Flusso analisi di citometria di Natural Killer cellulare Lytic attività nel Sangue umano intero

Jennifer E. McBride; Mary P. Meaney; Casey John; David C. Nieman; Renaud F. Warin

doi:10.3791/54779

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Articolo metodologico

Flusso analisi di citometria di Natural Killer cellulare Lytic attività nel Sangue umano intero

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DOI:

10.3791/54779

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17 marzo 2017

Jennifer E. McBride¹ , Mary P. Meaney² , Casey John² , David C. Nieman² , Renaud F. Warin¹

¹Center for Excellence in Post-Harvest Technologies, North Carolina A&T State University, North Carolina Research Campus, ²Human Performance Laboratory, Appalachian State University, North Carolina Research Campus

In questo articolo

Sommario

Questo lavoro descrive un flusso di lavoro avanzato per la determinazione accurata e rapida della conta delle cellule NK (Natural Killer) e della citotossicità delle cellule NK in campioni di sangue umano.

Abstract

citotossicità delle cellule NK è una misura ampiamente utilizzato per determinare l'effetto di un intervento esterno sulla funzione delle cellule NK. Tuttavia, la precisione e la riproducibilità di questo test possono essere considerati instabili, sia a causa di errori dell'utente oa causa della sensibilità delle cellule NK di manipolazione sperimentale. Per eliminare questi problemi, un flusso di lavoro che li riduce al minimo è stato stabilito ed è presentato qui. Per illustrare, abbiamo ottenuto campioni di sangue, in vari momenti, da corridori (n = 4), che sono stati sottoposti ad un intenso periodo di esercizio. In primo luogo, le cellule NK sono contemporaneamente identificati e isolati attraverso CD56 tagging e smistamento magnetico-based, direttamente dal sangue intero e da un minimo di un millilitro. Le cellule NK ordinati vengono rimossi di eventuali anticorpi reagenti o tappatura. Essi possono essere contati per stabilire un accurato conteggio delle cellule NK per millilitro di sangue. In secondo luogo, le cellule NK ordinati (effettori cellule o E) possono essere miscelati con 3,3'-Diotadecyloxacarbocyanine perclorato (DIO) etichettato cellule K562 (cellule bersaglio o T) in un saggio-ottimale 1: 5 T: rapporto E e analizzato utilizzando un flusso-citometria di imaging che permette la visualizzazione di ogni evento e l'eliminazione di falsi positivi o falsi negativi (come doppiette o cellule effettrici). Questo flusso di lavoro può essere completato in circa 4 ore, e consente di ottenere risultati molto stabili anche quando si lavora con campioni umani. Quando disponibile, gruppi di ricerca possono testare diversi interventi sperimentali in soggetti umani, e confrontare le misurazioni attraverso diversi punti di tempo senza compromettere l'integrità dei dati.

Introduzione

cellule killer naturali sono un elemento essenziale del sistema immunitario innato. Mentre sono molto disciplinati, hanno la capacità di riconoscere ed eliminare le cellule anomale attraverso il contatto cellula-cellula e senza attivazione preventiva ^1. Come tali, essi formano una linea veloce di difesa contro le infezioni. Esercizio, particolarmente intenso, ha dimostrato di deprimere transitoriamente il sistema immunitario ^{^2,} ^{^3,} ^{^4,} ^5. Cellule NK sono particolarmente soggetti a questo effetto ^{^....}