Il virus Zika (ZIKV), un patogeno emergente, è collegato ad anomalie dello sviluppo fetale e microcefalia. La creazione di un efficace sistema di coltura cellulare infettiva è fondamentale per gli studi sulla replicazione di ZIKV e per lo sviluppo di vaccini e farmaci. In questo studio, vengono illustrati e discussi vari saggi virologici relativi alla ZIKV.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Zika Virus System infettiva coltura cellulare e la
In questo articolo
Sommario
Abstract
Zika Virus (ZIKV) è un patogeno emergente che è collegato a anomalie dello sviluppo fetale, come la microcefalia, difetti dell'occhio, e la crescita compromessa. ZIKV è un virus a RNA della famiglia Flaviviridae. ZIKV è trasmesso principalmente dalle zanzare, ma può anche essere diffuso da materna a trasmissione verticale del feto, così come il contatto sessuale. Fino ad oggi, non ci sono trattamenti o vaccini opzioni affidabili per proteggere quelli infettati dal virus. Lo sviluppo di un sistema di coltura cellulare riproducibile, efficace virus Zika infettiva è critico per studiare i meccanismi molecolari di replicazione ZIKV così come farmaci e vaccini sviluppo. A questo proposito, un protocollo che descrive una in vitro Zika sistema di coltura di cellule di mammifero basata virus per virale analisi produzione e la crescita è riportata qui. Dettagli sulla formazione di placche da virus Zika su un monostrato di cellule e saggio di placca per misurare titolo virale sono presentati. cinetica replica genoma viralee doppio filamento di RNA genomici intermedi replicatory sono determinati. Questa piattaforma coltura è stata utilizzata per lo schermo da una libreria di un piccolo gruppo di citochine conseguente identificazione di interferone-α (IFN-α), IFN-β e IFN-γ come inibitori potenti del Zika crescita virale. In sintesi, un infettiva sistema di coltura in vitro Zika virale e vari saggi virologici sono dimostrati in questo studio, che ha il potenziale per beneficiare notevolmente la comunità di ricerca nel chiarire ulteriormente i meccanismi di patogenesi virale e l'evoluzione della virulenza del virus. Antivirale IFN-alfa può essere ulteriormente valutata come un profilattico, profilattico post-esposizione, e opzione di trattamento per le infezioni da virus Zika in popolazioni ad alto rischio, comprese le donne in gravidanza infettate.
Introduzione
Zika Virus (ZIKV) è un importante patogeno umano associato con microcefalia e poveri gravidanza esiti 1,4. ZIKV appartiene alla serie di flavivirus clinicamente rilevanti che possono causare difetti neurologici, come la dengue, West Nile, e virus encefalite di St. Louis. La modalità principale di trasmissione virale è dal vettore zanzara Aedes aegypti, e, inoltre, la trasmissione sessuale è stata riportata anche 5,6. ZIKV è diventata un importante problema di salute globale a causa della espansione della distribuzione geografica della zanzara vettore e la sua forte correlazione con difetti alla nascita. ZIKV è stato isolato nel 1947 da ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Nota: Un profilo schematico del flusso di lavoro è presentato in Figura 1.
1. cellule
- Utilizzare cellule Vero per la produzione di virus Zika e l'analisi del ciclo di replicazione virale.
- Preparare mezzi completi crescita contenente 10% di siero fetale bovino (FBS), 2 mM L-glutammina, penicillina (100 unità / ml), streptomicina (100 unità / ml), e 10 mM HEPES.
- Cellule Vero coltura con terreno di coltura completo specificato a 37 ° C con 5% di CO 2.
2. Zika Virus Produzione
- Raccogliere le cellule Vero a densità cellulare 80% con 0,2....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Un ceppo virale Zika (PRVABC59; GenBank numero di accesso KU501215) del genotipo asiatico è stato utilizzato in questo studio 12. Cellule Vero a 80% di confluenza sono stati usati per indagare de novo Zika infezione virale. Per la produzione virale e la successiva caratterizzazione virologica, un passaggio precoce del virus (P3) Zika è stato impiegato. Sono state rilevate le placche virali il secondo giorno di infezione. Zika progenie virali rilasciate dalla cellula i.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Qui, un protocollo semplificato per la coltura dei virus Zika in vitro è presentato. Passaggi critici tra cui, individuando punti finali ottimali per espandere la cultura del virus, la misurazione titolo, e quantificare replicazione del genoma sono stati forniti. virus Zika è un patogeno umano, così, durante la manipolazione di agenti infettivi, le procedure di biosicurezza devono essere seguite scrupolosamente. Una linea cellulare di rene di scimmia, Vero, è stato utilizzato per dimostrare vari saggi virologic.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare il Dr. Aaron Brault e il Dr. Brandy Russell dei Centers for Disease Control and Prevention (CDC), USA per aver fornito PRVABC59 del ceppo virale Zika. Ringraziamo Nicholas Ten dell'Università di Yale per il copy-editing di questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dal Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award a V.A.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Dulbecco' s Eagle modificato' (DMEM) | Sigma Life Science | D5796 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| 2,5% di tripsina, 10x [-] Fenolo rosso | Corning | 25-054-C1 | |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Life Technologies | T10282 | |
| Contessa - ndash; Contatore di cellule automatizzato | ThermoFisher Scientific | C10227 | |
| Countess-cell countess vetrini della camera | ThermoFisher Scientific | C10283 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| monoclonale di topo anti-dsRNA anticorpo J2 | Italiano & Consulenza Scientifica Kft. | ||
| capra anti-coniglio IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
| SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX | Life Technologies | 11744500 | |
| QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System | Thermo Fischer | 4471088 | |
| senza RNasi DNase | Promega | M6101 | |
| Vero Cell Line | ATCC | CCL-81 | |
| Ceppo virale Zika PRVABC59 | Centri per il controllo e la prevenzione delle malattie (CDC) | ||
| IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| IL-1 alfa | Peprotech | 200-01A | |
| TNF-alfa | Peprotech | 300-01A | |
| Interferone alfa A | R & D Systems | 11100-1 | |
| Interferone beta | Peprotech | 300-02BC | |
| Interferone gamma | Peprotech | 300-02 | |
| Centrifuga 5415R | Eppendorf | 5415R | |
| Centrifuga 5810R | Eppendorf | 5810R | |
| Nikon Eclipse Ti Microscopio a immunofluorescenza con Nikon Intenselight C-HGFI | Nikon | Visita Nikon su richiesta |
Riferimenti
- Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report. N Engl J Med. , 1-11 (2016).
- Lucey, D. R., Gostin, L. O. The Emerging Zika Pandemic: Enhancing Preparedness. JAMA. 315 (9), 865-866 (2016).
- Mlakar, J., et al.....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
