Visualizzare gli effetti di espettorato su biofilm di sviluppo utilizzando un modello Chambered coprioggetti

Summary

Questo protocollo descrive la visualizzazione dello sviluppo del biofilm in seguito all'esposizione a fattori ospiti utilizzando un modello a camera di vetrini. Questo modello consente la visualizzazione diretta dello sviluppo del biofilm e l'analisi dei parametri del biofilm utilizzando programmi software per computer.

Abstract

I biofilm sono costituiti da gruppi di batteri racchiusi in una matrice di auto-secreto. Essi svolgono un ruolo importante nella contaminazione industriale e nello sviluppo e la persistenza di molte infezioni salute correlati. Uno dei biofilm più ben descritti e studiati nelle malattie umane avviene in infezione cronica polmonare dei pazienti affetti da fibrosi cistica. Studiando biofilm nel contesto dell'ospite, molti fattori possono influenzare la formazione e lo sviluppo del biofilm. Al fine di individuare come fattori dell'ospite possono influenzare la formazione di biofilm e sviluppo, abbiamo usato un metodo coprioggetti Chambered statica a crescere biofilm in presenza di fattori dell'ospite-derivati ​​in forma di surnatanti espettorato. I batteri sono seminate nelle camere e esposti a filtrati espettorato. Dopo 48 ore di crescita, biofilm sono macchiate di un biofilm kit commerciale viabilità prima di microscopia e analisi confocale. A seguito di acquisizione delle immagini, le proprietà biofilm possono essere valutati utilizzando piattaforme software differenti.Questo metodo ci permette di visualizzare le proprietà principali della crescita di biofilm in presenza di sostanze diverse, tra cui antibiotici.

Introduction

biofilm batterici sono gruppi di microrganismi che sono attaccati l'uno all'altro e racchiuso in una matrice di auto-secreta. ^1,2 Classicamente, rappresentano i batteri fisicamente collegati a una superficie abiotico o biotico formata in condizioni di flusso. I biofilm hanno anche dimostrato di crescere in condizioni statiche (assenza di flusso) e distale da superfici, come ad esempio all'interfaccia aria-liquido di piscine termali o pellicole formate in provetta. Questi biofilm sono da tempo riconosciuti nell'ambiente e sono un grande danno per processi industriali, in quanto possono formare in serbatoi di acqua o in tubi, con conseguente ....

Protocol

Si noti che la ricerca Consiglio di etica (REB) è necessario per raccogliere e conservare campioni di espettorato da soggetti umani. Questi studi sono stati approvati dal Hospital for Sick Children REB # 1.000.019,444 mila.

1. preparazione dei campioni dell'espettorato CF

1. Raccogliere campione di espettorato dai pazienti durante le visite di routine alla clinica fibrosi cistica e tenere in ghiaccio.
2. Trasporto del campione di espettorato sul ghiaccio entro la prima ora di raccolta, al laboratorio di ricerca, di sottoporsi a trattamento.

2. dell'espettorato Processing

1. ....

Results

Il disegno complessivo di questo esperimento è rappresentata in figura 1. L'uso di questo protocollo fornisce un metodo conveniente per visualizzare le variazioni di biofilm coltivate per diversi periodi di tempo (ad esempio, 24, 48 o 72 hr). È importante sottolineare che i segnali esogeni, quali espettorato filtrati, possono essere aggiunti per visualizzare i cambiamenti nello sviluppo biofilm. Come si vede nella figura 2, la presenza del 10% f.......

Discussion

I metodi qui descritti consentono la visualizzazione dei biofilm batterici cresciute in presenza di prodotti esogeni. Non sorprendentemente, la produzione dei exoproducts è di importanza quando si utilizza questo tipo di sistema. Per esempio, ditiotreitolo (DTT), è spesso usato su campioni di espettorato umani per aiutare a liquefare i campioni. Tuttavia, l'effetto di DTT solo può diminuire sviluppo biofilm e vitalità (dati non mostrati). Quindi, controlli appropriati per tutte le condizioni sono necessarie. Inoltre.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lab-Tek II Coverglass a camera, borosilicato #1.5, 8 pozzetti	Thermo Sicher Scientific	155409
Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit	Thermo Fisher Scientific	L10316
Piastre per agar sanguigno	Thermo Fisher Scientific	R10215	Conferma della vitalità tramite conta CFU o selezione di colonie per l'inoculazione
COMSTAT	Software disponibile online		COMSTAT è un software per l'analisi delle immagini del biofilm. Disponibile www.comstat.dk
Millers LB Broth	Thermo Fisher Scientific	12780-052	Terreni standard per la crescita notturna di gowth/biofilm
Filtri per siringhe Millex-GV	Millipore	SLGV013SL	Filtraggio dei supernants dell'espettorato
Soluzione salina tamponata con fosfato (Dulbecco A)	Oxoid	BR0014G	Lavaggio delle camere del biofilm dopo la rimozione del terreno
Zeiss AxioVert 200M	Carl Zeiss
Hamamatsu C9100-13 EM-CCD	QS Technologies Inc.
Spectral Borealis	Qs Technologies Inc.
Perkin Elmer Volocity	QS Technologies Inc.		Le istruzioni per questo software sono disponibili all'indirizzo: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf