Un metodo alternativo e validate iniezione per l'accesso ai sottoretinico Spazio via Un approccio Transcleral posteriore

Summary

Le iniezioni sottoretiniche sono la tecnica più comune per somministrare grandi agenti terapeutici come proteine e vettori virali ai fotorecettori e all'epitelio pigmentato retinico. Qui viene descritto un metodo alternativo nei topi che si rivolge con successo allo spazio sottoretinico con danni collaterali minimi e tempi di recupero rapidi.

Abstract

iniezioni sottoretinico sono stati utilizzati con successo in entrambi gli esseri umani e roditori per fornire interventi terapeutici di proteine, agenti virali, e le cellule al interphotoreceptor / vano sottoretinico che ha l'esposizione diretta ai fotorecettori e dell'epitelio pigmentato retinico (RPE). iniezioni sottoretinico di plasminogeno così come recenti studi preclinici e clinici hanno dimostrato la sicurezza e / o efficacia di erogare vettori virali e di cellule staminali per le persone con malattie della retina avanzata. modelli murini di malattie della retina, in particolare ereditaria distrofie retiniche, sono essenziali per testare queste terapie. La procedura di iniezione più comune nei roditori è utilizzare piccola transcorneal o incisioni transcleral con un approccio anteriore alla retina. Con questo approccio, l'ago per l'iniezione penetra la retina neurosensoriale interrompere il RPE sottostante e l'inserimento può facilmente nick la lente, causando opacizzazione della lente e compromissione della imagi non invasivang. Accedere allo spazio sottoretinico attraverso un transcleral, approccio posteriore evita questi problemi: l'ago attraversa la sclera circa 0,5 mm dal nervo ottico, senza penetrazione della retina ed evita interrompere il vitreo. danni collaterali è limitata a quella associata alla sclerotomie focale e gli effetti di un transitorio, sierosa distacco di retina. La semplicità del metodo minimizza lesioni oculari, assicura un rapido riattacco e recupero della retina, e ha un basso tasso di fallimento. Il minimo danno alla retina e RPE consente la chiara valutazione dell'efficacia e degli effetti diretti degli stessi agenti terapeutici. Questo manoscritto descrive una tecnica di iniezione sottoretinico romanzo che può essere utilizzato per indirizzare vettori virali, gli agenti farmacologici, le cellule staminali o cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) allo spazio sottoretinico nei topi con elevata efficacia, danni minimi, e il recupero veloce.

Introduction

Iniezioni sottoretinico sono il mezzo principale di diffondere agenti cellulari e virali per le retine di topi per studiare i loro effetti sui fotorecettori e RPE sottostante ^1,2. La maggior parte dei protocolli di iniezione subretiniche nei topi utilizzano un transcorneal o di un sito di iniezione anteriore transcleral all'equatore (Figura 1). Questo approccio può causare danni collaterali intrinseca che comprende intaccare e opacità risultante della lente, rottura dell'integrità del vitreo, la penetrazione della retina neurosensoriale e iris, emorragia retinica, consistenti distacchi di retina e duratura edema sottoretinico ^3-9. Manipolazioni sperimentali devono superare questi effetti al fine di valutare gli effetti degli interventi terapeutici ^3,7,10,11. Questo studio fornisce una descrizione dettagliata e la validazione di un metodo di iniezione transcleral posteriore che evita queste complicazioni, riduce al minimo il trauma e ha un alto tasso di successo di mira il subspazio della retina.

Le iniezioni di targeting spazio sottoretinico nei topi sono spesso molto difficili da eseguire e la maggior parte ricercatori incontrano una alta frequenza di tentativi falliti in cui il vettore è consegnato in una posizione non corretta o non vi è significativo danni alla retina, per esempio in un distacco della retina completa ^6. Il numero di occhi esclusi dall'analisi a causa di complicazioni di iniezione non è di solito indicata in studi sui topi, ma nella nostra esperienza e nella discussione con altri ricercatori, il numero di iniezioni falliti può essere alto come il 50% e variare a seconda del esperienza e capacità del ricercatore che sta eseguendo le iniezioni. Il successo della iniezione è di solito valutata mediante imaging fundus diretta e / o tomografia a coerenza ottica (OCT) ^7,9. Un metodo facilmente masterizzato con alte percentuali di successo per le iniezioni sottoretiniche nei topi può accelerare la sperimentazione e ridurre il costo di studi preclinici di treatments per le malattie della retina che sono le principali cause di cecità negli Stati Uniti.

Il posteriore, transcleral tecnica di iniezione sottoretinico qui descritto è un adattamento da protocolli clinici e preclinici ^9,12. Le valutazioni diagnostiche non invasive effettuate in topi iniettati dimostrano i danni lievi e altamente localizzato e non hanno l'obiettivo ulteriori garanzie, lesioni della retina e RPE. Inoltre, con relativamente poco pratica, sperimentatore può conseguire questi risultati con un alto tasso di successo (80 - 90% o superiore), riducendo così i costi associati a tali studi. Questa procedura può essere utilizzata per fornire interventi terapeutici cellulari, virali o farmacologici a fotorecettori e / o RPE in studi preclinici e valutare facilmente interventi sperimentali.

Protocol

Animali: tipo selvaggio C57Bl / 6J topi allevati presso l'Università della California a Los Angeles (UCLA). Tutti gli animali erano tra 11-17 settimane di vita, e compresi i topi maschi e femmine. Tutti i topi sono stati alloggiati in gruppo, mantenuto in un ciclo 12:12 chiaro / scuro con cibo e acqua ad libitum. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida istituzionali della UCLA e l'Associazione per la Ricerca e la Visione e Ophthalmology Dichiarazione per l'uso di animali in oftalmica e Vision Research.

NOTA: Tutti i farmaci e gli agenti iniettabili sono United States Pharmacopeia (USP) di grado.

1. Preparazione chirurgica

1. Anestetizzare il mouse con un'iniezione intraperitoneale di 100 mg / kg ketamina e 8 mg / kg xylazina in un mix salina. Somministrare anestesia per una profondità tale che il mouse non ha pinch punta o riflessi tattili corneali.
2. Mantenere la temperatura corporea a 37,0 ° C con un pad acqua circolante.
3. Dilatare gli alunni con 2,5% fenilefrina occhio dROPS e tagliare le basette per facilitare la visualizzazione. Whiskers forniscono significativi input sensoriale al mouse, quindi, basette rifilatura dovrebbe rimuovere solo la parte che blocca l'accesso chiaro ad occhio, e non alla base del baffo. Nella nostra esperienza, i topi mostrano normale recupero dopo questa procedura. Applicare occhio metilcellulosa scende a prevenire la secchezza e ridurre al minimo anestetici indotte cataratta transitorie ^13.
4. Sterilizzare gli strumenti prima dell'intervento chirurgico (cioè, betadine ed etanolo o perline caldi).
5. Preparare fluoresceina diluita (0,01% con soluzione fisiologica 0,9%), in un ambiente sterile (cioè, armadio biosicurezza) se verrà eseguita la visualizzazione (vedere la sezione 3).

2. Preparazione del sito di iniezione

1. Preparare una siringa (ad esempio, 5 microlitri siringa) con il volume appropriato di iniezione (ad esempio 0,3 fino 1.0 mL).
2. Posizionare il mouse così l'occhio è rivolto verso l'alto e chiaramente visibile nella dissecting microscopio.
3. pizzicare delicatamente la congiuntiva temporale con pinza sottile a punta. Effettuare una incisione circonferenziale di circa 90 gradi con le forbici Vännäs curve.
4. Ripetere il passaggio 2.3 con la capsula sottostante del Tenon.
5. Resecare il tessuto connettivo circostante con pinza sottile a punta durante la rotazione del globo per via nasale. Lavorare per il sito di iniezione di circa 0,5 millimetri temporale al nervo ottico. Usare molta attenzione per evitare di interrompere il seno retro-orbitale.

3. sclerotomie e sottoretinico Iniezione

NOTA: Si raccomanda che l'iniezione di 0,01% fluoresceina nel 0,9% Saline essere usato per aiutare con la visualizzazione, mentre l'apprendimento di questa procedura. La distribuzione topografica della fluoresceina può essere efficacemente documentato con immagini fundus (vedi sezione 4).

1. Fai una piccola incisione sclerale al sito di iniezione graffiando leggermente l'oculare con una lama oftalmica 22,5 gradi. Questo shou incisioneLd essere abbastanza grande da permettere alla punta dell'ago di passare attraverso la sclera soltanto.
2. Inserire il smussato 33 ago G (angolato. 5 - 10 ° nel sclerotomie con lo smusso rivolto e angolata parallela alla retina Iniettare volume desiderato (ad esempio, da 0,3 a 1,0 ml di 0,01% fluoresceina a fini di apprendimento).
   NOTA: Mantenere sterilità della siringa accuratamente pulizia con lavaggi successivi di un adatto solvente e acqua deionizzata prima di ciascuna iniezione.
3. Premere il pistone lentamente (oltre ~ 3 sec) senza spostare l'ago e con una pressione uniforme.
   NOTA: quando l'ago è nello spazio sottoretinico, una leggera resistenza verrà sentito mentre si preme lo stantuffo. Non ci sarà per una resistenza minima se l'ago perfora la retina, ed elevata resistenza se l'ago non penetra la sclera o RPE.
4. Attendere alcuni secondi prima di estrarre l'ago per ridurre al minimo il riflusso.
5. Lavare l'occhio con soluzione salina tamponata sterile e garantire l'occhio hcome ruotato nella sua posizione normale.

4. Valutazione di distacco retinico da Office e Retinografia

1. Eseguire l'imaging ottobre immediatamente dopo l'iniezione per valutare la qualità della iniezione e al momento opportuno punti post-iniezione come necessario per valutare la struttura della retina.
   NOTA: Esempi di utilizzo dei PTOM studi simili è stata precedentemente descritta ^7,14.
   1. Regolare e allineare l'immagine di Office per indirizzare il sito di iniezione. Il sito di iniezione deve essere linea mediana e 0,5 millimetri temporale alla testa del nervo ottico. Ripetere se necessario se il distacco è fuori della cornice o meno ottimale centrata.
2. Visualizza distacco della retina e tingere zona di iniezione con bagno en-face immagini fundus ^7,14.
   NOTA: Se un sistema di imaging il PTOM non è disponibile, l'iniezione di una piccola quantità di fluoresceina con un vettore per la pratica consentirà visualizzazione con qualsiasi telecamera fundus che esegue fluoresceina angiografia utilizzando le stesse lunghezze d'onda di eccitazione e blocco filtri. aree localizzate di iper-fluorescenza appariranno sotto il sistema vascolare e il sistema vascolare avranno confini netti e distinti se lo spazio sottoretinico si rivolge in modo corretto. Il bordo della bozza dalla iniezione sarà delimitata dalla transizione da iper a fluorescenza ipo. Diversi strumenti forniscono questa funzionalità per il mouse; la strumentazione usata qui è descritto altrove ^14.

Cura 5. post-operatoria

1. Applicare uno spesso strato di crema tripla oftalmica antibiotica alla superficie della cornea dell'occhio iniettato.
2. Mettere i topi in gabbie pulite solitarie per il recupero. Non combinare i topi che hanno subito un intervento chirurgico fino a quando non sono completamente recuperati.
3. Monitorare la respirazione e la temperatura durante il recupero l'anestesia. Monitorare gli animali fino a che non possono mantenere la decubito sternale.
4. Eseguire ulteriore monitoraggio post-operatorio adeguatoe il trattamento, compresa una iniezione sottocutanea di carprofen (5 mg / kg) per la gestione del dolore post-operatorio.

6. Valutazione della funzione della retina da Elettroretinografia (ERG)

1. Eseguire l'analisi ERG pre-iniezione e al momento opportuno dopo l'iniezione come necessario per valutare la funzionalità della retina. Se l'iniezione è stata fatta nello spazio sottoretinico, il distacco di retina dovrebbe risolvere entro 72 ore.
   1. Utilizzare le tecniche standard ERG per valutare la funzione della retina, prima e dopo l'iniezione come descritto in precedenza ^14,15.

7. La ricostruzione 3D e quantificazione Bleb Volume

NOTA: OCT scansioni con alto contrasto che comprende l'intero distaccamento all'interno della cornice di vista sono ottimali per l'uso. ImageJ / Fiji ^17,18 e Imaris sono stati utilizzati, ma altri software possono essere utilizzati.

1. Esportare il B-scan di interesse, l'importazione di ImageJ / Fiji e delle colture (Immagine> Ritaglia) la porzione di sc ottobreuna a modellare utilizzando lo strumento di selezione rettangolare.
   1. Regolare il contrasto (Immagine> Regola> Luminosità / Contrasto) e delineare eventuali limiti mancanti collegando due sezioni con una linea.
   2. Tracciare una linea retta con il (spostamento di mantenimento) strumento linea che attraversa il RPE allo strato dei fotorecettori. Misura (Analizza> Measure) la lunghezza della linea per ottenere le dimensioni di massima distacco per la fase 7.8.
2. Importa fotogrammi al software 3D-ricostruzione rifilate (Vedi tabella dei materiali) utilizzando il "RGB a grigio" plugin e MATLAB Compiler Runtime.
3. Impostare la dimensione voxel (sotto Proprietà immagine) utilizzando i parametri di calibrazione dalla scansione OCT (x, y, z).
4. Eseguire il plugin "RGB a Gray" (sotto Proprietà immagine), con uguale ponderazione di ogni canale, di creare un quarto canale. Eliminare i canali rosso-verde-blu originali.
5. Invertire il canale di grigio utilizzando cambiamento contrasto. Image Store.
6. Fare clic su "aggiungi unsuperficie ew "pulsante nella scheda 3D-View, e iniziare il processo guidato 4 fase di creazione della superficie.
   1. Impostare il livello di dettaglio della superficie (passaggio 1 di 4).
      NOTA: Nella nostra esperienza 8,0-12,0 era la gamma più efficace.
   2. Impostare la dimensione della sfera massimo (in Selezione Background) leggermente inferiore alla dimensione massima di distacco misurata in 7.1.2. Creare la superficie e annullare l'inversione del canale grigio (fase 2 di 4).
   3. Impostare la soglia al valore massimo per cui la superficie degli spazi negativi esterni della retina e il distacco non venga a contatto (passaggio 3 di 4).
   4. Impostare il tipo di filtro per il numero di voxel e isolare lo spazio negativo nel sito distaccata dimensioni. Finire la superficie (fase 4 di 4).
      NOTA: Il volume della superficie di distacco si trova sotto il volume nella scheda statistiche.

Results

Posteriori approccio iniezioni sottoretiniche transcleral sono state effettuate su 31 occhi sani da 16 topi wild type con iniezioni di 0,3 ml (n = 18), 0,5 ml (n = 8) e 1,0 ml (n = 5) di 0,01% fluoresceina. Un occhio è stato escluso dalla iniezione a causa di una opacità corneale pre-esistente che ha impedito l'analisi strutturale e funzionale. Tutti gli occhi iniettati è incluso in questo rapporto. Nessun distacco della retina non intenzionali, punture della retina neurosensoriale, o pe...

Discussion

iniezioni sottoretiniche sono il metodo di scelta per la fornitura di vettori virali e terapia con cellule staminali di derivazione per manipolare fotorecettori e RPE sia nella ricerca di base e trattamento clinico. Nei pazienti, le iniezioni sottoretiniche sono in genere fatto con un sclerotomie anteriore alla pars plana, una vitrectomia nucleo posteriore e la penetrazione della retina per l'ago con visualizzazione diretta. Come con la maggior parte delle procedure vitrectomia, è comune per la formazione di catarat...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hamilton Modello 62 RN SYR	Hamilton	87942	Siringa x 1
Hamilton Ago 33 G, 1.0", 20 DEG, punto 3 (acciaio inossidabile 304)	Hamilton	7803-05	Aghi x 6
Vannas Forbici curve	Ted Pella, INC.	1347	Lama da 5 mm
Coltello per microchirurgia da 22,5 gradi	Wilson Ophthalmic Corp.	91204
Ketaject	Phoenix	NDC 57319-609-02	Ketamina
Anased	Lloyd Laboratories	NDC 61311-482-10	Xilazina
Fluoresceina 10% AK-Fluor	Akorn	NDC 17478-253-10	100 mg/ml
0,9% Soluzione salina USP	Hospira	NDC 0409-4888-50	0,9% NaCl
Unguento antibiotico	Akorn	NDC 17478-235-35	oftalmica
Pompa di circolazione	Gaymar	TP-500 T/Pump	P/N 07999-000
sd-OCT	Bioptigen	R-Series	Commercial
Fundus Camera	Phoenix Research Laboratories	Pinzette MICRON III
Tipo 3	Ted Pella, INC.	5385-3SU
2,5% Fenilefrina	Paragon BioTeck	NDC 42702-102-15	Oftalmico
IMARIS8	Bitplane		Versione 8.1.2
ImageJ	NIH		V1.8.0_77
Ipromellosa... 2,5%	Goniovisc	AX0401	Gocce
oculari di metilcellulosa (risciacquo)	Bausch & Lomb		soluzione salina
Microscopio	Zeiss	Stemi 2000	Microscopio
Sorgente luminosa	Fostec	P/N 20520	Sorgente luminosa