Articolo metodologico

Zika Virus System infettiva coltura cellulare e la

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DOI:

10.3791/54767

⸱

23 agosto 2016

 , 
1Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Surgery, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

In questo articolo

Sommario

Il virus Zika (ZIKV), un patogeno emergente, è collegato ad anomalie dello sviluppo fetale e microcefalia. La creazione di un efficace sistema di coltura cellulare infettiva è fondamentale per gli studi sulla replicazione di ZIKV e per lo sviluppo di vaccini e farmaci. In questo studio, vengono illustrati e discussi vari saggi virologici relativi alla ZIKV.

Abstract

Zika Virus (ZIKV) è un patogeno emergente che è collegato a anomalie dello sviluppo fetale, come la microcefalia, difetti dell'occhio, e la crescita compromessa. ZIKV è un virus a RNA della famiglia Flaviviridae. ZIKV è trasmesso principalmente dalle zanzare, ma può anche essere diffuso da materna a trasmissione verticale del feto, così come il contatto sessuale. Fino ad oggi, non ci sono trattamenti o vaccini opzioni affidabili per proteggere quelli infettati dal virus. Lo sviluppo di un sistema di coltura cellulare riproducibile, efficace virus Zika infettiva è critico per studiare i meccanismi molecolari di replicazione ZIKV così come farmaci e vaccini sviluppo. A questo proposito, un protocollo che descrive una in vitro Zika sistema di coltura di cellule di mammifero basata virus per virale analisi produzione e la crescita è riportata qui. Dettagli sulla formazione di placche da virus Zika su un monostrato di cellule e saggio di placca per misurare titolo virale sono presentati. cinetica replica genoma viralee doppio filamento di RNA genomici intermedi replicatory sono determinati. Questa piattaforma coltura è stata utilizzata per lo schermo da una libreria di un piccolo gruppo di citochine conseguente identificazione di interferone-α (IFN-α), IFN-β e IFN-γ come inibitori potenti del Zika crescita virale. In sintesi, un infettiva sistema di coltura in vitro Zika virale e vari saggi virologici sono dimostrati in questo studio, che ha il potenziale per beneficiare notevolmente la comunità di ricerca nel chiarire ulteriormente i meccanismi di patogenesi virale e l'evoluzione della virulenza del virus. Antivirale IFN-alfa può essere ulteriormente valutata come un profilattico, profilattico post-esposizione, e opzione di trattamento per le infezioni da virus Zika in popolazioni ad alto rischio, comprese le donne in gravidanza infettate.

Introduzione

Zika Virus (ZIKV) è un importante patogeno umano associato con microcefalia e poveri gravidanza esiti 1,4. ZIKV appartiene alla serie di flavivirus clinicamente rilevanti che possono causare difetti neurologici, come la dengue, West Nile, e virus encefalite di St. Louis. La modalità principale di trasmissione virale è dal vettore zanzara Aedes aegypti, e, inoltre, la trasmissione sessuale è stata riportata anche 5,6. ZIKV è diventata un importante problema di salute globale a causa della espansione della distribuzione geografica della zanzara vettore e la sua forte correlazione con difetti alla nascita. ZIKV è stato isolato nel 1947 da una scimmia Rhesus sentinella nel bosco Zika, l'Uganda e il primo caso umano è stato segnalato nel 1952 7,8. Gli individui che si infettano con ZIKV presente con sintomi lievi come febbre, eruzioni cutanee, mal di testa, congiuntivite, dolori muscolari e / articolare. Le donne in gravidanza infettate possono trasmettere ZIKV al feto in via di sviluppo 1. ZInfezione IKV è stata anche legata alla sindrome di Guillain-Barre, un nervo periferico demielinizzazione autoimmune disturbo 9.

Il genoma virale Zika consiste in un senso positivo, molecola a singolo filamento di RNA che è di circa 10,8 chilobasi di lunghezza. La struttura del genoma è organizzato come 5'NCR-C-PRM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3'NCR, con le regioni non codificanti (NCR) che fiancheggia una regione codificante 6. Una singola poliproteico (3.419 bis) è tradotto cioè co- e post-traduzionali spaccati in 10 piccoli peptidi. Sia il 5'NCR e strutture stem-loop 3'NCR RNA svolgono un ruolo critico nella inizio della traduzione del genoma virale e la replica. I componenti strutturali del genoma sono costituiti da proteine ​​capside, membrana, e la busta. Le proteine ​​non strutturali sono fondamentali per replicazione del genoma.

Attualmente, i ceppi virali Zika sono raggruppati in tre genotipi principali: West African, Dell'Africa orientale e asiatico 6,10-13. E 'stato proposto che l'Oriente lignaggio africano diffuso in Africa occidentale e in Asia, dove poi ulteriormente evoluto 12. Il genotipo asiatico è responsabile per le epidemie in corso in America. virus Zika può essere coltivato sia in zanzare e cellule di mammifero. Fibroblasti dermici primarie, cellule dendritiche immature, cellule progenitrici neurali corticali, e le cellule Vero sono suscettibili alle infezioni virali Zika 10,14,15. Sia di tipo I e tipo II interferoni hanno dimostrato di limitare la crescita ZIKV nei fibroblasti cutanei 15. Gli obiettivi di questo studio sono quelli di fornire un graduale, protocollo dettagliato per la produzione e il saggio del genotipo asiatico ZIKA ceppo virale PRVABC59 in un sistema di coltura cellulare di mammifero e per dimostrare l'utilità di questo sistema di coltura infettiva come piattaforma di sviluppo di droga. Questa risorsa ha il potenziale per beneficiare notevolmente la comunità di ricerca virale e neurologica Zika di chiarire ulteriormente imeccanismi di patogenesi ts virale e l'evoluzione della virulenza del virus.

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Protocollo

Nota: Un profilo schematico del flusso di lavoro è presentato in Figura 1.

1. cellule

  1. Utilizzare cellule Vero per la produzione di virus Zika e l'analisi del ciclo di replicazione virale.
  2. Preparare mezzi completi crescita contenente 10% di siero fetale bovino (FBS), 2 mM L-glutammina, penicillina (100 unità / ml), streptomicina (100 unità / ml), e 10 mM HEPES.
  3. Cellule Vero coltura con terreno di coltura completo specificato a 37 ° C con 5% di CO 2.

2. Zika Virus Produzione

  1. Raccogliere le cellule Vero a densità cellulare 80% con 0,25% tripsina in T-75 pallone e contare le cellule.
    1. Aspirare il supporto dal pallone di coltura T-75 e sciacquare le cellule con 2 ml di tampone fosfato salino (PBS).
    2. Aggiungere 2 ml di 0,25% tripsina e incubare il matraccio a 37 ° C per 5 min.
    3. Aggiungere 8 ml di siero contenenti terreno di coltura per inattivare la tripsina. Pipettare su e giù per suscellule pend e trasferire le cellule ad una provetta da 15 ml.
    4. Rimuovere 10 ml di cellule e mescolare con la stessa quantità di 0,4% trypan blu. Caricare il mix preparato alla diapositiva camera di conteggio delle cellule e di ottenere cellule vitali conteggi si utilizza un contatore di cellule automatizzato.
  2. Seme un totale di 7 milioni di cellule in un volume di 30 ml in un pallone T-160.
  3. Il giorno successivo, preparare una molteplicità appropriata di infezione (0,01-0,1 MOI) di Zika inoculo virus in un terreno di coltura libero 10 ml di siero per bombola.
  4. Rimuovere il supporto trascorso dal pallone T-160 e quindi aggiungere l'inoculo virale appena preparato (10 ml).
  5. Incubare i flaconi inoculati nel 37 ° C con 5% di CO 2 per 4-6 ore. Stendere l'inoculo inclinando leggermente i fiaschi di traverso ad ogni ora.
  6. Al termine dell'incubazione, sostituire l'inoculo con mezzi calda siero integrato crescita (30 ml) in ciascun contenitore. Poi continuare la coltura virale per il prossimo 96 ore.
  7. Verificare la progressione infection osservando la comparsa di placche virali sul monostrato cellulare utilizzando un microscopio a contrasto di fase e prendere immagini (Figura 2) come necessario al 40X e 200X ingrandimenti.

figure-protocol-1
Figura 2:. Placche formate da virus Zika su un monostrato di cellule Vero immagini in campo chiaro di vari ingrandimenti mostrano Zika placche virali a 48 HPI. Si noti la presenza di foci di cellule arrotondate sul monostrato. (Scala bar = 50 micron) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

  1. Harvest supernatanti di coltura cellulare al punto di tempo a 96 ore e centrifugare il surnatante a 300 xg per 10 minuti a 4 ° C per rimuovere i detriti cellulari.
  2. rimuovere con attenzione il surnatante, senza detriti pellet inquietante e trasferimento to provette da 15 ml. Ultracentrifugazione a 24.000 xg può essere eseguita per concentrare le particelle virali (opzionali).
  3. Conservare i sovranatanti virali in più aliquote a -80 ° C.

3. Misurazione Zika Virus Titer dalla placca Assay

  1. Cellule Vero naive Seed a 1 x 10 5 cellule per pozzetto a 2 ml di volume, con un 12-pozzetti.
  2. Il giorno seguente, preparare 10-diluizioni seriali di surnatanti virali raccolti dai pallone T-160 utilizzando supporti privo di siero. Rimuovere i supporti spesi da ciascun pozzetto e aggiungere 400 ml di inoculo preparato su cellule Vero in triplice copia.
  3. Incubare i flaconi inoculati a 37 ° C con 5% di CO 2 per 4-6 ore. Stendere l'inoculo inclinando leggermente la piastra di traverso ad ogni ora.
  4. Al termine dell'incubazione, sostituire l'inoculo con mezzi di siero integrato (2 ml per pozzetto).
  5. A 48 ore post-inoculazione, contare i fuochi virale utilizzando un contr fase diMicroscopio ast. Calcolare il titolo virale come unità formando la placca (PFU) per ml. Vedi Figura 3 per il saggio di placca.
  6. Fissare e macchiare le cellule del 4% di formaldeide e la soluzione al cristalvioletto 0,1% preparate in etanolo al 20% per una chiara visualizzazione delle placche.

Assay 4. Zika virale Genome replica

  1. Cellule Vero naive Seed a 1 x 10 5 cellule per pozzetto in 2 volumi ml con un 12-pozzetti. Il giorno seguente, preparare inoculi virali (MOI di 0,01 e 0,1; 400 ml / pozzetto) di basso e alto titolo utilizzando siero media liberi in triplice copia. Per l'infezione finto, utilizzare il siero media liberi (400 ml / pozzetto) solo.
  2. Ripetere i passaggi 3,2-3,4.
  3. Nei punti di tempo 48 e 96 ore, raccogliere i campioni di RNA e immunocitochimica (ICC).
    1. Per i campioni di raccolta di RNA, rimuovere il supporto e poi aggiungere 400 ml di soluzione di lisi direttamente a ciascun bene e raccogliere i lisati.
    2. Per ICC, rimuovere il supporto e tgallina fissare le cellule aggiungendo 1 ml di metanolo a ciascun pozzetto e incubare la piastra a 4 ° C per 30 min.
    3. Dal lisato cellulare, isolare l'RNA totale utilizzando un kit di isolamento di RNA secondo le istruzioni del produttore. Quantificare l'RNA utilizzando uno spettrofotometro.
  4. Eseguire due fasi di trascrizione inversa PCR quantitativa (RT-qPCR) per determinare il contenuto genoma ZIKV da RNA raccolto.
    1. Per invertire trascrivere l'RNA, prima impostare un mix di reazione 13 ml composta da 5 mg di RNA isolato, 1 ml di dNTP (10 mm), e 1 ml esamero casuale (250 ng) in un tubo di 0,2 ml. Incubare la provetta a 65 ° C per 5 minuti e poi posto in ghiaccio per un minuto. Successivamente, aggiungere 1 ml di trascrittasi inversa, 4 ml di tampone di sintesi 5x filone, 1 ml di 0,1 M ditiotreitolo, e 1 ml di RNasi inibitore alla miscela di reazione. Incubare la provetta per altri 5 minuti a 25 ° C, seguita da 60 minuti a 50 ° C e inactivmangiato la reazione mediante riscaldamento a 70 ° C per 15 min.
    2. Eseguire qPCR utilizzando 1 ml di cDNA risultante con 12,5 ml di colorante verde 2x eccellente mix contenenti DNA polimerasi e 1 ml di 10 mm singoli primer specifici per il virus Zika [Zika virus pan-genotipo primer (per: 5'-AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3 ' ; Rev: 5'-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3 '), virus Zika genotipo asiatico primer deformazione PRVABC59 (5'-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3'; Rev: 5'-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3 ')], o il virus dell'epatite C (JFH RTQ F: 5 'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3'), o cellulare GAPDH gene housekeeping (Per: 5'-CCACCTTTGACGCTGGG-3 '; Rev: 5'-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3') in un volume di reazione di 25 microlitri.
    3. Eseguire la PCR utilizzando la condizione di esercizio 95 ° C per 15 sec e 60 ° C per 30 sec (40 cicli) in un sistema PCR in tempo reale.
    4. Utilizzare livello di espressione GAPDH sulla base di soglie ciclo value (Ct) per normalizzare la Zika misura genoma virale. Calcolare il valore delta Ct (ΔCt) di Zika genoma rispetto a quello della GAPDH e ottenere il valore 2 ΔCt. Quindi, calcolare la variazione volte prendendo il rapporto tra normalizzati Zika contenuti del genoma tra le cellule infetti e non infetti in punti all'ora indicata. Si veda la Figura 4 per i risultati di replica ZIKV genoma.
  5. Eseguire ICC utilizzando le cellule metanolo fisso.
    1. Lavare le cellule fissate tre volte con PBS 1x e bloccare con ICC tampone bloccante (3% siero di capra, 3% BSA, 0,1% Triton-X 100 in PBS).
    2. Usa il mouse monoclonale anti-dsRNA anticorpi J2 (1 mg / ml) alla diluizione di 1: 100 in tampone di bloccaggio e incubare una notte a 4 ° C.
    3. Lavare le cellule con PBS 1x e aggiungere anticorpo secondario di capra anti-topo IgG-594 (1 mg / ml) ad una diluizione 1: 1.000 in tampone bloccante e incubare per un'ora a temperatura ambiente.
    4. Lavare le cellule con PBS 1x e colorare per i nuclei con colorante Hoechst eosservare le cellule utilizzando un microscopio a fluorescenza ad ingrandimento 100X (Figura 4).

5. Screening citochine Biblioteca contro Zika infezione da virus

  1. Seed cellule Vero naive a 1 x 10 5 cellule per pozzetto utilizzando un 12-pozzetti. Una volta che le cellule sono fissati (6 ore post-semina), aggiungere ciascuna citochina a concentrazioni indicate in duplicati biologici (2 ml di volume / pozzetto). Includi veicolo (PBS) il controllo da solo.
  2. A 12 ore dopo il trattamento, effettuare infezione virale Zika (MOI di 0,1 a 400 ml per pozzetto). Includere pozzetti di controllo negativo senza infezione (finto).
  3. A 4 ore dopo l'infezione, sostituire l'inoculo virale con i media di citochine trattati (2 ml). Incubare le cellule a 37 ° C per ulteriori 44 ore.
  4. A 48 ore dopo l'infezione, contare le placche virali utilizzando un microscopio a contrasto di fase e di acquisire immagini rappresentative di cellule infettate a 40X di ingrandimento (Figura 5).

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Risultati

Un ceppo virale Zika (PRVABC59; GenBank numero di accesso KU501215) del genotipo asiatico è stato utilizzato in questo studio 12. Cellule Vero a 80% di confluenza sono stati usati per indagare de novo Zika infezione virale. Per la produzione virale e la successiva caratterizzazione virologica, un passaggio precoce del virus (P3) Zika è stato impiegato. Sono state rilevate le placche virali il secondo giorno di infezione. Zika progenie virali rilasciate dalla cellula i...

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Discussione

Qui, un protocollo semplificato per la coltura dei virus Zika in vitro è presentato. Passaggi critici tra cui, individuando punti finali ottimali per espandere la cultura del virus, la misurazione titolo, e quantificare replicazione del genoma sono stati forniti. virus Zika è un patogeno umano, così, durante la manipolazione di agenti infettivi, le procedure di biosicurezza devono essere seguite scrupolosamente. Una linea cellulare di rene di scimmia, Vero, è stato utilizzato per dimostrare vari saggi virologic...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare il Dr. Aaron Brault e il Dr. Brandy Russell dei Centers for Disease Control and Prevention (CDC), USA per aver fornito PRVABC59 del ceppo virale Zika. Ringraziamo Nicholas Ten dell'Università di Yale per il copy-editing di questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dal Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award a V.A.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Dulbecco' s Eagle modificato' (DMEM)Sigma Life ScienceD5796
HEPESLife Technologies15630080
GlutamaxLife Technologies35050061
2,5% di tripsina, 10x [-] Fenolo rosso   Corning25-054-C1
Trypan Blue Stain 0.4%Life TechnologiesT10282
Contessa - ndash; Contatore di cellule automatizzatoThermoFisher ScientificC10227
Countess-cell countess  vetrini della cameraThermoFisher ScientificC10283
Rneasy Mini KitQiagen74104
Nanodrop 2000Thermo ScientificNanodrop 2000
monoclonale di topo anti-dsRNA anticorpo J2 Italiano & Consulenza Scientifica Kft.
capra anti-coniglio IgG Alexa Fluor 594Life TechnologiesA11020
SUPERSCRIPT III RT Life Technologies18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROXLife Technologies11744500
QuantStudio12K Flex Real-Time PCR SystemThermo Fischer4471088
senza RNasi DNasePromegaM6101
Vero Cell Line ATCCCCL-81
Ceppo virale Zika PRVABC59Centri per il controllo e la prevenzione delle malattie (CDC)
IL-6Peprotech200-06                         
IL-1 alfa             Peprotech200-01A                  
TNF-alfaPeprotech300-01A                   
Interferone alfa A  R & D Systems11100-1
Interferone betaPeprotech300-02BC
Interferone gammaPeprotech300-02
Centrifuga 5415REppendorf5415R
Centrifuga 5810REppendorf5810R
Nikon Eclipse Ti Microscopio a immunofluorescenza con Nikon Intenselight C-HGFINikonVisita Nikon su richiesta
10010200

Riferimenti

  1. Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report. N Engl J Med. , 1-11 (2016).
  2. Lucey, D. R., Gostin, L. O. The Emerging Zika Pandemic: Enhancing Preparedness. JAMA. 315 (9), 865-866 (2016).
  3. Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).
  4. Schuler-Faccini, L., et al. Possible Association Between Zika Virus Infection and Microcephaly. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (3), Brazil. 59-62 (2015).
  5. Foy, B. D., et al. Probable non-vector-borne transmission of Zika virus, Colorado, USA. Emerg Infect Dis. 17 (5), 880-882 (2011).
  6. Kuno, G., Chang, G. J. Full-length sequencing and genomic characterization of Bagaza, Kedougou, and Zika viruses. Arch Virol. 152 (4), 687-696 (2007).
  7. Dick, G. W. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 521-534 (1952).
  8. Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).
  9. Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome--case report, French Polynesia. Euro Surveill. 19 (9), 1-3 (2013).
  10. Baronti, C., et al. Complete coding sequence of zika virus from a French polynesia outbreak in 2013. Genome Announc. 2 (3), e00500-e00514 (2014).
  11. Lanciotti, R. S., et al. Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007. Emerg Infect Dis. 14 (8), 1232-1239 (2008).
  12. Lanciotti, R. S., et al. Phylogeny of Zika virus in Western Hemisphere, 2015 [Letter]. Emerg Infect Dis. 22 (5), (2016).
  13. Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clin Microbiol Infect. 20 (10), O595-O596 (2014).
  14. Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. , 1-5 (2016).
  15. Hamel, R., et al. Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells. J Virol. 89 (17), 8880-8896 (2015).
  16. Faye, O., et al. Quantitative real-time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-caught mosquitoes. Virol J. 10, 311(2013).
  17. Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
  18. Hiratsuka, M., et al. Administration of interferon-alpha during pregnancy: effects on fetus. J Perinat Med. 28 (5), 372-376 (2000).
  19. Ozaslan, E., et al. Interferon therapy for acute hepatitis C during pregnancy. Ann Pharmacother. 36 (11), 1715-1718 (2002).

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