Diffusione molecolare nel plasma membrane dei linfociti primari misurati da Fluorescence Correlation Spectroscopy

Sommario

Viene descritto un metodo per misurare la diffusione delle proteine nelle membrane delle cellule immunitarie primarie utilizzando la spettroscopia di correlazione della fluorescenza (FCS). In questo articolo viene illustrato l'uso di anticorpi per la marcatura fluorescente.

Abstract

correlazione spettroscopia di fluorescenza (FCS) è una tecnica potente per studiare la diffusione delle molecole all'interno delle membrane biologiche con elevata risoluzione spaziale e temporale. FCS può quantificare la concentrazione e diffusione molecolare coefficiente di molecole marcate fluorescenza nella membrana cellulare. Questa tecnica ha la capacità di esplorare le caratteristiche di diffusione molecolare delle molecole nella membrana plasmatica di cellule immunitarie in stato stazionario (cioè, senza processi che influenzano il risultato durante il tempo di misurazione effettiva). FCS è adatto per studiare la diffusione di proteine ​​che vengono espresse a livelli tipici per proteine ​​più endogene. Qui, un metodo semplice e robusto per determinare la velocità di diffusione delle proteine ​​di membrana cellulare sui linfociti primari è dimostrata. Un modo efficace per eseguire misure su cellule vive colorate con anticorpo e osservazioni comuni che si verificano dopo l'acquisizione sono descritti. I progressi recentinello sviluppo di coloranti fluorescenti fotostabili può essere utilizzato coniugando anticorpi di interesse appropriarsi coloranti che non candeggiare ampiamente durante le misurazioni. Inoltre, questo permette la rilevazione di entità diffondenti lentamente, che è una caratteristica comune di proteine ​​espresse nelle membrane cellulari. La procedura di analisi per estrarre i parametri di concentrazione e di diffusione molecolare dalle curve di autocorrelazione generate viene evidenziato. In sintesi, viene fornito un protocollo di base per misurazioni FCS; può essere seguito da immunologi con una comprensione della microscopia confocale ma nessun'altra esperienza precedente di tecniche per la misurazione di parametri dinamici, come i tassi di diffusione molecolare.

Introduzione

Molte funzioni cellule immunitarie si affidano a diffusione molecolare e interazioni all'interno delle membrane. Membrane biologiche sono complesse, e molti fattori che possono essere importanti per la funzione delle cellule immunitarie possono influenzare la velocità di diffusione traslazionale delle proteine all'interno delle membrane cellulari ^1. Abbiamo recentemente dimostrato che le cellule natural killer (NK), i linfociti appartenenti al sistema immunitario innato, mostrano la diffusione differenziale delle due proteine studiate a livello della membrana cellulare a seconda dello stato di attivazione delle cellule NK

Protocollo

1. La colorazione per FCS

1. Isolare le cellule NK murine da linfociti di milza con etichettatura tallone magnetico, come da protocollo ¹⁶ del produttore. Utilizzare 2-3 x 10 ⁵ cellule per esempio per le seguenti operazioni.
   NOTA: Utilizzare la selezione negativa per arricchire la popolazione di cellule bersaglio, lasciando intatta, in modo che le cellule possono essere etichettati con anticorpi primari sola. Vedi di riferimento ² per informazioni più dettagliate su isolamento delle cellule da topi ^2.
2. Per le cellule murine esprimono recettori Fc, bloccare i recet....

Risultati

Un tipico risultato genera una curva di autocorrelazione con un tempo di transito nella gamma da 10 msec a 400 msec per le proteine ​​di membrana. Il numero di molecole può variare tra 0,5 e circa 200 per micron ² per proteine endogenamente espressi. Controllare attentamente che il CPM non è inferiore al previsto. Questo può significare che vi è una influenza del segnale di fondo. Come regola generale, il segnale CPM sulle cellule che viene accettato per analisi non deve esser.......

Discussione

Questo protocollo per FCS può essere utilizzato per la valutazione delle dinamiche molecolari di molecole di superficie su tutti i tipi di cellule immunitarie (murina, umana, o altre specie). Misure FCS spazio-temporali dinamica molecolare fino a risoluzione di una singola molecola in cellule vive. La densità molecolare, nonché le dinamiche dei tassi di diffusione e di clustering delle proteine ​​di interesse, possono essere estratte dalle curve di autocorrelazione.

L'etichettatura fluor.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Kit di isolamento cellulare MACS NK mouse II	Miltenyi Biotec NordenAB	130-096-892	Selezione negativa di cellule NK
Fetale Siero bovino	Sigma-Adlrich	F7524	inattivato a caldo
	-		Prodotto in casa
Roswell Park Memorial Institute medio 1640	PAA La società di colture cellulari	E15-848	Clone di
anticorpo medio trasparente 2.4G2	Thermo Fischer Scientific	553140	Per il blocco dei recettori Fc.
Anticorpo anti-Ly49A			Anticorpo monoclonale prodotto in casa e coniugato in casa ad Alexa fluor 647
Clone JR9.318
Anticorpo H-2Dd.	BD Pharmingen	558915	coniugato internamente al clone MFP488
34.5.8S
MFP488	Mobiotech	MFP-A2181	Colorante fluorescente per la coniugazione di anticorpi.
Poli-L-Lisina	Sigma-Aldrich	P8920	Diluita in acqua distillata (1,10)
Poli-L-Lisina (20 kDa) innestata con polietilenglicole (2 kDa)	SuSoS AG	PLL(20)-g[3,5]-PEG(2)Diluita	in PBS (pH 7,4) a 0,5 mg/ml.
Cloruro di rodamina 110	Sigma-Aldrich	432202	Coefficiente di diffusione noto: 3,3 &volte; 10− 10 m2/sec 19
Alexa fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A20006	Coefficiente di diffusione noto: 4,4 &volte; 10− 10 m2/sec 20
Microscopio confocale	Zeiss	LSM510
Software: Confocor 3	Zeiss
Software: Matlab con toolbox per il montaggio a curva	Matlab	Versione R2013b
Nunc Lab-Tek Coverglass a camera	Termo-scientifico	155411	8 pozzetti, fondo in borosilicato 1.0