Tridimensionale Super Resolution Microscopia di filamenti di F-actina da interferometrico fotoattivati ​​localizzazione Microscopy (iPALM)

Yilin Wang; Pakorn Kanchanawong

doi:10.3791/54774

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Articolo metodologico

Tridimensionale Super Resolution Microscopia di filamenti di F-actina da interferometrico fotoattivati localizzazione Microscopy (iPALM)

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DOI:

10.3791/54774

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1 dicembre 2016

Yilin Wang¹ , Pakorn Kanchanawong²^,³

¹Department of Biology, South University of Science and Technology of China, Shenzhen, ²Mechanobiology Institute, Singapore, ³Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore

In questo articolo

Sommario

Presentiamo un protocollo di applicazione del interferometrica fotoattivati localizzazione Microscopy (iPALM), un metodo di risoluzione di microscopia eccellente 3-dimensional localizzazione singola molecola, per l'imaging del citoscheletro actina in cellule di mammifero aderenti. Questo approccio permette la visualizzazione basata sulla luce delle caratteristiche strutturali nanoscala che altrimenti rimarrebbero irrisolti da convenzionale microscopia ottica di diffrazione limitata.

Abstract

Microscopia a fluorescenza permette la visualizzazione diretta di biomolecole specifici all'interno delle cellule. Tuttavia, per microscopia a fluorescenza convenzionale, la risoluzione spaziale è limitata dalla diffrazione a ~ 200 nm entro il piano dell'immagine e> 500 nm lungo l'asse ottico. Come risultato, la microscopia a fluorescenza è stata a lungo fortemente limitato nell'osservazione delle caratteristiche ultrastrutturali all'interno delle cellule. Il recente sviluppo di metodi di microscopia Super Resolution ha superato questa limitazione. In particolare, l'avvento di fluorofori photoswitchable permette al microscopio di risoluzione super di localizzazione basati, che fornisce potere di risoluzione si avvicina alla scala molecolare di lunghezza. Qui, descriviamo l'applicazione di un metodo di risoluzione di microscopia eccellente tridimensionale sulla base di singola molecola di localizzazione, microscopia ed interferometria multifase, chiamato interferometrica fotoattivati localizzazione Microscopy (iPALM). Questo metodo fornisce una risoluzione quasi isotropa sulladell'ordine di 20 nm nelle tre dimensioni. Protocolli per la visualizzazione del citoscheletro actina filamentosa, compresa la preparazione del campione e il funzionamento dello strumento iPALM, sono descritte qui. Questi protocolli sono facilmente adattabili e istruttivo per lo studio di altre caratteristiche ultrastrutturali nelle cellule.

Introduzione

La visualizzazione delle strutture cellulari complesse è stata a lungo parte integrante di dati biologici e la scoperta. Sebbene microscopia a fluorescenza può celle di immagine con alta specificità molecolare, il suo potere di risoluzione è limitata dalla diffrazione a ~ 200 nm nel piano immagine (x, y, o dimensione laterale) e> 500 nm lungo l'asse ottico (z, o dimensione assiale) ^1,2. Pertanto, l'osservazione delle caratteristiche ultrastrutturali è stato storicamente limitato a microscopia elettronica (EM). Fortunatamente, il recente sviluppo della microscopia super-risoluzione ha aggirato questo limite, consentendo la risoluzione spaziale nel 1....