOG1-125. Questo protocollo genera costantemente oltre 200 mg di proteinatag MOG. L'immunizzazione contag MOG o MOG1-125 genera una risposta autoimmune che include cellule B patogene che riconoscono il MOG nativo del topo.

Introduzione

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La sclerosi multipla è una malattia umana caratterizzata da infiammazione cronica e neurodegenerazione del sistema nervoso centrale che è pensato per essere guidato da una risposta autoimmune diretta verso la mielina. La perdita di mielina e gli assoni nel tempo comporta il graduale declino cognitivo e motorio funzione 1. "Encefalomielite autoimmune sperimentale" è un termine generico per i modelli animali di malattia autoimmune rivolta mielina del SNC. Come MS umani, EAE è tipicamente caratterizzato da infiltrazione di cellule immunitarie del sistema nervoso centrale e, in alcuni casi, demielinizzazione 2. Tuttavia, il grado in cui un dato modello di EAE assomiglia MS umana in parte dipende dalle specie o ceppo utilizzati e della complessità della risposta autoimmune anti-mielina sottostante.

autoimmunità anti-mielina può essere indotta sperimentalmente in vari modi, ma il metodo più comune utilizzato oggi è quello di immunizzare i topi con una breve peptide di aminoacidi imitando il CD4 immunodominante + T epitopo cellule di una proteina mielina. Questo rappresenta il requisito minimo per indurre una risposta patogena. Forse il più comune di questi è un peptide di 21 aminoacidi derivato da myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG 35-55), che viene utilizzato per indurre EAE in topi C57BL / 6 3. Tuttavia, per alcuni scopi sperimentali è desiderabile o addirittura necessario per immunizzare con antigeni proteici più grandi e in effetti ci sono molti vantaggi a questo oltre l'immunizzazione con breve peptide. Innanzitutto, a causa della restrizione MHC, piccoli peptidi sono generalmente efficaci solo in una gamma molto limitata di ceppi, mentre antigeni proteici grandi corrispondenti sia l'intera proteina o un dominio specifico possono essere elaborati normalmente per presentarli in diversi ceppi di topi inbred o anche in diverse specie 4. In secondo luogo, un antigene proteico più grande è in grado di indurre una risposta immunitaria più complesso incorporando più tipi di linfociti nel riconoscimento dell'antigene, piuttosto che limiting riconoscimento dell'antigene alle cellule T CD4 +. Ad esempio, le cellule B tramite il loro recettore delle cellule B (BCR) interagiscono direttamente con tutto piuttosto che elaborati proteine. Noi e altri hanno dimostrato che le cellule B attivate da MOG 35-55 immunizzazione non riconoscono la proteina MOG 5. Dato che le cellule B sono stati recentemente dimostrato di giocare un ruolo patogenetico nella SM umano 6, modelli EAE che incorporano le cellule B in patologia autoimmune sono sempre più importanti.

Nonostante i vantaggi dell'utilizzo di antigeni proteici grandi per indurre EAE, rimangono poche fonti disponibili in commercio per tali proteine. Infatti, mentre i peptidi corti come MOG 35-55 possono essere sintetizzati molto rapidamente e ad un costo relativamente basso, le opzioni commerciali per proteina MOG sono limitati e costo sostanzialmente più acquistare. Tuttavia, ci sono diversi vettori di espressione disponibili per i gruppi di ricerca per generare MOG dominio extracellulare (MOG) 1-125 stessi. However, tutti i sistemi di espressione che abbiamo identificato in letteratura sono basati su vecchie tecnologie che sono state sostituite con sistemi di espressione più efficienti 7. Inoltre, la maggior parte sono basati su ratto o umano MOG 8. Per alcune ricerche di autoimmunità in topi, un antigene basato sulla autoantigene del mouse MOG è preferibile. Infine, tutte le proteine MOG-based che abbiamo individuato, sia commerciale o come vettori di espressione, sono proteine di fusione contenenti amminoacidi supplementari alla base MOG 1-125. Questi includono un tag per la purificazione e di solito altre sequenze così, molte delle quali con una funzione siamo stati in grado di identificare.

Per far fronte a queste limitazioni, abbiamo generato una proteina di fusione romanzo basato sul mouse MOG dominio extracellulare fuso a un tag contenente tioredossina per combattere l'insolubilità noto di MOG proteine 5. La sequenza di tag contiene anche una sequenza 6xHis di purificazione e di una proteasi TEV CLEsito Avage che permette la rimozione completa di tutte le sequenze di tag, se desiderato. Questo è l'unico metodo che siamo consapevoli di generare puro proteina MOG 1-125. Per facilitare la produzione di grandi quantità di proteine, la sequenza MOG 1-125 era codone ottimizzato per l'espressione batterica e la proteina di fusione tag MOG è stato inserito nel sistema di espressione pET-32. Qui, descriviamo in dettaglio il protocollo per produrre e purificare MOG proteine tag, e puro MOG 1-125, utilizzando attrezzature non specializzati a disposizione maggior parte dei laboratori di immunologia.

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Protocollo

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1. Proteine ​​induzione

NOTA: Nelle seguenti passaggi, BL21 Escherichia coli trasformato con un vettore pET-32 contenente la sequenza per la proteina tag MOG di fusione (vedi riferimento 5 e Figura 1) sono coltivati a densità elevate e sono quindi indotti a esprimere la proteina tag MOG . Vedere la Figura 2 per cronologia generale - di notare che i giorni sono i punti di stop approssimativi alternativi sono indicati nel protocollo. Se a partire da purificato DNA tag PET-32 MOG vettore, sarà necessario trasformare chimicamente in competente BL21 E. coli, batteri che utilizzano la selezione ampicillina, come è stato ben descritto 9. Trasformazione di successo può essere confermata purificando DNA da batteri selezionati con un kit commerciale standard, seguita da digestione con gli enzimi di restrizione AGE1 e SAC1 per produrre una banda 424 bp su un gel di agarosio 10.

  1. inoculare 5 ml di brodo sterile lisogenia brodo (LB) (0,1 mg ampicillina / ml) con un BL21-MOG tag stock di glicerolo e incubare durante la notte a 37 ° C, 200 giri al minuto.
  2. Inserire due palloni 1 L Erlenmeyer contenenti 500 ml di brodo LB sterile in un incubatore a 37 ° in preparazione per il giorno successivo.
  3. Aggiungere 500 pl di 100 mg / ml di ampicillina a ciascuno dei flaconi contenenti 500 ml LB dal punto 1.2 (concentrazione finale 0,1 mg / ml di ampicillina). Trasferire 1 ml della coltura overnight dal punto 1.1 a ciascuno dei due palloni di brodo LB. Incubare a 37 ° C e 200 rpm per 5 ore o fino ad una densità ottica di 0,6.
  4. Prendere una 1 ml un'aliquota da uno dei flaconi e trasferirlo in un tubo separato da centrifuga da 1,5 ml. Agglomerare le cellule a 16.000 xg per 1 min e rimuovere il surnatante. Etichettare il tubo come T 0 (pre-induzione) e poi mettere il pellet batterico in un -20 ° C freezer per il futuro sodio dodecil solfato gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) Analisi (vedere la sezione 8 e la Figura 3).
  5. Aggiungere 0,5 ml di 1 M isopropilico β-D-1-thiogalactopyranoside, Isopropyl β-D-tiogalattoside (IPTG) per ogni pallone di coltura. Incubare le beute a 37 ° C, 200 rpm per 4 ore, quindi a temperatura ambiente a 75 rpm durante la notte.

2. La raccolta MOG tag proteine

NOTA: In questa fase, i batteri avrà prodotto grandi quantità di proteine tag MOG. Per raccogliere tag MOG, batteri vengono prima lisate in un buffer Triton X-100 seguito da sonicazione. Tag MOG viene poi rilasciato da corpi di inclusione e denaturato con imidazolo e guanidina, risultante in una soluzione proteica grezza contenente la proteina tag MOG.

  1. Prendere un 1 ml un'aliquota da una delle culture durante la notte dal punto 1.5 e trasferirlo in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Agglomerare le cellule a 16.000 xg per 1 min e rimuovere il surnatante. Etichettare la vascae T O / N (post-induzione) poi mettere il pellet batterico in una -20 ° C per una futura analisi della pagina SDS (Figura 3).
  2. Distribuire le culture in modo uniforme tra le bottiglie da 250 ml compatibile con l'alta velocità e la centrifugazione tenerli in ghiaccio da questo punto in avanti. Agglomerare le cellule batteriche a 22.000 xg per 15 min a 4 ° C.
  3. Eliminare il surnatante. Conservare il pellet batterici a -20 ° C o continuare al punto 2.4.
  4. Preparare tampone di lisi (0,1 mg / ml di lisozima uovo di gallina, 0,1% Triton-X (v / v) in tampone fosfato (PBS)) aggiungendo 60 ml di Triton X-100 e 120 ml di 50 mg / ml uovo di gallina lisozima soluzione stock di 60 ml di PBS.
  5. Risospendere e combinare tutti i pellet batterici dal punto 2.3 in un totale di 30 ml di tampone di lisi. Trasferire questo volume ad un tubo a fondo tondo da 50 ml in grado di alta centrifugazione velocità. Inserire questo tubo in un bagnomaria C 30 ° per 30 min. Durante il periodo di incubazione, agitare il tubodue volte per risospendere le cellule.
  6. Dopo l'incubazione, trasferire il tubo sul ghiaccio e sonicare la soluzione a 20 kHz, l'ampiezza del 70%, su impulso di 3 secondi, il polso fuori 3 sec, e cinque impulsi per giro. Sonicare la soluzione per sei turni totali e consentire la soluzione raffreddare sul ghiaccio in-tra un round.
  7. Centrifugare ad 24.000 xg per 15 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante e ripetere i passaggi 2,5-2,7 una volta. Conservare il pellet a -20 ° C o continuare al punto 2.8.
  8. Preparare tampone A (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM imidazolo, pH 7,9) aggiungendo 0,8766 g di NaCl, 0,09,456 mila g di Tris-HCl e 0,01,021 mila g di imidazolo ad un becher da 100 ml. Aggiungere H 2 O fino a quando il volume raggiunge 28 ml quindi regolare il pH della soluzione a 7,9. Poi, trasferire la soluzione in 100 ml cilindro graduato e aggiungere H 2 O fino al volume di 30 ml.
  9. Risospendere il pellet dal punto 2.7 in 30 ml di tampone A e incubare questa soluzione a 4 ° C per 3 ore. Durante questo periodopesare 17,2 g di guanidina-HCl.
  10. Sonicare la soluzione su ghiaccio con le stesse impostazioni come al punto 2.6. Aggiungere quindi 17,2 g di guanidina-HCl alla soluzione. Incubare questo in ghiaccio per 1 ora per solubilizzare la proteina tag MOG.
  11. Centrifugare ad 24.000 xg per 30 min a 4 ° C. Raccogliere il surnatante e conservare il surnatante a 4 ° C fino purificazione della proteina.

3. purificazione delle proteine

NOTA: Nelle seguenti fasi della proteina tag MOG sarà purificato attraverso 4 giri di assorbimento su resina nichel carica (tramite il His-tag) e eluizione.

  1. Effettuare le Buffer seguenti:
    1. Preparare tampone B (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM imidazolo, 6 M guanidina-HCl, pH 7.9). Aggiungere 5,844 g di NaCl, 0,6304 g di Tris-HCl, 0,0681 g di imidazolo e 114.64 g guanidina-HCl in un becher da 500 ml. Quindi aggiungere H 2 O fino a raggiungere 190 ml e regolare il pH a 7,9. Trasferire il solution ad un 250 ml cilindro graduato e aggiungere H 2 O fino a quando il volume è di 200 ml.
    2. Preparare Elution Buffer (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 0,5 M imidazolo, 6 M guanidina-HCl, pH 7.9). Aggiungere 5,844 g di NaCl, 0,6304 g di Tris-HCl, 6,808 g di imidazolo e 114.64 g guanidina-HCl a un becher da 500 ml. Aggiungere H 2 O fino a raggiungere 190 ml e regolare il pH a 7,9. Trasferire la soluzione in un 250 ml cilindro graduato e aggiungere H 2 O fino a quando il volume è di 200 ml.
    3. Preparare Striscia tampone (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, pH 7,9). Aggiungere 5,844 g di NaCl, 0,6304 g di Tris-HCl, 40 ml 500 mM EDTA ad un becher da 500 ml. Aggiungere H 2 O fino a raggiungere 190 mL e regolare il pH a 7,9. Trasferire la soluzione in un 250 ml cilindro graduato e aggiungere H 2 O fino a quando il volume è di 200 ml.
    4. Preparare carica tampone (0,1 M di nichel solfato). Aggiungere 5,257 g di nichel solfato ad un bicchiere da 500 ml ed aggiungere H 2 O, fino a raggiungere 190 ml (ATTENZIONE, non maneggiare nichelsolfato di fuori di una cappa aspirante fino al solfato di nichel è stato sciolto in H 2 O). Una volta che il solfato di nichel è dissolta, trasferire la soluzione in 250 ml cilindro graduato e aggiungere H 2 O fino a quando il volume raggiunge 200 ml.
  2. Split 10 ml di resina al nichel tra due provette coniche da 50 ml centrifuga capaci di resistere forze centrifughe oltre 4.500 xg (5 ml in ciascun tubo).
  3. Caricare ed equilibrare la resina al nichel:
    1. Lavare la resina con l'aggiunta di 40 ml di H 2 O per ogni provetta contenente resina. Posare i tubi in orizzontale su una sedia a dondolo e farli agitare per 5 minuti a 4 ° C. Una volta terminato, centrifugare le provette a 4.500 xg per 8 minuti a 4 ° C.
    2. Eliminare il surnatante pipettando per non disturbare il pellet. Aggiungere 40 ml di tampone di carica per ogni provetta. Trasferire i tubi su una sedia a dondolo e farli agitare per 15 minuti a 4 ° C. Una volta terminato, centrifugare le provette a 4.500 xg per 8 minuti a 4 ° C.
    3. Eliminare il surnatante poi aggiungere 40 ml di tampone B per i tubi. Trasferire i tubi su una sedia a dondolo e farli agitare per 5 minuti a 4 ° C. Una volta terminato, centrifugare le provette a 4.500 xg per 8 minuti a 4 ° C poi scarta il surnatante.
  4. Opzionale: Prendete 150 ml di proteina solubilizzato rilevati nella fase 2.11 e trasferirlo in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Etichettare il tubo come pre-incubazione e congelare questo a -20 ° C per una futura analisi della pagina SDS (Figura 3, Crude MOG tag).
  5. Purificare il tag MOG Proteine:
    1. Trasferire l'intero volume di proteine solubilizzato dal punto 2.11 (~ 40 ml, meno il piccolo campione rimosso al punto 3.4) per il primo tubo (Figura 2, il tubo 1) contenente resina nickel dal punto 3.3, mescolare e posizionare orizzontalmente su una sedia a dondolo a 4 ° C per 1 ora.
    2. Centrifugare la provetta a 4.500 xg per 8 minuti a 4 ° C. Una volta terminato, trasferire il surnatante al secondotubo (Figura 2, il tubo 2) di resina nichel e incubare come descritto nel passaggio precedente. Nel frattempo, continua con i passaggi da 3 a 6 di seguito con il tubo 1.
    3. Risospendere la resina nickel in tubo 1 in 40 ml di tampone di eluizione e posizionare il tubo orizzontalmente su un bilanciere a 4 ° C per 5 min. Poi, centrifugare la provetta a 4.500 xg per 8 minuti a 4 ° C.
    4. Trasferire il surnatante contenente eluito proteina tag MOG in un flacone da 250 ml con l'etichetta 'purificata tag MOG proteine' e mantenere questa bottiglia a 4 ° C. Ad ogni passo di eluizione, in comune il surnatante risultante in questa bottiglia.
    5. Aggiungere 40 ml di tampone striscia alla resina nichel e posizionare orizzontalmente su un bilanciere per 5 minuti a 4 ° C.
    6. Centrifugare la provetta a 4.500 xg per 8 minuti a 4 ° C. Eliminare il surnatante, quindi ricaricare la resina nichel come elencato nel passaggio 3.3.
    7. Una volta terminato, andare avanti con il secondo tubo come elencato nel passaggio 3.5. Un totale di 4 rotondas di assorbimento della proteina solubilizzata dal punto 2.11 sulla resina nickel carica e eluizione recupererà maggior parte della proteina, sebbene, se desiderato, proteina aggiuntiva potrebbe essere recuperato in ulteriori cicli di assorbimento e di eluizione.
  6. Dopo quattro (o più) cicli di assorbimento e eluizione sono completi, memorizzare la proteina purificata pool a 4 ° C durante la notte. resina Nichel può essere memorizzato in 40 ml di una soluzione di etanolo al 20% a 4 ° C fino al suo utilizzo nuovo.

4. misurazione della proteina Concentrazione

NOTA: Prima di procedere oltre è necessario quantificare la quantità di proteina purificata tag MOG generato nella sezione 3. Viene utilizzato questo valore per determinare il volume finale di concentrare la proteina alla fine del protocollo. Descriviamo un Bradford test standard di qui. La concentrazione di proteine tag MOG purificata è determinata confrontando l'assorbanza spettrale di serie diluted MOG etichetta proteica ad una curva standard di albumina sierica bovina (BSA) ad una concentrazione nota.

  1. Rendere 10x tampone acetato aggiungendo 23 ml di acido acetico glaciale a 8,2 g di sodio acetato in 3 L bicchiere e aggiungere 1,9 L di H 2 O per sciogliere l'acetato di sodio. Trasferire questa soluzione in un 2 L cilindro graduato e aggiungere H 2 O fino a quando il volume raggiunge 2 L. Poi conservarlo in una bottiglia 2 L a temperatura ambiente. Rendere 1 ml di tampone acetato 1x aggiungendo 100 ml di 10x tampone acetato a 900 ml di H 2 O.
  2. Impostare una piastra a 96 pozzetti per diluizioni con l'aggiunta di 30 ml di tampone acetato 1x a pozzi G2-8 e 60 ml di G9. Aggiungere 48 ml di tampone acetato 1x a H2 e H3.
  3. Impostare la diluizione in serie iniziale della serie BSA in fila G come segue: Aggiungere 216 ml di tampone acetato di 1x e 54 ml di disponibile in commercio 2 mg di serie / ml di BSA in ben G1 e mescolare accuratamente. Aggiungere 210 ml da ben G1 a ben G2, mescolare accuratamente,e quindi aggiungere 180 ml di ben G2 per bene G3. Aggiungere 150 ml di ben G3 a G4 bene, mescolare accuratamente, e continuare questo trend di aggiungere 30 ml meno a ogni successivo e fino a ben G8. (Vedi Tabella 1 per le liste di fattori di diluizione equivalenti).
  4. Impostare campioni triplicato di ciascuna diluizione trasferendo 10 ml di ben G1 nei pozzetti A1, B1 e C1, e 10 ml di ben G2 per pozzi A2, B2, C2 e, e così via. Utilizzare una pipetta multicanale.
  5. Per impostare diluizioni di tag MOG, aggiungere 60 ml di proteine tag MOG purificata dal passaggio 3,6 a ben H1. Aggiungere 12 ml di ben H1 a H2 bene, mescolare accuratamente, quindi aggiungere 12 ml di ben H2 a H3 bene, mescolare accuratamente (questo produce una diluizione 1x nel 1 ° semestre, 1/5 di diluizione in H2 e H3 1/25 diluizione) .
  6. Impostare campioni triplicato per le diluizioni tag MOG trasferendo 10 ml di pozzi H1-H3 alle righe D, E e F, come descritto al punto 4.4.
  7. Mescolare 2 ml di colorante dosaggio proteineConcentrato reagente con 8 ml di H 2 O. Aggiungere 200 pl di questa miscela a tutti i pozzetti precaricati in righe A, B, C, D, E, e F, con una pipetta multicanale, se disponibile. Pop eventuali bolle nei pozzetti usando un ago prima di leggere la concentrazione di proteine.
  8. Entro 10 minuti di aggiunta del reagente colorante, misurare l'assorbanza 595 nm di tutti i pozzetti in righe A, B, C, D, E e F.
  9. Utilizzare righe A, B, e C per impostare una curva standard in cui le posizioni 1-9 corrispondono a 0,4, 0,35, 0,3, 0,25, 0,2, 0,15, 0,1, 0,05 e 0 mg / ml di BSA. Sulla base di questa curva, calcolare la concentrazione di proteine tag MOG utilizzando la diluizione del tag MOG che meglio si adatta alla curva standard. Solitamente, ci saranno 200 a 250 mg di proteina tag MOG da 1 L di coltura batterica utilizzando il protocollo qui descritto.
    NOTA: per rendere MOG 1-125 procedere da qui alla sezione facoltativa 7 elencati alla fine del protocollo. In caso contrario, continuare con la sezione 5.

5. Dialisi

NOTA: dialisi viene eseguita per rimuovere gradualmente guanidina dalla soluzione contenente purificata, tag denaturato MOG per consentire la proteina a ripiegare. Si deve prestare attenzione durante questa fase come MOG è molto insolubile, e mentre questo è migliorata dalla presenza del tag tioredossina, è ancora incline a venire dalla soluzione. Pertanto, ripiegando dovrebbe essere eseguita gradualmente e ad una concentrazione relativamente bassa tag MOG.

  1. Prima di iniziare la dialisi, diluire la proteina tag MOG purificata con tampone B (tampone B può essere fatto come elencato nel passaggio 3.1) finché la concentrazione è di 0,5 mg / ml o meno, in base alla quantità di tag MOG calcolato nella sezione 4.
  2. Tagliare circa 30 cm di snakeskin tubo di dialisi e fissare una estremità con una pinza emostatica bloccaggio piegando la fine della pelle di serpente oltre tre volte e bloccaggio alla fine piegato con la pinza emostatica. Riempire il serpente con diluitoTag MOG proteine (tra 60 e 90 ml di MOG tag proteine per provetta) quindi rimuovere le bolle d'aria dalla pelle di serpente da costringendoli fuori dalla estremità aperta. Infine, sigillare l'altra estremità del tubo con una seconda pinza emostatica bloccaggio.
  3. Ripetere il passaggio 5.2 per riempire sezioni aggiuntive di tubo di dialisi fino a quando tutte le proteine tag MOG è stato trasferito in tubi di pelle di serpente di dialisi. Assicurarsi che non vi siano perdite.
  4. Fare acetato 1x con 4 M guanidina pesando 382,12 g di guanidina-HCl e l'aggiunta di 100 ml di 10x tampone acetato fatte nella fase 4.1 a 2 L bicchiere. Aggiungere 0,5 L di H 2 O nel becher e consentire la guanidina-HCl sciogliere. Una volta disciolto, trasferire la soluzione in un 1 L cilindro graduato e aggiungere H 2 O fino a quando il volume raggiunge 1 L. Ripetere questa ricetta per ogni 2 pelli di serpente necessari.
  5. Eseguire la dialisi come segue: riempire un secchio di grandi dimensioni (minimo 10 L) con 1 L di tampone acetato 1x con 4 M guanidina dal punto 5.4. Mettere su to 2 sezioni di tubo di dialisi contenenti tag MOG nel secchio, lasciando spazio ad un ancoretta magnetica a girare senza ostacoli sul fondo. Mettere il secchio in una camera a 4 ° C su una piastra di agitazione magnetica e accenderlo per una velocità di rotazione lenta (cioè non elevata, quanto basta per spostare il fluido):
    NOTA: eseguire le seguenti operazioni per ridurre gradualmente la quantità di guanidina nel buffer. Mescolare volte sono dati come minimi, ma possono essere lasciati durante la notte. Dialisi avrà un minimo di 3 giorni, ma questo può essere esteso se lo si desidera. Controllare regolarmente per assicurarsi che il tubo sia intatto e che le estremità sono chiusi in modo sicuro.
    1. Lasciate che il secchio sedersi e mescolare per 4-5 ore.
    2. Aggiungere 1 L di tampone acetato 1x (100 ml 10x tampone acetato e 900 ml di H 2 O) per ciascun segmento.
    3. Ripetere i punti 5.5.1 e 5.5.2 un totale di 3 volte per un totale di 4 L di tampone nel secchio.
    4. Eliminare la metà del buffer nel secchio e riempire con 1 L di tampone acetato 1x (100 ml 10x tampone acetato e 900 ml di H 2 O, senza guanidina) e impostare la barra di tubo e mescolare.
    5. Ripetere i punti 5.5.1 e 5.5.2, una volta (cioè fino a quando c'è un totale di 4 L di tampone nel secchio).
    6. Infine, sostituire l'intero volume 4 L nel secchio con 4 L di tampone 1x acetato di fresco e lasciare mescolare per 4-5 ore. Per ottenere i migliori risultati, fare questo passo il giorno della concentrazione proteica.
    7. Rimuovere con attenzione il tubo di dialisi con tag MOG ripiegata e scartare tampone secchio.

6. Concentrare MOG tag proteine

NOTA: Nella fase finale, ripiegata proteina tag MOG è concentrata per la diluizione di lavoro per la conservazione. Come tag MOG è molto insolubile, non deve superare i 5 mg / ml. Questa concentrazione è approssimativamente equimolare con 0,4 mg / ml MOG 35-55 peptide, che è comunemente usato per indurre EAE nei topi (misti 1: 1 con assoluta adjuv di Freundformica (CFA)). Durante il processo di concentrazione non è raro che una piccola quantità di proteine ​​per uscire soluzione sotto forma di precipitato bianco. la precipitazione eccessiva è un problema, però.

  1. Calcolare il volume finale desiderato per ottenere una concentrazione variabile MOG 5 mg / ml, sulla base del valore calcolato nella sezione 4.
  2. Linea un tegame con un foglio di alluminio e coprire il foglio di alluminio con polietilenglicole (PEG) 3350 e PEG 8000 in un rapporto 1: 1. Il PEG 3350 è incorporato in questa miscela in quanto può aiutare a prevenire l'aggregazione delle proteine durante la concentrazione ed è un efficace cyropreservative 11.
  3. Mettere il tubo di serpente (con MOG tag proteine all'interno) sulla parte superiore del foglio di alluminio e coprire con PEG 8000. Che questa riposare a temperatura ambiente e verificare la quantità regolarmente finché il volume è uguale o inferiore al volume finale stimato (calcolato al passo 6.1), il volume effettivo sarà misurato nel passaggio successivo. Se la pentola diventatroppo saturi con acqua durante il processo di concentrazione, impostare una padella fresco con un foglio di alluminio e PEG 3350 e PEG 8000.
  4. Lavare l'esterno delle pelli di serpente con H 2 O e trasferire la proteina tag MOG ad una bottiglia di vetro separata con una pipetta sierologica. Tenere traccia del volume come la proteina viene trasferita per garantire il volume sia corretto.
    1. Se il volume è stato ridotto al di sotto del volume finale stimato, aggiungere 1x tampone acetato fino a raggiungere il volume desiderato. Se il volume è superiore al volume finale stimato, trasferire la proteina tag MOG indietro nel tubo di dialisi e continuare la concentrazione (passi 6,2-6,3).
    2. Distribuire la proteina tag MOG tra provette da 1,5 ml (0,5 ml per provetta), conservare le provette a -80 ° C fino al momento dell'uso. Per indurre EAE, mescolare questo volume 1: 1 con il CFA.
  5. Eseguire un gel SDS PAGE per confermare l'espressione della proteina tag MOG utilizzando i campioni prelevati nei passaggi 1.4, 2.1, 3.4, e la proteina MOG purificata dal punto 6.4.

7. Generazione MOG 1-125 da tag MOG Utilizzando TEV proteasi (opzionale)

NOTA: Questa operazione facoltativa continua a partire dalla fine del punto 4. Se è necessaria MOG 1-125 senza sequenze di tag in più, le sequenze di tag possono essere rimossi con TEV proteasi (Figura 4). Per quanto a nostra conoscenza, non c'è nessun altro sistema di espressione in grado di generare puro MOG 1-125. Tuttavia, va notato che senza il tag tioredossina, MOG 1-125 è altamente insolubile e questo può causare problemi durante la purificazione e la manipolazione, e per questo rimuovere il tag se assolutamente necessario per motivi sperimentali. Sono necessari diversi passaggi per generare puro MOG 1-125. Tag MOG viene prima dializzata in TEV buffer di proteasi scissione. Dopo digestione con proteasi TEV, il volume viene ridotto per aiutare con la purificazione dopo steps, poi dializzati in tampone B, e poi il His-tag contenenti sequenza di tag viene rimosso con resina nichel. Infine, la proteina viene quantificata e pura MOG 1-125 viene concentrata a concentrazione finale.

  1. Rendere 1 L di 10x tampone di scissione TEV (500 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA) aggiungendo 1.861 g di EDTA, 44,4 g Tris-HCl, e 26,5 g Tris a 2 L becher. Aggiungere H 2 O fino a quando il volume raggiunge 990 ml quindi regolare il pH a 8 per sciogliere l'EDTA. Trasferire la soluzione ad un 1 L cilindro graduato e portare il volume fino a 1 L con H 2 O.
  2. Diluire proteine tag MOG dalla fase 3.6 a 0.5 mg / ml utilizzando tampone B (stesso tampone descritto al punto 3.1), in base alla quantità di proteine calcolato nella sezione 4. Trasferire 120 ml di proteina tag MOG diluito a snakeskin tubo di dialisi come descritto in passi 5.2 a 5.3. Il volume può essere scalata fino tuttavia la quantità di TEV proteasi richiesto per fendere tutte le proteine tag MOG sarà SOSTANZEntial.
  3. Seguire il protocollo di dialisi elencati al punto 5.5, ad eccezione di sostituire il tampone 10x di acetato con buffer di scissione 10x TEV fatto in fase 7.1.
  4. Trasferire il tag MOG, adesso TEV buffer di scissione, in un flacone di vetro da 250 ml e monitorare l'aumento del volume della dialisi. Aggiungere 1 ml di β-mercapto-etanolo per ogni 2,85 ml di MOG tag proteine aggiunte alla bottiglia. Aggiungere almeno 1 mg di TEV proteasi (soluzione TEV a 5 mg / ml) per ogni 50 mg di proteina tag MOG (TEV proteasi può essere aggiunto fino a 1:10 TEV: rapporto proteine MOG) ed incubare a temperatura ambiente, riparo dalla luce per almeno 72 ore.
    NOTA: Al termine dell'incubazione proteasi TEV, precipitati bianchi dovrebbero essere visti nella parte inferiore della bottiglia di vetro.
  5. Prima di trasferire la proteina tubo di dialisi, aggiungere guanidina-HCl alla soluzione fino a quando le proteine ​​sciogliere per impedire la proteina precipita di attaccarsi alla bottiglia di vetro. Trasferire 150 ml diquesta soluzione in una provetta da 1,5 ml ed etichetta tubo come "MOG con TEV". Conservare la soluzione a -20 ° C per future analisi SDS-PAGE.
  6. Trasferire tutto il fluido dal passaggio 7,5 nel tubo di dialisi come elencato in passi 5.2 a 5.3. Riempire un secchio con 2 L di H 2 O e porre il tubo di dialisi nel secchio. Incubare questo a 4 ° C con luce agitazione per una notte. Questo passaggio è importante per diluire la guanidina per consentire la concentrazione proteica avvenga rapidamente e di iniziare a rimuovere l'EDTA dalla soluzione che interferirà con la purificazione della proteina.
  7. Concentrare la proteina nel tubo di dialisi come elencato in passi 6.2 al 6.3 (tranne usare solo PEG 8000) tale che il volume finale della soluzione è ~ 40 ml. Lavare il tubo di dialisi con H 2 O e rimuovere qualsiasi residuo di PEG 8000 ancora attaccato al tubo. Questa riduzione del volume permette di montare tutte le proteine ​​digerito in una provetta da 50 ml contenente nichel reil peccato, come descritto al punto 3.5.
  8. Dializzare Protein digerito a tampone B:
    1. Riempire un grande secchio con 1 L di tampone B (29,22 g di NaCl, 3.152 g Tris-HCl, 0,3405 g Imidazole, 573,18 g di guanidina-HCl, pH 7,9).
    2. Posizionare le pelli di serpente contenenti proteine ​​digerite dal punto 7.7 nel secchio insieme con un magnete stir (come descritto in maggior dettaglio nel passo 5.5). Mettere il secchio in un 4 ° C stanza fredda su un piatto mescolare impostato scalpore lento e permettono le pelli di serpente per Dializzare per 5 o più ore.
    3. Svuotare il secchio e riempirlo con un altro 1 L di tampone B e lasciare che questo sedersi nella stanza fredda C 4 ° su un piatto mescolare impostato scalpore lenta e consentire le pelli di serpente per Dializzare per 5 o più ore.
  9. Eseguire purificazione della proteina 1-125 MOG come descritto nella sezione 3, con l'importante differenza che le sequenze di tag clivati saranno vincolati dalla resina al nichel, lasciando MOG 1-125 in soluzione. Anche in questo caso, 4 giri di purificazione sarannoeseguita nello stesso volume, ma in questo caso l'obiettivo è quello di migliorare la purezza, piuttosto che di recuperare il più possibile proteine. Vedere la Figura 4.
    1. Rendere i buffer di purificazione di proteine ​​di cui al punto 3.1
    2. Caricare entrambi i tubi di resina al nichel come descritto al punto 3.3.
    3. Purificare MOG 1-125 dal protocollo in dettaglio nel passo 3.5, con l'eccezione essenziale che l'eluato dalla resina di nichel contenente tag viene scartato (tenere 150 ml di eluato in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga per future analisi SDS-PAGE), mentre la soluzione contenente MOG 1-125 viene mantenuta come prodotto finale.
  10. Misurare la concentrazione di MOG 1-125 proteine come descritto nella Sezione 4:
    1. Impostare le diluizioni curva standard BSA come descritto ai punti 4.2 e 4.4.
    2. Impostare le diluizioni del MOG 1-125 come descritto ai punti 4.5 e 4.6. In alternativa, può essere utile per generare un intervallo maggioredi diluizioni (1x, 1/2, 1/4, e 1/8, per esempio). Regolare volumi di tampone acetato di 1x e MOG 1-125 conseguenza.
    3. Eseguire la Bradford test come descritto nei punti 4,7-4,9 e calcolare la quantità di MOG 1-125 generato. Il rendimento atteso è di circa 4 mg o più proteine.
  11. Ripiegare MOG 1-125 da un graduale rimozione di guanidina tramite dialisi, come descritto nella sezione 5.
  12. Concentrato MOG 1-125 proteine come descritto nel paragrafo 6. La concentrazione finale dovrebbe essere 2,24 mg / ml, che è equimolare di 5 mg tag / mL MOG.

8. SDS-PAGE gel di Conferma MOG tag Produzione e Purezza

NOTA: I campioni prelevati da piazza di 1.4, 2.1, 3.4, e 6.4 vengono analizzati dalla norma SDS-PAGE per confermare la produzione di tag MOG e purezza. Questa operazione deve essere eseguita dopo la purificazione finale di una tag MOG o MOG 1-125.

  1. Fare una tampone di caricamento 2x SDS-PAGE aggiungendo 1,576 g di Tris-HCl a 2 ml di H 2 O e impostare il pH a 6,8. Aggiungere 0,4 g SDS nella soluzione Tris-HCl e quindi aggiungere H 2 O fino a quando il volume raggiunge 7 ml.
  2. Aggiungere 0,2 g di blu di bromofenolo a 10 ml di H 2 O quindi aggiungere 1 ml di questa alla soluzione fatta nel passaggio 8.1. Infine, aggiungere 2 ml di glicerolo per finire il tampone di caricamento 2x SDS-PAGE. Quando si conserva questa soluzione, mantenere a 4 ° C e proteggerlo dalla luce per un massimo di 3 mesi.
  3. Scongelare le aliquote congelate di batteri dai passi 1.4 e 2.1, nonché il solubilizzato MOG tag proteina da passi 3.4 e 6.4 a temperatura ambiente.
  4. Rimuovere i sali dalle soluzioni raccolti in passi 3.4 e 6.4 con l'aggiunta di 60 ml di ogni proteina alle colonne dissalazione. Purificare le proteine ​​seguenti istruzioni del produttore.
  5. Aggiungere 20 ml di β-mercapto-etanolo per 1 ml di soluzione fatta nel passaggio 8.2. Aggiungere 40 ml di questo ai due bacriale pellet dal punto 8.3 e 60 ml di proteine ​​dissalate dal punto 8.4 e incubare questi a 95 ° C per 10 min.
  6. Fare 1x tampone esecuzione pagina SDS pesando 5 g di Tris, 28,8 g glicina, e 1 g di SDS. Aggiungere questi ad un 1 L becher da 500 ml H 2 O per sciogliere tutto. Una volta disciolto, trasferire la soluzione in un 1 L cilindro graduato e riempire con H 2 O fino a quando il volume raggiunge 1 L.
  7. Impostare un gel di poliacrilammide al 12% in un apparato gel quindi aggiungere il tampone di corsa SDS-PAGE 1x all'apparato gel tale che il tampone di corsa è appena sopra la parte superiore dei pozzetti nel gel. Lavare i pozzetti del gel pipettando 50 ml di tampone di corsa nei pozzetti cinque volte ciascuno.
  8. Carico 10 ml di scala delle proteine ​​nel primo pozzo e aggiungere 10 ml di soluzioni bollito dal punto 8.5 pozzetti. Attivare il gel a 115 V per 60 min.
  9. Rimuovere il gel dall'apparecchio e trasferirlo ad un piccolo contenitore. Riempire la container con 100 ml di puro H 2 O e trasferire il contenitore per una piattaforma rotante lentamente per 8 min. Dopo l'8 min, scaricare l'acqua e lavare il gel altre due volte con H 2 O.
  10. Cassone H 2 O dal contenitore e aggiungere 100 ml di rapido reattivo macchia al contenitore. Lasciare questo a sedersi su una piattaforma rotante lentamente durante la notte, coprire con un foglio di alluminio.
  11. Dump il reagente macchia rapida e aggiungere circa 100 ml di H 2 O al contenitore. Lasciare questo a sedersi su una piattaforma rotante per 8 min. Cassone H 2 O e ripetere il lavaggio H 2 O due volte.
  12. Immagine il gel utilizzando un imager per le macchie blu Coomassie. Cercare una fascia intorno 31.86 kDa (proteina tag MOG) e una banda debole a 63.72 kDa (MOG tag dimeri).

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Risultati

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Dopo la purificazione è completo, i campioni raccolti in passi 1.4, 2.1, 3.4, e il prodotto finale dal punto 6.4 devono essere eseguiti su un gel proteico (Figura 3A). Tag MOG deve prima apparire come un kDa banda 31.86 nel campione T O / N, ma non t 0, e dovrebbe essere l'unica band nel prodotto puro finale. Per verificare se la proteina tag MOG ha correttamente piegato, la proteina tag MOG può essere usato per etic...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, abbiamo descritto un protocollo per la produzione di MOG etichetta proteica e come generare puro MOG 1-125 dalla proteina tag MOG. Questo protocollo si basa sia sulla base metodi di purificazione delle proteine standard di His-tag, così come un protocollo precedentemente descritto per la generazione di una proteina MOG-based anziani 15. Anche se non è qui descritta, l'utilizzo primaria della proteina tag MOG è indurre EAE attraverso l'immunizzazione con...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione della Multiple Sclerosis Society of Canada. RWJ ha ricevuto il premio per la borsa di studio di dottorato della Waugh Family MS Society of Canada.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
BL21 E. coli- pet32-MOGtagKerfoot labQuesti batteri sono necessari per produrre la proteina MOGtag. Le scorte di glicerolo di questi batteri sono disponibili su richiesta.
LB brodo mugnaioBioshopLBL407.1
Ampicillinabio basicAB0028Ricostituire la polvere in 50% etanolo/ 50% H2O a 100 mg/ml. Conservare a -20 °C.
IPTGBioshopIPT002.5Ricostituire la polvere in H2O a 1M e conservare a -20 °C.
Lisozima uovo di gallinaBioshopLYS702.10Ricostituire in H2O a 50 mg/ml e conservare a -80 °C.
Triton-X100SigmaT-8532
Tecnologie per la vitasalina tamponata con fosfato20012-027Non è richiesta soluzione salina tamponata con fosfato commerciale, è sufficiente qualsiasi soluzione salina tamponata con fosfato standard prodotta in laboratorio.
Cloruro di sodioBioshopSOD004.1
Tris-HClBioshopTRS002.1
ImidazoleBioshopIMD508.100
Guanidina-HClSigmaG3272La qualità deve essere superiore al 98% di purezza.
0,5 M EDTAbioshopEDT111.500
Solfato di nichel (II)BioshopNIC700.500
La sua resina leganteEMD Millipore69670-3Conservare in etanolo al 20% 80% H2O a 4 gradi; C
Etanolo anidroAlcoli commercialiP016EAANDiluire con acqua secondo necessità.
Acido acetico glacialeBioshopACE222.1
Acetato di sodio triidratoBioshopSAA305.500
albumina sierica bovina standardbio-rad500-0206
Bio-rad test proteico reagente concentratobio-rad500-0006
Acido etilendiammina tetraacetico, sale disodico diidratoFisher scientificBP120-500
Tris-baseBioshopTRS001.1
7000 MW Tubo per dialisi in pelle di serpenteThermoscientific68700
2-mercaptoetanoloSigmaM3148-25mlQuesto reagente non deve essere maneggiato al di fuori di una cappa aspirante.
AcTEV proteaselifetechnologies12575-015La produzione della propria proteasi TEV può essere realizzata utilizzando (https://www.addgene.org/8827/) e purificata come nel riferimento 17
Polietilenglicole 3350BioshopPEG335.1
Polietilenglicole 8000BioshopPEG800.1
Nunc MaxiSorp fondo piatto 96 pozzettipiastra ebioscience44-2404-21
SonicatoreFisher scientificFB-120-110
Spettrometro per micropiastre EonBiotek11-120-611Questa apparecchiatura utilizza il software di analisi dei dati Gen5.
Software di analisi dati Gen5BioTek
sodio dodecil solfatoBioshopSDS001
blu bromofenoloBioshopBRO777
GliceroloBioshopGLY001
Colonne di desalinizzazione delle proteineTermoscientifico89849
GlicinaBioshopGLN001
gel prefabbricato di poliacrilammide al 12%bio-rad456-1045
Reagente colorante rapidoEMD Millipore553215
Gel dock EZ imagerbio-rad1708270
Vassoio per campioni a luce biancabio-rad1708272 Utilizzato insieme all'imager EZ per gel dock per macchie blu coomassie
Scala portaproteinebio-rad1610375

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  5. Dang, A. K., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. B cell recognition of myelin oligodendrocyte glycoprotein autoantigen depends on immunization with protein rather than short peptide, while B cell invasion of the CNS in autoimmunity does not. J Neuroimmunol. 278, 73-84 (2015).
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