Lo sviluppo del dolore neuropatico comporta alterazioni patologiche delle cellule gliali cordone spinale. Un affidabile sistema di coltura gliali derivate da tessuto del midollo spinale adulto e progettato per studiare queste cellule in vitro è carente. Pertanto, mostriamo qui come stabilire colture gliali miste primarie di topo adulto tessuto del midollo spinale.
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Articolo metodologico
Preparazione delle colture gliali miste primarie da adulti mouse spinale tessuto del midollo
In questo articolo
Sommario
Abstract
È stato ben accettato che midollo spinale risposte gliali contribuiscono significativamente allo sviluppo del dolore neuropatico. Informazioni enorme per quanto riguarda attività gliali a livello cellulare e molecolare è stata ottenuta attraverso sistemi di colture cellulari in vitro. I sistemi in vitro utilizzati, includono principalmente glia primarie derivate da tessuto corticale cerebrale neonatale e immortalati linee cellulari. Tuttavia, questi sistemi potrebbero non riflettere le caratteristiche delle cellule gliali cordone spinale in vivo. Per studiare ulteriormente il ruolo delle cellule del cavo gliali spinale nello sviluppo del nervo periferico dolore neuropatico lesione indotta utilizzando un sistema di coltura che riflette meglio la condizione in vivo, il nostro laboratorio ha sviluppato un metodo per stabilire primaria del midollo spinale culture gliali miste da topi adulti. In breve, il midollo spinale si raccolti da topi adulti e trattati tramite digestione papaina seguita dalla rimozione mielina con tanelità-pendenza media. Sospensioni cellulari singoli sono coltivate in mezzi di Eagle modificato di Dulbecco completa (cDMEM) supplementato con 2-mercaptoetanolo (2-ME) a 35,9 ° C. Queste condizioni di coltura sono state ottimizzate specificamente per la crescita delle cellule gliali miste. In queste condizioni, le cellule sono pronte per essere utilizzati per la sperimentazione tra 12 - 14 d (cellule di solito sono in fase di log durante questo tempo) dopo la creazione della coltura (D 0) e possono essere tenuti in condizioni di coltura fino a D 21. Questo sistema di coltura può essere usato per studiare le risposte delle cellule gliali cordone spinale dopo stimolazione con varie sostanze e agenti. Inoltre dolore neuropatico, questo sistema può essere usato per studiare le risposte gliali in altre malattie che coinvolgono alterazioni patologiche di cellule gliali cordone spinale.
Introduzione
Il dolore cronico è un grave problema di salute che colpisce circa 100 milioni di adulti negli Stati Uniti, con un costo annuo stimato di un massimo di $ 635.000.000.000 1. Prove di montaggio ha indicato un contributo significativo di cellule gliali cordone spinale nello sviluppo del dolore neuropatico, uno dei più devastanti tipi di dolore cronico 2. Una corretta vitro sistema di coltura in aiuterebbe in maniera significativa nelle indagini ulteriormente i ruoli delle cellule gliali a livello cellulare e molecolare.
Attualmente, le vitro gliali sistemi di coltura utilizzati dai ri....
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Protocollo
Il seguente protocollo è stato approvato dal Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) presso l'Università del New England. Il seguente protocollo è per la preparazione di colture gliali da 4 adulti topo midollo spinale.
1. preparazione di soluzioni in una cappa di coltura in condizioni asettiche
- Preparare terreni di coltura: modifica completa Dulbecco dei mezzi di Eagle (cDMEM) contenente DMEM (con 4,5 g / L di glucosio), il 10% siero fetale bovino (FBS), 2 mM L-glutammina, 100 UI / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina , 250 ng / mL Amfotericina B, e 50 mM 2-mercaptoetanolo (2-ME; vedi 1.1.1). Mescolare e....
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Risultati
Questo metodo può essere utilizzato per preparare cellule gliali miste sia da topi e ratti. Il numero di cellule totale medio per bene in un 12-pozzetti su D 12 post-iniziale della cultura dovrebbe essere relativamente stabile, con circa 100.000 cellule per bene quando le cellule sono derivate da midollo spinale di topo. Le cellule gliali ottenute da questo metodo possono essere utilizzati in esperimenti che sono stati progettati per esaminare adulti spinale risposte cavo gliali la sommi.......
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Discussione
È fondamentale per eseguire tutte le operazioni, tra cui il supporto cambiando pianificazione in modo coerente per ottenere risultati riproducibili tra esperimenti. I seguenti passaggi sono particolarmente critico per ottenere un'eccellente qualità adulta glia misto.
La digestione enzimatica è un aspetto importante di questo protocollo. E 'fondamentale che i pezzi di tessuto sono ben digeriti in modo da ottenere una sospensione di cellule singole. Tuttavia, over-digestione comporta s.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Le colture miste di midollo spinale adulto sono state sviluppate per la prima volta utilizzando ratti con il supporto di un premio NIH/NIDA R01 (PI De Leo) e di una sovvenzione di formazione NIH T32 (PI Green). Questi metodi sono stati ulteriormente adattati per il midollo spinale di topo con il supporto delle seguenti sovvenzioni: NIH/NIDA 5K01DA023503 (PI Cao), NIH/NINDS 5R21NS066130 (PI Cao) e NIH/NIGMS P20GM103643 (PI Meng). Gli autori desiderano anche ringraziare il Dr. Alejandro M. S. Mayer, Dipartimento di Farmacologia, Chicago College of Osteopathic Medicine, per il suo aiuto tecnico nell'ottenere cellule gliali miste ricche di microglia.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Dulbecco' s modifica di Eagle' s (DMEM) con 4,5 g/L di glucosio | Lonza | 12-709F | Il terreno cDMEM è un terreno di coltura standard e ampiamente utilizzato. I singoli ricercatori possono decidere dove acquistare il DMEM e tutti gli altri componenti utilizzati per realizzare i media cDMEM. |
| L-Glutammina (100x) | Lonza | 17-605E | La L-glutammina è un componente standard e ampiamente utilizzato per vari terreni di coltura. I singoli ricercatori possono decidere dove acquistare la L-glutammina. |
| Soluzione antibiotico-antimicotica (100x) | Corning-Mediatech | 30-004-CI | Si tratta di una combinazione di penicillina, streptomicina e amfotericina formulata per contenere 10.000 unità/mL di penicillina G, 10 mg/mL di streptomicina solfato e 25 µ g/mL di amfotericina B. I singoli ricercatori possono decidere dove acquistare i singoli componenti. |
| 2-mercaptoetanolo (2-ME) | Sigma-Aldrich | M3148 | A BioReagent, adatto per colture cellulari, biologia molecolare ed elettroforesi. |
| Sistema di dissociazione della papaina | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | I singoli componenti di questo kit possono essere acquistati separatamente. |
| Percoll | GE Health Care | 17-0891-01 | Percoll è venduto come soluzione sterile. Se necessario, il Percoll non diluito può essere ri-sterilizzato in autoclave. |
| Incubatore/agitatore per linea Lab | Barstead/Lab-line | MaxQ4000 | Questa è l'incubatrice/agitatrice che abbiamo attualmente. Al loro posto possono essere utilizzati altri tipi di agitatori. |
| Lipopolisaccaridi, Salmonella Minnesota Re595 | Sigma-Aldrich | L-9764 | Anche altri ceppi di LPS possono indurre risposte gliali. L'entità delle risposte, tuttavia, può variare. |
| Mouse IL-6 DuoSet ELISA | R& D Systems | DY406 | Ogni singolo Ricercatore può selezionare il kit ELISA che preferisce. |
| Topo TNF-alfa DuoSet ELISA R | & D Systems | DY410 | Ogni singolo Ricercatore può selezionare il kit ELISA che preferisce. |
| Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA | R& D Systems | DY466 | Ogni singolo Ricercatore può selezionare il kit ELISA che preferisce. |
| Set ELISA Opteia per topi MCP-1 (CCL2) | BD Biosciences | 555260 | Ogni singolo ricercatore può selezionare il kit ELISA che preferisce. |
| Chemochina di topo Q-Plex | Quansys Biosciences | 120251MS | Questo prodotto non era disponibile per il test interno al momento. Invece, abbiamo inviato campioni al produttore per l'analisi. |
| APC-anti-topo-CD45 (clone 30-F11) | eBioscience | 17-0451 | È possibile utilizzare l'anticorpo dello stesso clone ma di altri fornitori. |
| FITC-anti-topo-CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 11-0112 | È possibile utilizzare l'anticorpo dello stesso clone ma di altri fornitori. |
| Citometro a flusso Accuri C6 | BD Biosciences | BD Accuri C6 | Ogni singolo Ricercatore può utilizzare qualsiasi citometro a flusso preferisca. |
| Software FlowJo | Tree Star, Inc. | FlowJo7.6.5 | Ogni singolo Ricercatore può utilizzare qualsiasi software di analisi preferisca. |
Riferimenti
- Gaskin, D. J., Richard, P. The economic costs of pain in the United States. J Pain. 13 (8), 715-724 (2012).
- Ji, R. R., Berta, T., Nedergaard, M. Glia and pain: Is chronic pain a gliopathy? Pain. 154 (01), S10-S28 (2013).
- Ni, M., Aschner, M., et al. Neonatal rat primary icroglia: isolation....
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Ristampe e permessi
