È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Misura della differenzialmente metilato

5.7K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/54838

⸱

21 dicembre 2016

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, IU Center for Diabetes and Metabolic Disease, Indiana University School of Medicine, 2Department of Pediartics, Omaha Children's Hospital and Medical Center, University of Nebraska Medical Center, 3Departments of Biochemistry and Molecular Biology, Medicine, and Cellular and Integrative Physiology, IU Center for Diabetes and Metabolic Disease, Indiana University School of Medicine, 4Indiana Biosciences Research Institute

In questo articolo

Sommario

la morte cellulare β delle isole precede lo sviluppo del diabete di tipo 1 e il rilevamento di questo processo può consentire un intervento terapeutico precoce. Qui, forniamo una descrizione dettagliata di come misurare le specie di DNA INS differenzialmente metilate nel siero umano come biomarcatore della morte cellulare β.

Abstract

Si ritiene che la morte delle cellule β insulari sia alla base della patogenesi di praticamente tutte le forme di diabete e che preceda lo sviluppo dell'iperglicemia franca, specialmente nel diabete di tipo 1. Lo sviluppo di biomarcatori sensibili e affidabili della morte cellulare β può consentire un intervento terapeutico precoce per prevenire o ritardare lo sviluppo del diabete. Recentemente, diversi gruppi, tra cui il nostro, hanno riportato che il DNA libero da cellule e differenzialmente metilato che codifica per la preproinsulina (INS) in circolazione è correlato alla morte cellulare β nel diabete pre-tipo 1 e nel diabete di tipo 1 di nuova insorgenza. Qui, presentiamo un protocollo passo-passo che utilizza la PCR digitale per la misurazione del DNA INS libero da cellule che viene metilato in modo differenziale alla citosina in posizione -69 bp (rispetto al sito di inizio trascrizionale). Dimostriamo che il test è in grado di distinguere tra citosina metilata e non metilata in posizione -69 bp, è lineare su diversi ordini di grandezza, fornisce una quantificazione assoluta del numero di copie del DNA e può essere applicato a campioni di siero umano da individui con diabete di tipo 1 di nuova insorgenza e controlli liberi da malattia. Il protocollo qui descritto può essere adattato a qualsiasi specie di DNA per la quale si desidera rilevare citosine metilate differenzialmente, sia dalla circolazione che da cellule e tessuti isolati, e può fornire una quantificazione assoluta dei frammenti di DNA.

Introduzione

Il diabete di tipo 1 (diabete di tipo 1) è una malattia autoimmune che si caratterizza per la distruzione di isolotto che producono insulina β cellule da parte delle cellule T autoreattive 1. La diagnosi di diabete di tipo 1 è in genere effettuato al momento della misurazione della (glicemia> 200 mg / dl) iperglicemia in una magra, giovane individuo, che potrebbe presentarsi con chetoacidosi come prova di deficit di insulina. Al momento della diagnosi di diabete di tipo 1, vi è evidenza di sostanziale perdita della funzione delle cellule β e la massa (dal 50 - 90%) 2. Negli studi clinici, diversi farmaci modulatori immunitario che sono stati istituiti al momento della diagnosi ha portato alla stabilizzazione della funzione delle cellule β (e presumibilmente di massa), ma nessuno ha portato a remissione clinica della malattia, una scoperta che ha sollevato la chiamata per lo sviluppo di biomarcatori per la diagnosi precoce della malattia e per il tracciamento longitudinale efficacia di terapie combinate 3,4. Gli sforzi da consorzi internazionali, come ad uns Consorzio Research Network Islet Umana presso il National Institutes of Heath 5, hanno sottolineato la necessità di sviluppare biomarcatori che si concentrano sullo stress delle cellule β e la morte nel diabete di tipo 1.

In linea con questi sforzi, il nostro gruppo ed altri hanno recentemente sviluppato test biomarker che misurano circolanti, frammenti di DNA epigeneticamente modificati che nascono principalmente da morire le cellule beta 6-9. In tutti i saggi pubblicati fino ad oggi, il focus è stato sul quantificazione del gene umano codifica preproinsulina (INS), che dimostra maggiori gradi di non metilato siti CpG nelle regioni codificanti e promotore rispetto ad altri tipi di cellule. La liberazione di non metilato frammenti di DNA INS stato ipotizzato come derivanti principalmente dalla morte (necrosi, apoptosi) delle cellule beta. I nostri studi recenti hanno dimostrato che in gioventù, l'innalzamento di DNA sia metilato e metilato INS in posizione -69 bp (rispetto a tegli trascrizionale inizio sito) sono stati osservati in nuova insorgenza diabete di tipo 1, e insieme servito biomarcatori come specifici per questa popolazione 6. Questi dosaggi biomarker comportano l'isolamento di DNA cell-free dal siero o plasma utilizzando kit di spin commerciali, seguita da una conversione bisolfito del DNA isolato (per convertire cytosines non metilato per uracils, lasciando cytosines metilati intatto).

In questo rapporto, descriviamo gli aspetti tecnici della raccolta dei campioni di siero, l'isolamento del DNA cell-free dal siero, la conversione bisolfito, e le prestazioni di goccioline PCR digitale (d'ora in poi, PCR digitale) per differenziale metilato INS DNA.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

Dichiarazione etica: I protocolli sono stati approvati dall'Indiana University Institutional Review Board. I genitori dei soggetti hanno fornito il consenso informato scritto e i bambini di età superiore ai 7 anni hanno fornito il consenso alla loro partecipazione.

1. Lavorazione del siero

NOTA: Il test descritto è stato rigorosamente testato utilizzando siero umano isolato come segue.

  1. Raccogliere il sangue in una provetta per la raccolta del sangue con tappo rosso (senza additivi; non rivestita).
  2. Lasciare riposare a temperatura ambiente per 30 minuti per consentire la formazione del coagulo.
  3. Provetta da centrifuga a 2.000 x g per 10 min a temperatura ambiente. Trasferire il surnatante (siero) in una nuova provetta destinata alla conservazione del siero (provette in polipropilene con tappo a vite, dimensioni dipendenti dai campioni).
  4. Conservare i campioni a -80 ºC fino al momento dell'isolamento del DNA.

2. Estrazione del DNA del siero

NOTA: Il DNA viene estratto con un kit di estrazione del DNA utilizzando 50 μl di siero (consigliato), seguendo il protocollo del produttore con alcune modifiche.

  1. Preparare 200 μl di tampone di lisi + 1 μl di poli(A) (5 μg) per campione in una provetta da microcentrifuga. Vortice per 15 sec. Mettere da parte fino al passaggio 2.3.
  2. Prelevare campioni di siero dal congelatore a -80 ºC e scongelare a temperatura ambiente. Portare il volume del campione di siero fino a 200 μl totali utilizzando soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, con cloruro di calcio e cloruro di magnesio).
  3. Lisi il campione aggiungendo 20 μl di proteasi (1,4 unità Anson/ml) al campione, seguito da 200 μl di tampone di lisi/miscela di poliA (dal passaggio 2.2) e vortice per 8 secondi. Incubare il campione a 56 °C per 10 minuti, quindi centrifugare brevemente per 7 secondi alla massima velocità in una microcentrifuga (>10.000 x g).
  4. Far precipitare il DNA aggiungendo 230 μl di etanolo al 100% al campione e agitare per 8 secondi. Centrifugare brevemente per 7 secondi alla massima velocità (>10.000 x g).
  5. Applicare il DNA alla colonna di centrifuga aggiungendo 600 μl di miscela di campioni alla mini colonna di centrifuga. Centrifugare a 6.000 x g per 1 min. Eliminare il flusso e posizionare la colonna in un tubo pulito.
  6. Lavare il DNA aggiungendo 500 μl di tampone di lavaggio 1 alla colonna. Centrifugare a 6.000 x g per 1 min. Eliminare il flusso e posizionare la colonna in un tubo pulito. Aggiungere 500 μl di tampone di lavaggio 2 alla colonna e centrifugare alla massima velocità (>10.000 x g) per 3 minuti. Posizionare la colonna in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 ml e centrifugare nuovamente alla massima velocità per 1 minuto.
  7. Eluire il DNA posizionando la colonna in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 ml e aggiungendo 60 μl di tampone di eluizione direttamente sul filtro. È importante cambiare i puntali da un campione all'altro per evitare la contaminazione incrociata. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti, quindi centrifugare a 6.000 x g per 1 minuto. Aggiungere altri 60 μl di tampone di eluizione e centrifugare a 6.000 x g per 1 minuto.
  8. Conservare il DNA a -20 ºC per un uso successivo o procedere immediatamente alla conversione del bisolfito.

3. Conversione del bisolfito

NOTA: La conversione del bisolfito viene eseguita utilizzando un kit di conversione del bisolfito, seguendo il protocollo del produttore con alcune modifiche.

  1. Per convertire le citosine non metilate in uracili, aggiungere 130 μl di reagente di conversione del bisolfito a 20 μl di DNA dal passaggio 2.7 in una provetta per PCR (provetta singola per PCR da 0,2 ml o provette per PCR a 8 strisce). Conservare i restanti 40 μl di DNA per un uso futuro o per utilizzarlo in reazioni replicate. Mescolare 20 volte pipettando su e giù e centrifugare brevemente per assicurarsi che non vi siano gocce sui lati o sul coperchio. Incubare a bagnomaria o termociclatore come segue: 98 °C per 8 min, 54 °C per 60 min, 4 °C per 5 min.
    1. Procedere al passaggio 3.2 o conservare a 4 °C per un massimo di 20 ore.
  2. Aggiungere 600 μl di tampone legante alla colonna di centrifuga e posizionare la colonna nella provetta di raccolta fornita. Applicare il DNA bisolfulato sulla colonna e mescolare pipettando su e giù 10 volte. Centrifugare alla massima velocità (>10.000 x g) per 30 sec. Scartare il flusso.
  3. Lavare il DNA aggiungendo 100 μl di tampone di lavaggio alla colonna e centrifugare alla massima velocità (>10.000 x g) per 30 secondi.
  4. Eseguire la desolfonazione per rimuovere il gruppo solfonato per finalizzare la conversione delle citosine non metilate in uracile aggiungendo 200 μl di tampone di desolfonazione alla colonna. Lasciare riposare a temperatura ambiente per 20 minuti, quindi centrifugare alla massima velocità (>10.000 x g) per 30 secondi.
  5. Lavare il DNA aggiungendo 200 μl di tampone di lavaggio alla colonna e centrifugare alla massima velocità per 30 secondi. Eliminare il flusso continuo e ripetere questa fase di lavaggio.
  6. Posizionare la colonna in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Eluire il DNA aggiungendo 10 μl di tampone di eluizione direttamente al filtro della colonna. Incubare per 1 minuto. Centrifugare per 30 s alla massima velocità per eluire il DNA. Quantificare il DNA recuperato mediante spettrofotometria ad A260.
    NOTA: Il DNA rilevato dalla spettrofotometria rappresenta principalmente il DNA poliA trasportatore che è stato aggiunto al passaggio 2.3 sopra. Tipicamente, il recupero del poliA è pari al ≥85% dell'input (>4,25 μg).
  7. Conservare il DNA a -20 °C fino al momento di procedere con la PCR digitale.

4. PCR digitale multiplex

  1. Preparare una miscela master con una soluzione sufficiente per ogni campione e controllo. Includere almeno un campione contenente acqua (controllo negativo), un campione di un plasmide contenente INS non metilato (1 pg, controllo positivo), un campione di plasmide contenente INS metilato (1 pg, controllo positivo) e un campione contenente una miscela 1:1 di plasmidi.
    1. Per preparare la miscela master PCR, aggiungere 12,5 μl per reazione di tampone PCR (ad esempio, 125 μl per 10 campioni), 1,25 μl per miscela primer/sonda di reazione (ad esempio, 12,5 μl per 10 campioni), 8,25 μl per acqua di reazione (ad esempio, 82,5 μl per 10 campioni), 0,5 μl per reazione 5 μl per 10 campioni).
      NOTA: Gli inneschi e le sonde utilizzati qui sono i seguenti: Innesco in avanti: 5'-GGAAATTGTAGTTTTAGTTTTTGTTATTTGTGTGTGTGTGTGT-3'; Innesco inverso: 5'-AAAACCCATCTCCCCTACCTATCA-3'; Sonda FAM: FAM-5'-ACCCCTACCACCTAAC-3'-MGB; Sonda VIC: VIC-5'-ACCCCTACCGCCTAAC-3'-MGB.
  2. Impostare la reazione PCR multiplex in una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 19,5 μl di master mix a ciascun pozzetto. Aggiungere 2,5 μl di campione di DNA convertito con bisolfito in ciascun pozzetto appropriato (conservare i restanti 7,5 μl di DNA convertito con bisolfito o utilizzarli in reazioni replicate). Miscelare pipettando su e giù più volte.
    NOTA: Tutti gli 8 pozzetti di fila devono contenere il controllo del campione o del tampone.
  3. Sigillare con un foglio di alluminio utilizzando una sigillante per piastre e centrifugare in una centrifuga per piastre fino a quando non c'è più liquido sui lati dei pozzetti.
  4. Configura il generatore automatico di goccioline sul touchscreen.
    NOTA: Tutti gli 8 pozzetti della cartuccia devono contenere il controllo del campione o del tampone.
    1. Impostare il numero di righe utilizzate toccando la riga o le righe in cui vengono caricati i campioni sulla piastra a 96 pozzetti dal passaggio 4.2 ed evidenziare la riga in blu per indicare una riga attiva.
    2. Caricare i materiali di consumo da dietro a davanti per evitare contaminazioni. Per iniziare, aggiungi le cartucce lungo l'ultima fila dello strumento. Caricare le punte nella fila centrale dello strumento.
      NOTA: Le cartucce possono essere inserite nei supporti solo con l'orientamento corretto.
    3. Posizionare la piastra a 96 pozzetti nello strumento. Rimuovere un blocco freddo dal congelatore a -20 °C e inserirvi una nuova piastra a 96 pozzetti. Posizionarlo all'interno dello strumento accanto alla piastra a 96 pozzetti caricata con campione.
    4. Aggiungere l'olio all'erogatore nella parte anteriore dello strumento. Seleziona il tipo di olio sul touchscreen.
    5. Toccare il pulsante blu di avvio per iniziare la corsa. Confermare l'impostazione della piastra e toccare il pulsante di avvio della corsa per iniziare.
  5. Una volta terminato, rimuovere la piastra a 96 pozzetti che contiene le goccioline appena formate e sigillare con un foglio di sigillatura utilizzando un sigillante per piastre.
  6. Eseguire la PCR10 su un termociclatore utilizzando il seguente programma: 95 °C per 10:00 min; 40 cicli a: 94 °C per 00:30 min, 57,5 °C per 01:00 min; 98 °C per 10:00 min; 12 °C per 10 min o fino a 24 ore.
  7. Posizionare la piastra sul lettore di gocce e configurare il lettore.
    1. Fare clic sulla scheda di configurazione. Aprire un nuovo modello facendo clic su modello > nuovo. Immettere un nome per il file.
    2. Utilizzare l'editor dei pozzetti per impostare i parametri per ogni campione. Assegna a ciascun campione un nome univoco, imposta l'esperimento su Rare Event Detection (R-RED) e imposta il master mix sulla miscela utilizzata nel passaggio 4.1.
    3. Assegna un nome al Target 1 (cioè non metilato) e imposta il Target 1 come sconosciuto (U). Assegna un nome al Target 2 (cioè metilato) e imposta il Target 2 come riferimento (R).
    4. Fare clic sulla scheda Esegui per avviare l'esecuzione. Nella finestra delle opzioni di esecuzione, selezionare la chimica di rilevamento (FAM/VIC).

5. Analisi dei dati

  1. Aprire i risultati nella scheda Analizza e analizzarli utilizzando il grafico 2D basato su controlli positivi (vedere la Figura 1).
  2. Esporta il file CSV generato dal lettore di droplet in un programma di fogli di calcolo per l'analisi dei dati.
  3. Per generare "copie per μl" di siero, utilizzare la formula: (concentrazione*250)/(volume di siero utilizzato per l'isolamento del DNA in μl). 6
    NOTA: I dati vengono in genere convertiti in log10 quando vengono acquisiti da siero umano per garantire la normale distribuzione. In alternativa, i dati possono essere tracciati su una scala log10 e analizzati mediante statistiche non parametriche.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Per interpretare i dati in modo appropriato, usiamo i controlli plasmide sia per il target INS DNA non metilato e metilato in ogni seduta PCR digitale. Questi controlli assicurano che i segnali corrispondenti al DNA metilato e non metilato sono chiaramente distinguibili. La Figura 1 mostra i diagrammi di dispersione 2-D corrispondenti a gocce per controlli plasmide contenente bisolfito-convertito non metilato INS DNA (Figura 1A), metila...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

La metilazione del cytosines di DNA metiltransferasi permette il controllo epigenetico della trascrizione in molti geni. Il gene INS nell'uomo è espresso quasi esclusivamente in isolotto β cellule, e sembra che vi sia una correlazione tra la frequenza di metilazione del cytosines nel gene INS per silenziamento della sua trascrizione 11. Come tale, la maggior parte dei tipi di cellule mostrano sostanzialmente frequenze più elevate di metilazione del gene INS a vari cytosines risp...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione UC4 DK104166 del National Institutes of Health (a RGM). Desideriamo ringraziare l'assistenza dell'Indiana Diabetes Research Center Translation Core supportato dalla sovvenzione P30 DK097512 del National Institutes of Health.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Vacutainer con tappo rosso Beckon Dickinson366441nessun additivo, interno non rivestito, 10 ml
Tubo criovaleSimportT310-3Apolipropilene, tubo con tappo a vite, qualsiasi dimensione
QIAamp DNA Blood Mini KitQiagen51106
Poly(A)SigmaP9403disloved in tampone TE (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) a 5 µ g/µ l 
Etanolo assoluto (200 prove)Fisher ScientificBP2818-500
DPBS (con CaCl2 e MgCl2)SigmaD8662
Provette PCR da 0,2 ml a 8 strisceMidSciAVST
Tappi a 8 strisce, DomeMidSciAVSTC-N
EZ DNA Kit di metilazione-fulmineZymoD5031
ddPCR Supermix per sonde (senza dUTP)Biorad1863024
Buffer Control per sondeBiorad1863052
miscela di primer/sonda umana non metilata/metilataLife TechnologiesAH21BH1
EcoR1New England BiolabsR0101L
twin.tec PCR Plate 96, semi-gonnaEppendorf 951020346
Foglio perforabile TermosaldatoreBiorad1814040
PX1 PCR Sigillanteper piastre Biorad1814000
QX200 AutoDG Droplet Digital PCR SystemBiorad1864101
Olio per la generazione automatizzata di gocciolineBiorad186-4110
DG32 Cartuccia per generatore di gocce automatizzatoBiorad186-4108
Punte per pipette per generatore automatico di gocceBiorad186-4120
Contenitori per punte per pipette per generatore automatico di gocceBiorad186-4125
C1000 Touch Thermal CyclerBiorad1851197
QX200 Lettore di gocceBiorad186-4003
ddPCR Olio per lettore di gocceBiorad186-3004

Riferimenti

  1. Lehuen, A., Diana, J., Zaccone, P., Cooke, A. Immune cell crosstalk in type 1 diabetes. Nat. Rev. Immunol. 10 (7), 501-513 (2010).
  2. Sherry, N. A., Tsai, E. B., Herold, K. C. Natural history of beta-cell function in type 1 diabetes. Diabetes. 54, Suppl 2 32-39 (2005).
  3. Maganti, A., Evans-Molina, C., Mirmira, R. From immunobiology to β-cell biology: the changing perspective on type 1 diabetes. Islets. 6 (2), 28778(2014).
  4. Matthews, J. B., Staeva, T. P., Bernstein, P. L., Peakman, M., von Herrath, M. ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group Developing combination immunotherapies for type 1 diabetes: recommendations from the ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group. Clin. Exp. Immunol. 160 (2), 176-184 (2010).
  5. Human Islet Research Network | HIRN. , Available from: https://hirnetwork.org/ (2016).
  6. Fisher, M. M., Watkins, R. A., et al. Elevations in Circulating Methylated and Unmethylated Preproinsulin DNA in New-Onset Type 1 Diabetes. Diabetes. 64 (11), 3867-3872 (2015).
  7. Husseiny, M. I., Kaye, A., Zebadua, E., Kandeel, F., Ferreri, K. Tissue-Specific Methylation of Human Insulin Gene and PCR Assay for Monitoring Beta Cell Death. PLoS ONE. 9 (4), 94591(2014).
  8. Herold, K. C., Usmani-Brown, S., et al. β cell death and dysfunction during type 1 diabetes development in at-risk individuals. J. Clin. Invest. 125 (3), 1163-1173 (2015).
  9. Lehmann-Werman, R., Neiman, D., et al. Identification of tissue-specific cell death using methylation patterns of circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (13), 1826-1834 (2016).
  10. Saiki, R. K., Gelfand, D. H., et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239 (4839), 487-491 (1988).
  11. Kuroda, A., Rauch, T. A., et al. Insulin gene expression is regulated by DNA methylation. PloS One. 4 (9), 6953(2009).
  12. Akirav, E. M., Lebastchi, J., et al. Detection of β cell death in diabetes using differentially methylated circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (47), 19018-19023 (2011).
  13. Fisher, M. M., Perez Chumbiauca, C. N., Mather, K. J., Mirmira, R. G., Tersey, S. A. Detection of islet β-cell death in vivo by multiplex PCR analysis of differentially methylated DNA. Endocrinology. 154 (9), 3476-3481 (2013).
  14. Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J. Vis. Exp. (56), (2011).
  15. Derks, S., Lentjes, M. H. F. M., Hellebrekers, D. M. E. I., de Bruïne, A. P., Herman, J. G., van Engeland, M. Methylation-specific PCR unraveled. Cell. Oncol. 26 (5-6), 291-299 (2004).
  16. Husseiny, M. I., Kuroda, A., Kaye, A. N., Nair, I., Kandeel, F., Ferreri, K. Development of a quantitative methylation-specific polymerase chain reaction method for monitoring beta cell death in type 1 diabetes. PloS One. 7 (10), 47942(2012).
  17. Hindson, B. J., Ness, K. D., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
  18. Sozzi, G., Roz, L., et al. Effects of prolonged storage of whole plasma or isolated plasma DNA on the results of circulating DNA quantification assays. J. Natl. Cancer Inst. 97 (24), 1848-1850 (2005).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

DNA differenzialmente metilatoPCR digitalemorte delle cellule betaconversione al bisolfitoDNA della preproinsulinadiabete di tipo 1quantificazione assolutaDNA cell freemetilato non metilato
Misura della differenzialmente metilato
Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.