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Articolo metodologico

Una piattaforma di test anti-biofilm Adatto per l'esplorazione del Biblioteche composto naturale

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⸱

DOI:

10.3791/54829

⸱

27 dicembre 2016

 ,  , 
1Pharmaceutical Design and Discovery (PharmDD), Faculty of Pharmacy, University of Helsinki

In questo articolo

Sommario

Le infezioni da biofilm mostrano un'alta tolleranza alla chemioterapia. Nessun singolo test è in grado di catturare la complessità dei biofilm. Invece, sono necessari saggi complementari. Presentiamo una piattaforma di screening (sviluppata per S. aureus) che combina saggi di vitalità, biomassa e matrice di biofilm. Consente la scoperta di farmaci anti-biofilm, compresa la valutazione degli effetti chemioterapici a lungo termine.

Abstract

I biofilm sono considerati come uno dei temi più impegnativi della moderna biomedicina, e sono potenzialmente responsabili di oltre l'80% delle infezioni antibiotico-tolerant. I biofilm hanno mostrato un livello eccezionalmente alto di tolleranza per la chemioterapia, che è pensato per essere multifattoriale. Per esempio, la matrice fornisce una barriera fisica che diminuisce la penetrazione di antibiotici nel biofilm. Inoltre, le cellule all'interno dei biofilm sono fenotipicamente diverse. Probabilmente, biofilm resilienza deriva da una combinazione di questi e altri, ancora sconosciute, meccanismi. Tutti gli antibiotici attualmente esistenti sono stati sviluppati contro singole cellule-batteri (planctonici). Pertanto, finora, un repertorio molto limitato di molecole esiste che può selettivamente agire su biofilm maturi. Questa situazione ha portato un cambiamento di paradigma progressiva scoperta di nuovi farmaci, in cui la ricerca di anti-biofilm è stata invitata ad occupare un posto più prominente. Una sfida ulteriore è che ci sono unnumero di metodi standardizzati per la ricerca biofilm, in particolare quelli che possono essere utilizzati per lo screening su larga rendimento di librerie chimiche molto limitato. Qui, una piattaforma anti-biofilm sperimentale per lo screening chimico è presentato. Colorazione Esso utilizza tre metodi per misurare la vitalità del biofilm (con resazurina colorazione), biomassa totale (con colorazione cristallo viola), e la matrice del biofilm (utilizzando un agglutinine di germe di grano, WGA-fluorescenza a base di poli-N acetil-glucosamina, PNAG , frazione). Tutti i saggi sono stati sviluppati usando Staphylococcus aureus come i batteri modello. Esempi di come la piattaforma può essere utilizzata per lo screening primario e per la caratterizzazione funzionale identificati risultati anti-biofilm sono presentati. Questa sequenza sperimentale inoltre consentito la classificazione dei risultati basati sui punti finali misurati. Esso fornisce anche informazioni sulle loro modalità di azione, in particolare sul lungo termine rispetto agli effetti chemioterapici a breve termine. Pertanto, è molto advantageous per la rapida identificazione di composti di successo di alta qualità che possono servire come punto di partenza per varie applicazioni biomediche.

Introduzione

I batteri possono passare tra due diversi stili di vita, planctonici e sessili, di cui un biofilm è l'esempio più comune. In biofilm, batteri formano comunità strutturate annegate in una matrice di auto-prodotto 1. Questa matrice autoprodotto è una barriera tra i batteri e l'ambiente esterno, e protegge le cellule microbiche, mantenendoli in prossimità. La composizione della matrice biofilm varia tra e persino all'interno delle specie, ma consiste principalmente di una fitta rete di lipopolisaccaridi, DNA extracellulare e proteine. La matrice serve come barriera fisica inibendo l'ingresso di agenti nocivi, ma protegge anche il biofilm dalla disidratazione e impedisce la fuoriuscita nutrienti cella 2.

I biofilm sono considerati come uno dei temi più impegnativi della moderna biomedicina, e sono presumibilmente responsabili di oltre l'80% delle infezioni antibiotico-tolerant 3. essi DISPgettare un intrinsecamente un'elevata tolleranza contro le minacce esterne: umidità, pressione osmotica, stress meccanico 4, calore, radiazioni UV 5, disinfettanti, agenti antimicrobici, e l'host del sistema immunitario 1. Ad esempio, la concentrazione dell'agente antimicrobico richiesto richiesto per uccidere un biofilm ha dimostrato di essere fino a 1000 volte superiore rispetto a quella richiesta per uccidere i batteri planctonici. La spiegazione di questa tolleranza superiore sembra essere multifattoriale. La matrice fornisce una barriera fisica che diminuisce la penetrazione di antibiotici nel biofilm. Inoltre, le cellule all'interno dei biofilm sono fenotipicamente diversi; la fase di transizione tra stati metabolici causa di un gradiente esistente di ossigeno, nutrienti e metaboliti tra le parti interne ed esterne del biofilm 6. Pertanto, in alcune regioni biofilm, come il nucleo, i batteri sono privati ​​di ossigeno e nutrienti e vivono in un metabolicamente meno attivo o uno stato completamente dormiente 7. Le cellule dormienti completamente sono indicati come cellule persister, e non sono suscettibili di convenzionali trattamenti antimicrobici 8. Pertanto, è probabile che biofilm resilienza deriva da una combinazione dei meccanismi attualmente proposti e altri, ancora sconosciute. Staphylococcus spp. sono ancora tra i batteri gram-positivi più problematici, causando gravi, spesso biofilm-correlati, infezioni 4. Si suggerisce che fino al 99% di tutti i batteri sono associati all'interno di biofilm, il che rende lo stile di vita batterica predominante 3. Tuttavia, tutti gli antibiotici attualmente esistenti sono stati sviluppati contro batteri (planctonici) unicellulari. Finora, un repertorio molto limitato di molecole esiste che può selettivamente agire su biofilm maturi. Questa situazione ha portato un cambiamento di paradigma progressiva scoperta di nuovi farmaci, in cui la ricerca di anti-biofilm è stata invitata ad occupare un posto più prominente.

Da un methodologprospettiva iCal, esistono ulteriori sfide, come solo un numero limitato di metodi di biofilm sono stati sviluppati da organismi di normazione, in particolare quelle applicabili al high-throughput screening di librerie chimiche. Tutti i test standardizzati (con una sola eccezione) sono basate su reattori a biofilm, e questi metodi richiedono grandi volumi di lavoro e di grandi quantità di composti da testare, che di solito sono disponibili durante la fase iniziale di sperimentazione 9-12. Il test di screening-applicabile standardizzato solo esistente è il cosiddetto dispositivo Calgary Biofilm, da cui il sistema commercialmente disponibile minimo biofilm eliminando concentrazione (MBEC) è stato sviluppato 13-15. Tuttavia, la limitazione di questo saggio è che il biofilm sono coltivate su pioli, e non tutte le specie batteriche o anche ceppi della stessa specie sono in grado di formare biofilm su questo dispositivo. Inoltre, metodi che possono essere particolarmente applicati all'esplorazione di composti naturali sononecessario. Prodotti naturali sono stati la fonte principale per l'innovazione nella scoperta di farmaci antimicrobici nel corso dell'ultimo secolo 16. Essi possono fornire composti anti-biofilm nuovi meccanismi d'azione unici che possono anche essere efficaci contro le cellule persister. Così, l'esplorazione di librerie naturali e naturalmente ispirati ha alte probabilità di produrre cavi anti-biofilm promettenti e uniche.

Qui, presentiamo i dettagli sperimentali di una piattaforma di test che è stato sviluppato per la proiezione chimica dei composti anti-biofilm utilizzando tre metodi per misurare gli effetti sulla vitalità, biomassa totale, e la matrice di biofilm Staphylococcus aureus. Il primo test misura biofilm vitalità, e si basa su resazurina colorazione. Resazurina è una macchia redox che è blu e non fluorescente nel suo stato ossidato e si trasforma in rosa resorufina, altamente fluorescenti quando ridotto l'attività metabolica dei batteri. E 'molto semplice e veloce metodo adatto per proiezioni primari 17-20. Il secondo test, basato su cristalli colorazione violetta, misura massa totale biofilm. Cristallo viola è una macchia ampiamente utilizzato per lo studio di batteri e batteri nel biofilm 19,21-23. Il test è basato su reagenti poco costosi e ha una lettura semplice assorbanza finale. Infine, il terzo test rivolge la sostanza polimerica extracellulare (EPS) -matrix del biofilm tramite germe di grano agglutinina (WGA), che si lega specificamente alla poli- N residui acetil-glucosammina (PNAG) presenti nella matrice del biofilm stafilococciche 24. Il WGA è coniugato con un fluoroforo che può essere rilevato con i lettori intensità di fluorescenza 25. Vi presentiamo qui le motivazioni e dettagli della piattaforma abbiamo sviluppato, con esempi di applicazioni.

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Protocollo

1. Crescere i batteri

  1. Pre-cultura i batteri durante la notte in un brodo di soia trittico (TSB) a 37 ° C con 220 giri al minuto scuotendo (16-18 ore).
  2. Diluire il pre-coltura 100-1.000 volte (a seconda del tasso di crescita dei batteri, qui, 1000 volte viene utilizzato per S. aureus) in fresco TSB e lasciate crescere a 37 ° C e 200 rpm per raggiungere crescita esponenziale (ottica densità a 595 nm (OD 595) tra 0,2 e 0,6).
    NOTA: Questo passaggio richiede l'ottimizzazione specifica per ceppo.

2. formazione di biofilm: Pre e post-esposizione

  1. Diluire le esponenzialmente cresciute cultura 100 volte (questo equivale a circa 10 6 unità formanti colonia per millilitro (CFU / ml)).
  2. Protocollo di pre-esposizione
    1. Per i campioni di controllo non trattati, aggiungere 200 microlitri della coltura batterica diluito per pozzetto di una piastra da 96 micropozzetti sterile.
    2. Aggiungere 4 ml di un composto di prova o un controlloantibiotici (soluzione 50x magazzino) e 196 ml di coltura batterica diluito per pozzetto.
    3. Incubare a 37 ° C su un agitatore a 200 rpm per 18 ore.
      Nota: Qui usiamo uno shaker con un'orbita 2 mm.
  3. Protocollo post-esposizione
    1. Per tutti i campioni, aggiungere 200 microlitri della coltura batterica diluito per pozzetto di una piastra da 96 micropozzetti sterile.
    2. Incubare a 37 ° C su un agitatore a 200 rpm per 18 ore.
      Nota: Qui usiamo uno shaker con un'orbita 2 mm.
    3. Rimuovere l'intera soluzione planctonici con attenzione, senza toccare il biofilm, usando una pipetta multicanale.
    4. Aggiungere 4 ml di un composto in esame o di un antibiotico di controllo (50x soluzione stock) e 196 ml di TSB per bene.
    5. Incubare a 37 ° C su un agitatore a 200 rpm per altre 24 ore.
      Nota: Qui usiamo uno shaker con un'orbita 2 mm.

3. resazurina colorazione Protocol per la valutazione vitalità dei biofilm

  1. Preparare una soluzione stock di 0,1 mg / ml resazurina (0,4 mm) in PBS sterile. Mantenere questo stock sterili, al riparo dalla esposizione alla luce, e a 4 ° C.
  2. Diluire il resazurina magazzino 1:50 in sterile PBS (PBS) per ottenere una concentrazione finale di 20 micron.
  3. Trasferire l'intera soluzione planctonici (lasciando i biofilm nei pozzetti) con attenzione, senza toccare i biofilm o la creazione di bolle d'aria, ad una, pulire la piastra a 96 pozzetti separati con una pipetta multicanale.
  4. Lavare i biofilm una volta con PBS sterile con l'aggiunta di 200 pl per pozzetto, e rimuoverlo con cura utilizzando una pipetta multicanale.
  5. Aggiungere 200 microlitri della resazurina diluito per pozzetto della piastra di biofilm con una pipetta multicanale.
  6. Incubare al buio, a temperatura ambiente (RT), e 200 giri al minuto, l'agitazione per circa 20 minuti fino a quando i controlli non trattati biofilm sono uniformemente rosa.
  7. Misurare la fluorescenza aλ = exc 560 nm e λ em = 590 nm con un lettore di piastre (in alto lettura).

4. cristallo viola Protocollo di colorazione per la biomassa Quantificazione dei biofilm Utilizzando la stessa piastra come al punto 3

  1. Rimuovere la macchia resazurina con attenzione dai pozzi usando una pipetta multicanale.
  2. Fissare i biofilm con 200 ml di metanolo per 15 min.
  3. Lasciare la piastra aria secca per 10 minuti.
  4. Aggiungere 190 ml di 0,02% (vol / vol, diluito in acqua deionizzata) soluzione di cristallo viola, con cura usando una pipetta multicanale. Evitare di toccare i lati dei pozzetti con la macchia mentre pipettaggio e prevenire la formazione di bolle d'aria non premendo la pipetta per completare blow-out.
  5. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
  6. Rimuovere la macchia con attenzione, usando una pipetta multicanale.
  7. Lavare due volte con acqua deionizzata (200 ml ogni volta).
  8. Lasciate che i pozzi asciugare per 5 minuti a temperatura ambiente e si dissolvono la macchia rimanentein 96% di etanolo o acido acetico 33%.
  9. Incubare per 1 ora a RT e leggere l'assorbanza a 595 nm.

5. Valutare l'effetto battericida sui batteri planctonici Utilizzando il piatto del campione Come per i biofilm

  1. Misurare la torbidità a 595 nm della piastra con la soluzione planctonici da 3.3.
  2. Colorare i batteri planctonici con resazurina con l'aggiunta di 10 ml di resazurina magazzino per pozzetto. Mescolare bene pipettando.
  3. Incubare è al buio a temperatura ambiente per circa 5 minuti, fino a quando i controlli non trattati sono uniformemente rosa.
  4. Misurare la fluorescenza a λ = exc 560 nm e λ em = 590 nm.

6. Germe di Grano Agglutinin colorazione per Matrix quantificazione e microscopia a fluorescenza Imaging di biofilm

  1. Matrix quantificazione
    1. Preparare una soluzione / ml 5 mcg della sonda WGA in PBS sterile.
    2. Utilizzare un pla campione paralleloTE per questa colorazione. Rimuovere la soluzione planctonici dai pozzetti e lavare una volta con PBS sterile (200 pl per pozzetto), con cura utilizzando una pipetta multicanale senza toccare i biofilm.
    3. Aggiungere 200 ml di soluzione di WGA per bene da colorare.
    4. Incubare è al buio a 4 ° C per 2 ore.
    5. Rimuovere la macchia non legato lavando i pozzetti con 200 ml di PBS per tre volte.
    6. Lasciare la piastra a secco per 15 minuti a RT.
    7. Sciogliere la macchia rilegato in acido acetico 33%, con 200 ul per pozzetto.
    8. Sigillare i pozzetti con tappi di strip e sonicare utilizzando un sonicatore bagnomaria per 30 secondi a temperatura ambiente e 40 kHz.
    9. Incubare la piastra per 1 ora a RT.
    10. Ripetere il passaggio sonicazione. I pozzi possono rimanere sigillato tra i gradini sonicazione.
    11. Misurare la fluorescenza a λ ex = 495 nm e λ em = 520 nm con un lettore di piastre (in alto lettura).
  2. Visualizzare la matrice conmicroscopia a fluorescenza
    1. Utilizzare lo stesso protocollo di cui sopra fino al punto 6.1.6.
    2. Dopo la fase di essiccazione, visualizzare i campioni con un microscopio a fluorescenza, utilizzando un filtro FITC (o altro idoneo filtro di eccitazione verde).

7. colorazione cellule vitali e morti all'interno del biofilm di Imaging con microscopia a fluorescenza e quantificazione del segnale per il Green-to-rosso-ratio (G / R)

  1. Imaging con microscopia a fluorescenza
    1. Preparare una soluzione di ogni sonda (cellule vitali uno di colorazione e le altre cellule morte una colorazione), secondo le linee guida del produttore.
    2. Rimuovere la soluzione planctonici dai pozzetti e lavare una volta con PBS sterile (200 ml per pozzetto) usando una pipetta multicanale.
    3. Aggiungere 6 ml di soluzione colorante per pozzetto.
    4. Incubare la piastra al buio per 15 minuti.
    5. Prima del microscopio, rimuovere il liquido in eccesso manually usando una pipetta multicanale.
    6. Catturare le immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza, utilizzando ad esempio un filtro FITC (per fluorescenza verde, cellule vitali) o un filtro TRITC (fluorescenza rossa, cellule morte).
  2. Quantificazione del segnale come verde a rosso-fluorescenza ratio (G / R)
    1. Seguire lo stesso protocollo in passi 7.1.1 e 7.1.2.
    2. Aggiungere 200 microlitri della soluzione colorante per bene e incubare per 15 minuti al buio.
    3. Misurare la fluorescenza con un lettore di piastre a eccitazione lunghezza d'onda / emissione 485/535 nm e 485/635 per la fluorescenza verde e rosso, rispettivamente (Reading).

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Risultati

Nella piattaforma proposta, gli effetti sulla vitalità, la biomassa, e la matrice del biofilm sono quantificati. Nella sequenza di lavoro (figura 1), una piastra campione viene trattata con resazurin e successivamente con cristalvioletto per valutare contemporaneamente gli effetti sulla vitalità batterica biofilm e sulla biomassa totale biofilm. Entrambi i saggi possono essere eseguite consecutivamente nella stessa piastra perché è stato dimostrato in precedenza che una ...

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Discussione

Non esiste un unico metodo che può misurare simultaneamente l'effetto di un composto sulla viabilità, biomassa e matrice di biofilm. Pertanto, vi è la necessità per combinare saggi per rilevare un effetto sui tre endpoint, preferibilmente in una fase screening primario.

Resazurina è molto semplice protocollo di colorazione costituito solo l'aggiunta della sonda redox. Tuttavia, stabilire il tempo di incubazione ottimale dei biofilm con il resazurina è cruciale per il successo di ques...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano il professor Paul Cos e LMPH, Università di Anversa, in Belgio per il suo supporto durante il processo di ripresa nel suo laboratorio. Questo lavoro è stato finanziato dalla Academy of Finland progetti (progetti 272.266 e 282.981) e Svenska Tekniska Vetenskapsakademien i Finlandia. I contributi tecnici del Master Janni Kujala sono riconosciuti.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
ResazurinSigma AldrichR7017
Cristallo violaSigma AldrichHT90132 
Germe di Grano Agglutinina, Alexa Fluor 488 ConiugatoThermo Fisher ScientificW11261
LIVE/DEAD BacLight Sonde molecolariL7012SYTO 9 per la colorazione di cellule vitali verde e ioduro di propidio per la colorazione di cellule morte rosso
salina
Triptone agar di soiaLab M, NeogenLAB011
Brodo di soia triptinaLab M, NeogenLAB004
F96 Piastra a pozzetti Polistirene sterile Trasparente Fondo piattoThermo Fisher Scientific161093
Tappi BRAND, strisce da 8Sigma AldrichBR781413-300EA
Branson serie CPX bagno ad ultrasuoniSigma AldrichZ769428-1EA
MultipipettaThermo Fisher Scientific
Dispenser multigocciaThermo Fisher Scientific
Biomek 3000Beckman Coulter
Lettore multipiastra Varioskan FlashThermo Fisher Scientific
Staphylococcus aureusATCC Codice 25923
Soluzione tamponata con fosfato

Riferimenti

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