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Articolo metodologico

Preparazione delle colture gliali miste primarie da adulti mouse spinale tessuto del midollo

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DOI:

10.3791/54801

⸱

19 novembre 2016

 , 
1Department of Biomedical Sciences, College of Osteopathic Medicine, University of New England

In questo articolo

Sommario

Lo sviluppo del dolore neuropatico comporta alterazioni patologiche delle cellule gliali cordone spinale. Un affidabile sistema di coltura gliali derivate da tessuto del midollo spinale adulto e progettato per studiare queste cellule in vitro è carente. Pertanto, mostriamo qui come stabilire colture gliali miste primarie di topo adulto tessuto del midollo spinale.

Abstract

È stato ben accettato che midollo spinale risposte gliali contribuiscono significativamente allo sviluppo del dolore neuropatico. Informazioni enorme per quanto riguarda attività gliali a livello cellulare e molecolare è stata ottenuta attraverso sistemi di colture cellulari in vitro. I sistemi in vitro utilizzati, includono principalmente glia primarie derivate da tessuto corticale cerebrale neonatale e immortalati linee cellulari. Tuttavia, questi sistemi potrebbero non riflettere le caratteristiche delle cellule gliali cordone spinale in vivo. Per studiare ulteriormente il ruolo delle cellule del cavo gliali spinale nello sviluppo del nervo periferico dolore neuropatico lesione indotta utilizzando un sistema di coltura che riflette meglio la condizione in vivo, il nostro laboratorio ha sviluppato un metodo per stabilire primaria del midollo spinale culture gliali miste da topi adulti. In breve, il midollo spinale si raccolti da topi adulti e trattati tramite digestione papaina seguita dalla rimozione mielina con tanelità-pendenza media. Sospensioni cellulari singoli sono coltivate in mezzi di Eagle modificato di Dulbecco completa (cDMEM) supplementato con 2-mercaptoetanolo (2-ME) a 35,9 ° C. Queste condizioni di coltura sono state ottimizzate specificamente per la crescita delle cellule gliali miste. In queste condizioni, le cellule sono pronte per essere utilizzati per la sperimentazione tra 12 - 14 d (cellule di solito sono in fase di log durante questo tempo) dopo la creazione della coltura (D 0) e possono essere tenuti in condizioni di coltura fino a D 21. Questo sistema di coltura può essere usato per studiare le risposte delle cellule gliali cordone spinale dopo stimolazione con varie sostanze e agenti. Inoltre dolore neuropatico, questo sistema può essere usato per studiare le risposte gliali in altre malattie che coinvolgono alterazioni patologiche di cellule gliali cordone spinale.

Introduzione

Il dolore cronico è un grave problema di salute che colpisce circa 100 milioni di adulti negli Stati Uniti, con un costo annuo stimato di un massimo di $ 635.000.000.000 1. Prove di montaggio ha indicato un contributo significativo di cellule gliali cordone spinale nello sviluppo del dolore neuropatico, uno dei più devastanti tipi di dolore cronico 2. Una corretta vitro sistema di coltura in aiuterebbe in maniera significativa nelle indagini ulteriormente i ruoli delle cellule gliali a livello cellulare e molecolare.

Attualmente, le vitro gliali sistemi di coltura utilizzati dai ricercatori includono cellule gliali principalmente derivate da tessuti corticali di topo o ratto cervelli neonatali e immortalati linee di cellule gliali derivate da topo neonatale o ratto cellule gliali primarie. cellule neonatali contengono un numero significativo di cellule indifferenziate che possono essere ulteriormente differenziate in cellule gliali (soprattutto astrociti e microglia), fornendo così uncellule bundant per l'utilizzo sperimentale 3. Tuttavia, il nostro studio precedente ha dimostrato che il cervello neonatale cellule gliali hanno risposto significativamente diverso dalle cellule gliali cordone spinale adulto su lipopolisaccaride (LPS) stimolazione. Ad esempio, l'interleuchina (IL) -4 visualizzata migliorata effetti inibitori sulla ossido nitrico LPS-indotta (NO) la produzione nel ratto adulto midollo spinale glia rispetto al neonatale cervello glia 4. Inoltre, i profili di produzione di chemochine su di stimolazione da parte di un neuropeptide, la calcitonina peptide correlato al gene (CGRP), sono indiscutibilmente differenti tra topo neonatale glia cervello (metodi descritti in Rif. 5) e di topo adulto midollo spinale glia (Figura 1). Linee cellulari stabilizzate sono facili da usare e mantenere e possono fornire un gran numero di cellule in un breve periodo di tempo. In generale, immortalate linee cellulari vengono generati sia utilizzando un sistema immortalizzazione virus-mediata (ad esempio la linea di cellule microgliali diffuso BV2) 6, 7 o dopo the l'identificazione di trasformazione spontanea (come la linea cellulare astrociti C8-D1A e la linea di cellule microgliali C8-B4) 8, 9 linee cellulari sono eccellenti in studio delle caratteristiche molecolari di astrociti e microglia individualmente.; tuttavia, i risultati ottenuti da linee cellulari richiedono sempre ulteriore validazione in cellule primarie o in condizioni in vivo. Va inoltre notato che non c'è stata una relazione di una linea cellulare gliale derivato da un roditore glia del midollo spinale.

Per aiutare indagare il ruolo delle cellule cavo gliali spinale nello sviluppo del dolore neuropatico, un sistema di coltura derivato dal topo adulto midollo spinale è stato sviluppato adattando un metodo precedentemente segnalato utilizzato per generare ratto adulto colture gliali miste 4, 5 . La cultura gliale midollo spinale di topo è stata ulteriormente raffinata recente 10 ed è descritta in dettaglio in questo articolo. Adulti midollo spinale mescolato culture gliali cun essere stabilita con un mouse da ceppi selezionati che si adattano alle esigenze di un particolare studio, e le cellule possono essere mantenute in coltura per un massimo di 21 D postare l'inizio della cultura. Questo metodo può essere usato in studi di dolore neuropatico, nonché in ricerche di varie malattie neurologiche che comportano cambiamenti patologici all'interno del midollo spinale, come la sclerosi laterale amiotrofica (SLA), virus dell'immunodeficienza umana (HIV) -associated neuropatia sensoriale, e multipla La sclerosi (MS).

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Protocollo

Il seguente protocollo è stato approvato dal Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) presso l'Università del New England. Il seguente protocollo è per la preparazione di colture gliali da 4 adulti topo midollo spinale.

1. preparazione di soluzioni in una cappa di coltura in condizioni asettiche

  1. Preparare terreni di coltura: modifica completa Dulbecco dei mezzi di Eagle (cDMEM) contenente DMEM (con 4,5 g / L di glucosio), il 10% siero fetale bovino (FBS), 2 mM L-glutammina, 100 UI / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina , 250 ng / mL Amfotericina B, e 50 mM 2-mercaptoetanolo (2-ME; vedi 1.1.1). Mescolare e filtrare sterilizzare tutti gli altri componenti e quindi aggiungere FBS. Conservare il terreno di coltura a 4 ° C.
    1. Preparare 50 mm 2-ME / PBS soluzione madre (PBS): aggiungere 100 ml di concentrato 2-ME (14.3 M) in 28,6 ml di PBS 1x, e sterilizzare il filtro (la soluzione può essere conservato a 4 ° C per diversi mesi). USE 1 ml di 2-ME soluzione di riserva per ogni 1.000 ml di terreni di coltura.
  2. Preparazione del supporto gradiente di densità
    1. Preparare uno stock isotonica soluzione multimediale gradiente di densità (ad esempio, 100% Percoll) da 1 parte di 10x normale PBS sterile e 9 parti dei media pendenza sterile magazzino densità (ad esempio, Percoll).
    2. Diluire il supporto gradiente di densità 100% (fatto in 1.2.1) con regolare 1x PBS sterile per fare un supporto gradiente di densità del 20% (ad esempio, 10 ml di 100% dei media gradiente di densità con 40 ml di PBS 1x) e conservarlo a 4 o C. Portare il supporto gradiente di densità 20% a temperatura ambiente (RT) prima di preparare la coltura cellulare.
  3. Preparazione delle soluzioni dal sistema di dissociazione papaina
    NOTA: Il sistema di dissociazione papaina può essere identificato nella tabella materiali. Altri kit dissociazione simili (compresi quelli assemblati in-house) possono anche essere utilizzati. Tutti ComponeNTS devono essere sterili.
    1. Aggiungere 32 ml di soluzione salina bilanciata di Earle (EBSS) alla miscela inibitore ovomucoid (polvere).
    2. Aggiungere 5 ml di EBSS di un flaconcino papaina (polvere). Posizionare la fiala papaina a 37 o C bagnomaria per 10 minuti o fino a quando la papaina è sciolto.
    3. Aggiungere 500 ml di EBSS di un flaconcino DNasi (polvere). Mescolare delicatamente.
    4. Aggiungere 250 ml di soluzione di DNasi (sopra) al flaconcino papaina.
    5. Calcolare la quantità totale di quanto sopra miscela papaina / DNasi necessario (circa 800 ml di papaina / miscela DNasi per il mouse midollo spinale) e trasferire la miscela necessaria in un tubo da 50 ml per la digestione del tessuto (punto 3.2). Conservare il rimanente nel flacone originale a 4 ° C per almeno due settimane.
    6. Tenere tutti i componenti dei kit in ghiaccio fino al momento dell'uso.
  4. Preparare provette per il prelievo del midollo spinale: una provetta sterile 15 ml con 5 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS, dal sistema di papaina di dissociazione,0; per la raccolta di midollo spinale) e una sterile 15 ml di tubo con PBS 1x (per riempire la siringa da 5 ml, vedere il punto 2.4). Inoltre, preparare una piastra di Petri sterile (35 mm o 60 mm) con 5 ml di HBSS e tenerlo nella cappa coltura.

2. midollo spinale Collection

NOTA: Tutte le attrezzature devono essere sterili. Eseguire la collezione in una zona designata approvato dal IACUC.

  1. Ottenere i seguenti strumenti per la raccolta di topo midollo spinale: diritto / smussato forbici chirurgiche affilate 18 cm, un bisturi da 12 cm standard (3 solid #), in acciaio al carbonio sterili lame di bisturi # 10, un piccolo Decapitator animali, standard di 12 cm curvo forcipe, e un ago 20G sterili attaccato ad una siringa da 5 mL.
  2. Eutanasia l'animale con CO 2 e disinfettare la testa del mouse e la regione posteriore con il 70% di etanolo (EtOH).
  3. Decapitare animale con il Decapitator. Fare un incisione longitudinale centrale sulla parte bassa della schiena per esporre lo strato muscolare. Rendereuna transezione pulita attraverso la colonna vertebrati a livello dell'anca (taglio anche attraverso lo strato muscolare che copre la colonna vertebrato) con le forbici chirurgiche rette sterili (18 cm).
  4. Posto l'animale su un foglio di fresco salvietta monouso. Inserire con attenzione il 20 ago G (attaccato ad una siringa da 5 ml riempita con sterile 1x PBS (punto 1.4)) nella colonna vertebrale verso il lato rostrale. Tenere l'animale verso il basso con forza e spingere la siringa in fretta. L'intero midollo spinale dovrebbe uscire dalla fine cervicale. Raccogliere il midollo spinale nel tubo da 15 ml contenente HBSS.
  5. Ripetere il passaggio 2.4 per il resto dei topi. Tra ogni animale, disinfettare tutti gli strumenti utilizzati con il 70% EtOH.
    NOTA: in genere, un unico 12-pozzetti può essere stabilita per ogni 4 topo midollo spinale (vedi 4.3).

3. Preparazione della cella singola sospensione

Nota: Eseguire i punti 3 e 4 in una cappa di coltura per tenere tutto sterile.

  1. Trasferire tutti i midolli spinali nella capsula di Petri HBSS contenente (passo 1,4). Tagliare ciascuno dei midollo spinale in tanti sottili, piccoli pezzi con le forbici e pinze sterili. Trasferire il tessuto del midollo spinale al tubo conico da 50 ml contenente la papaina preparato / miscela di enzimi DNasi (fase 1.3.5) utilizzando una pinza sterile o un mL pipetta 10 (evitare di aggiungere HBSS alla miscela di enzimi, in modo da diluire ulteriormente il preparato soluzione enzimatica e può causare una riduzione delle prestazioni di enzima).
  2. Agitare la provetta delicatamente per miscelare. Incubare la provetta a 37 ° C per 1 h in un incubatore / agitatore orbitale con agitazione a 150 rpm.
  3. Vortex la provetta nuovo e vigorosamente triturare soluzione enzimatica con il tessuto utilizzando una mL pipetta 5 per promuovere ulteriormente la dissociazione.
  4. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml e centrifugare a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
  5. Durante la centrifugazione, mescolare 2,7 mL EBSS con 300 ml di ricostituito inh albumina-ovomucoidsoluzione ibitor (1.3.1) in una provetta sterile. Aggiungere 150 ml di soluzione di DNasi (fase 1.3.3).
  6. Dopo la centrifugazione, rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare con la soluzione così preparata (punto 3.5). Vortex bene per rompere il pellet.
  7. Aggiungere 3 ml di soluzione ricostituita di albumina-ovomucoid inibitore (fase 1.4.1) alla sospensione cellulare. cellule centrifugare a 70 xg per 6 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante (che contiene frammenti di membrana).

4. ulteriore rimozione della mielina dalla cella singola sospensione

  1. Aggiungere 8 ml di terreni gradiente di densità 20% (preparato secondo il punto 1.2.2) nella provetta contenente il pellet cellulare, vortex delicatamente per disturbare il pellet e centrifugare le cellule a 800 xg per 30 min a RT senza frenare. Rimuovere con attenzione lo strato superiore di detriti (per lo più mielina) e il surnatante, ma mantenere il pellet.
  2. Per rimuovere residui del gradiente di densità, lavare le cellule resuspending il pellet cellulare con 8 mL di una cDMEM diluito (1 parte cDMEM e 2 parti HBSS). Centrifugare le cellule a 400 xg per 10 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e lavare le cellule di nuovo con il cDMEM diluito (sopra) nello stesso modo. Mantenere le cellule in ghiaccio fino al loro semina.
  3. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in terreni di coltura (cDMEM fornito con 2-ME (preparata al punto 1.1)). Per un 12-pozzetti, usare 3 ml x 4 (numero di topi utilizzati) + 2 ml = 14 ml di media. Questo farà sì che vi sia sospensione cellulare sufficiente per l'intera piastra (12 pozzetti) e fornirà per pozzi aggiuntivi che possono essere utilizzati per determinare il numero di cellule per pozzetto medio e il contenuto microglia della cultura. Se vengono utilizzati altri tipi di recipienti di coltura, calcola il volume totale dei terreni di coltura necessaria proporzionalmente.
  4. Aggiungere 1 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra 12 pozzetti.
  5. Incubare le cellule a 35,9 ° C con 5% di CO 2.
  6. Modifica dei media (rimuovere vecchi media tramite aspirazione) su D 1 e poi ogni 3 - 4 D in seguito (in genere a cambiare la media su D: 1, 4, 8, e 11, e quindi utilizzare le celle il giorno 12).
    NOTA: Il giorno 1, la cultura può contenere significative quantità di detriti a causa della mielina residuo dal tessuto del midollo spinale; in tal modo, cambiando i media il giorno 1 è raccomandata (si veda la discussione per ulteriori informazioni). Le culture sono pronto per il trattamento tra il D 12 - 14. Le cellule sono di solito 80% confluenti in D 12 e può essere vicino al 100% confluenti da D 14. In genere, il D 12, ci sono circa 100.000 cellule per bene in un 12-pozzetti .

figure-protocol-1
Figura 2:. Immagini rappresentative di cellule gliali miste in tempi diversi dopo l'istituzione della cultura glia mista glia misti midollo spinale primarie sono stati preparati da adulti topi C57BL / 6. immagini rappresentativemostrare lo stato di avanzamento della cultura gliali dopo la placcatura. Al giorno 1, alcune cellule sono attaccati alla piastra di coltura, ma sono ancora in gran parte intorno. Ci sono anche molte cellule galleggianti e detriti significativa. Al giorno 4, la maggior parte delle cellule sono attaccati alla piastra di coltura. Le cellule appaiono ramificata con i processi visibili. Le cellule sono sporadicamente distribuite e culture sono circa il 20-30% confluenti in questo momento. Al giorno 8, le culture sono tra il 50-60% confluenti. Alcune aree delle culture hanno grandi macchie di cellule. Altre aree delle culture hanno una crescita scarsa di cellule. Alcune cellule all'interno delle zone assumono un aspetto "piazza-like". Al giorno 12, le culture sono uguali o superiore a 80% confluenti (circa il 90% confluenti nell'immagine mostrato qui). Cellule sono in fase di log di crescita in questo momento e tra giorni 12-14 è il momento ottimale per l'utilizzo delle cellule gliali per gli esperimenti. Clicca qui per visualizzare ungrande versione di questa figura.

  1. Esaminare il contenuto utilizzando cellule microgliali dai pozzetti supplementari (punto 4.3) tramite standard di celle a fluorescenza-attivato (FACS) protocollo di colorazione 11 utilizzando la combinazione di anti-topo-CD45 e anticorpi monoclonali anti-topo CD11b. Cellule CD45 + CD11b + sono identificati come microglia.

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Risultati

Questo metodo può essere utilizzato per preparare cellule gliali miste sia da topi e ratti. Il numero di cellule totale medio per bene in un 12-pozzetti su D 12 post-iniziale della cultura dovrebbe essere relativamente stabile, con circa 100.000 cellule per bene quando le cellule sono derivate da midollo spinale di topo. Le cellule gliali ottenute da questo metodo possono essere utilizzati in esperimenti che sono stati progettati per esaminare adulti spinale risposte cavo gliali la sommi...

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Discussione

È fondamentale per eseguire tutte le operazioni, tra cui il supporto cambiando pianificazione in modo coerente per ottenere risultati riproducibili tra esperimenti. I seguenti passaggi sono particolarmente critico per ottenere un'eccellente qualità adulta glia misto.

La digestione enzimatica è un aspetto importante di questo protocollo. E 'fondamentale che i pezzi di tessuto sono ben digeriti in modo da ottenere una sospensione di cellule singole. Tuttavia, over-digestione comporta s...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Le colture miste di midollo spinale adulto sono state sviluppate per la prima volta utilizzando ratti con il supporto di un premio NIH/NIDA R01 (PI De Leo) e di una sovvenzione di formazione NIH T32 (PI Green). Questi metodi sono stati ulteriormente adattati per il midollo spinale di topo con il supporto delle seguenti sovvenzioni: NIH/NIDA 5K01DA023503 (PI Cao), NIH/NINDS 5R21NS066130 (PI Cao) e NIH/NIGMS P20GM103643 (PI Meng). Gli autori desiderano anche ringraziare il Dr. Alejandro M. S. Mayer, Dipartimento di Farmacologia, Chicago College of Osteopathic Medicine, per il suo aiuto tecnico nell'ottenere cellule gliali miste ricche di microglia.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Dulbecco' s modifica di Eagle' s (DMEM) con 4,5 g/L di glucosioLonza12-709FIl terreno cDMEM è un terreno di coltura standard e ampiamente utilizzato. I singoli ricercatori possono decidere dove acquistare il DMEM e tutti gli altri componenti utilizzati per realizzare i media cDMEM.
L-Glutammina (100x)Lonza17-605ELa L-glutammina è un componente standard e ampiamente utilizzato per vari terreni di coltura. I singoli ricercatori possono decidere dove acquistare la L-glutammina.
Soluzione antibiotico-antimicotica (100x)Corning-Mediatech30-004-CISi tratta di una combinazione di penicillina, streptomicina e amfotericina formulata per contenere 10.000 unità/mL di penicillina G, 10 mg/mL di streptomicina solfato e 25 µ g/mL di amfotericina B. I singoli ricercatori possono decidere dove acquistare i singoli componenti.
2-mercaptoetanolo (2-ME)Sigma-AldrichM3148A BioReagent, adatto per colture cellulari, biologia molecolare ed elettroforesi.
Sistema di dissociazione della papainaWorthington Biochemical CorporationLK003150I singoli componenti di questo kit possono essere acquistati separatamente.
PercollGE Health Care17-0891-01Percoll è venduto come soluzione sterile. Se necessario, il Percoll non diluito può essere ri-sterilizzato in autoclave.
Incubatore/agitatore per linea Lab Barstead/Lab-lineMaxQ4000 Questa è l'incubatrice/agitatrice che abbiamo attualmente. Al loro posto possono essere utilizzati altri tipi di agitatori.
Lipopolisaccaridi, Salmonella Minnesota Re595Sigma-AldrichL-9764Anche altri ceppi di LPS possono indurre risposte gliali. L'entità delle risposte, tuttavia, può variare.
Mouse IL-6 DuoSet ELISA R& D SystemsDY406Ogni singolo Ricercatore può selezionare il kit ELISA che preferisce.
Topo TNF-alfa DuoSet ELISA R& D SystemsDY410Ogni singolo Ricercatore può selezionare il kit ELISA che preferisce.
Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISAR& D SystemsDY466Ogni singolo Ricercatore può selezionare il kit ELISA che preferisce.
Set ELISA Opteia per topi MCP-1 (CCL2)BD Biosciences555260Ogni singolo ricercatore può selezionare il kit ELISA che preferisce.
Chemochina di topo Q-PlexQuansys Biosciences120251MSQuesto prodotto non era disponibile per il test interno al momento. Invece, abbiamo inviato campioni al produttore per l'analisi.
APC-anti-topo-CD45 (clone 30-F11)eBioscience17-0451È possibile utilizzare l'anticorpo dello stesso clone ma di altri fornitori.
FITC-anti-topo-CD11b (clone M1/70)eBioscience11-0112È possibile utilizzare l'anticorpo dello stesso clone ma di altri fornitori.
Citometro a flusso Accuri C6BD BiosciencesBD Accuri C6 Ogni singolo Ricercatore può utilizzare qualsiasi citometro a flusso preferisca.
Software FlowJoTree Star, Inc.FlowJo7.6.5Ogni singolo Ricercatore può utilizzare qualsiasi software di analisi preferisca.

Riferimenti

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