High Throughput, in tempo reale, Dual-lettura Prove di intracellulare antimicrobica attività e eucariotica citotossicità cellulare

Sommario

È stato sviluppato un test in tempo reale ad alta produttività per identificare contemporaneamente (1) antimicrobici penetranti nelle cellule eucariotiche che prendono di mira un patogeno batterico intracellulare e (2) valutare la citotossicità delle cellule eucariotiche. Una variante della stessa tecnologia è stata successivamente combinata con la tecnologia di dispensazione digitale per consentire studi di sinergia facili, ad alta risoluzione, dose-risposta e bidimensionali e tridimensionali.

Abstract

Le misure tradizionali dell'attività antimicrobica intracellulare e della citotossicità delle cellule eucariotiche si basano su saggi endpoint. Tali saggi endpoint richiedono diverse fasi sperimentali aggiuntive prima della lettura, come la lisi cellulare, la determinazione dell'unità formante colonie o l'aggiunta di reagenti. Quando si eseguono migliaia di saggi, ad esempio durante lo screening ad alto rendimento, lo sforzo a valle richiesto per questi tipi di saggi è considerevole. Pertanto, per facilitare la scoperta di antimicrobici ad alto rendimento, abbiamo sviluppato un test in tempo reale per identificare contemporaneamente gli inibitori della crescita batterica intracellulare e valutare la citotossicità delle cellule eucariotiche. In particolare, il rilevamento della crescita batterica intracellulare in tempo reale è stato reso possibile contrassegnando i ceppi di screening batterico con un operone di lux batterico (saggio di 1a^generazione) o con reporter proteici fluorescenti (2a^generazione, saggio ortogonale). Durante l'infezione iniziale dei macrofagi è stato aggiunto anche un colorante non tossico, impermeabile alla membrana cellulare, legante l'acido nucleico. Questi coloranti sono esclusi dalle cellule vitali. Tuttavia, le cellule ospiti non vitali perdono l'integrità della membrana consentendo l'ingresso e la marcatura fluorescente del DNA nucleare (acido desossiribonucleico). In particolare, il legame con il DNA è associato a un grande aumento della resa quantica fluorescente che fornisce una lettura basata sulla soluzione della morte della cellula ospite. Abbiamo utilizzato questo test combinato per eseguire uno screening ad alto rendimento in formato micropiastra e per valutare la crescita intracellulare e la citotossicità mediante microscopia. In particolare, gli antimicrobici possono dimostrare una sinergia in cui l'effetto combinato di due o più antimicrobici, se applicati insieme, è maggiore rispetto a quando applicati separatamente. I test per la sinergia in vitro contro i patogeni intracellulari sono normalmente un compito prodigioso, poiché devono essere valutate permutazioni combinatorie di antibiotici a diverse concentrazioni. Tuttavia, abbiamo scoperto che il nostro test in tempo reale, combinato con la tecnologia di dispensazione digitale automatizzata, consentiva test sinergici facili. Utilizzando questi approcci, siamo stati in grado di esaminare sistematicamente l'azione di un gran numero di antimicrobici da soli e in combinazione contro il patogeno intracellulare, la Legionella pneumophila.

Introduzione

Gli agenti patogeni che crescono o risiedono temporaneamente nei compartimenti intracellulari sono difficili da sradicare terapeuticamente. Patogeni intracellulari obbligati o relativamente obbligati come Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Brucella spp., Francisella tularensis e Mycobacterium spp. Spesso richiedono cicli prolungati di terapia antimicrobica per la cura che possono variare da mesi a addirittura anni. Inoltre, i patogeni extracellulari possono occupare transitoriamente nicchie intracellulari e in questo modo sfuggire alla clearance con i normali cicli di terapia antimicrobica e successivamente emergere per iniziare nuovi cicli di infezione virulenta. Le infezioni da Staphylococcus aureus¹ e Enterobacteriaceae^2,3 uropatogene sono due esempi sempre più riconosciuti. Pertanto, un obiettivo fondamentale della scoperta di farmaci è identificare nuovi antimicrobici che penetrano nei compartimenti intracellulari. Una terapia ottimale per eradicare rapidamente gli organismi intracellulari e prevenire lo sviluppo di resistenza attraverso l'esposizione ad antimicrobici sub-inibitori è particolarmente auspicabile.

A tal fine, abbiamo sviluppato una tecnologia di screening ad alto rendimento per identificare gli antimicrobici penetranti intracellulari che mirano alla crescita intracellulare del patogeno modello, la Legionella pneumophila. ⁴ Precedenti osservazioni cliniche indicano che i test standard di suscettibilità antimicrobica non hanno predetto con precisione l'efficacia terapeutica in vivo contro questo organismo. ⁵ In particolare, ciò è dovuto al fatto che le principali classi di antimicrobici come i β-lattamici e gli aminoglicosidi, sebbene altamente efficaci contro la Legionella coltivata assinicamente, non penetrano sufficientemente nei compartimenti intracellulari in cui risiede la Legionella. ^5,6 Prove successive hanno suggerito che saggi di crescita intracellulare tecnicamente più complessi predicevano efficacemente l'efficacia clinica. ⁷ Sfortunatamente, questi saggi erano saggi di endpoint estremamente laboriosi, che richiedevano la lisazione di macrofagi infetti, trattati con antimicrobici, in momenti diversi per l'enumerazione delle unità formanti colonie. Tali saggi non sono pratici da eseguire su larga scala e non sono adatti per la scoperta di farmaci ad alto rendimento.

Pertanto, abbiamo sviluppato una tecnologia per la determinazione in tempo reale della crescita batterica intracellulare. ⁶ Ciò è stato ottenuto attraverso l'uso di un ceppo batterico modificato attraverso l'integrazione di un operone⁸ della luciferasi batterica (test di prima generazione, descritto in precedenza)⁴ o di una proteina fluorescente⁹ reporter (test ortogonale di seconda generazione, descritto qui) nel cromosoma batterico. In questo modo, il segnale luminescente o fluorescente fornisce una lettura surrogata e in tempo reale del numero batterico.

Tuttavia, questi attributi non affrontano un fattore confondente importante nei test di infezione intracellulare, gli effetti fuori bersaglio sulle cellule ospiti. In particolare, la morte della cellula ospite limita intrinsecamente la crescita intracellulare e porta all'identificazione falsa positiva dell'effetto antimicrobico. Poiché molti composti nelle librerie di screening sono tossici per le cellule eucariotiche, tali falsi positivi travolgerebbero i veri antimicrobici, richiedendo un gran numero di test di citotossicità endpoint di follow-up per la risoluzione.

Quindi, era di grande interesse essere in grado di valutare contemporaneamente la vitalità delle cellule eucariotiche e la crescita intracellulare. In particolare, una caratteristica delle cellule eucariotiche non vitali è la perdita di integrità della membrana cellulare. Le sonde che testano la permeabilità della membrana cellulare possono quindi essere utilizzate per valutare la vitalità cellulare. In precedenza abbiamo caratterizzato la capacità di una serie di coloranti fluorescenti che legano il DNA di accedere e colorare il DNA nucleare delle cellule morte. ⁴ Legando il DNA nucleare, questi coloranti mostrano un grande aumento della resa della fluorescenza quantistica con conseguente aumento del segnale sulla fluorescenza della soluzione di fondo. In quanto tali, questi coloranti hanno fornito una lettura quantitativa della morte delle cellule eucariotiche. ⁴ In particolare, abbiamo scoperto che molti di essi stessi non erano tossici durante la co-incubazione prolungata con i macrofagi J774. Quando sono stati aggiunti durante l'infezione iniziale, hanno fornito una lettura fluorescente in tempo reale della morte delle cellule eucariotiche che può essere misurata da un fluorimetro a micropiastra o osservata al microscopio.

Pertanto, combinando l'uso di un reporter batterico e coloranti non tossici, impermeabili alla membrana e leganti il DNA, siamo stati in grado di sviluppare un test semplice, non distruttivo e in tempo reale per misurare contemporaneamente sia la carica batterica che la citotossicità delle cellule eucariotiche. Questo test ci ha permesso di esaminare in formato piastra a 384 pozzetti ~ 10.000 bioattivi noti tra cui ~ 250 antimicrobici e > 240.000 piccole molecole con attività funzionalmente non caratterizzata per la capacità di inibire la crescita intracellulare di Legionella pneumophila, generando allo stesso tempo dati di citotossicità delle cellule eucariotiche per ciascun composto. ⁶ La nostra analisi degli antimicrobici noti contro la crescita intracellulare della Legionella è stata l'esplorazione più completa di questo tipo fino ad oggi. ⁶

Sulla base dell'efficienza del nostro formato di test, abbiamo anche successivamente esplorato gli effetti potenzialmente sinergici degli antimicrobici noti quando usati in combinazione. Uno dei test di sinergia più comuni, il cosiddetto saggio a scacchiera, viene normalmente eseguito valutando gli effetti combinatori di diluizioni seriali doppie di due o più antimicrobici. ¹⁰ In questi saggi, la sinergia è definita dall'osservazione di un effetto maggiore quando due o più antimicrobici vengono applicati insieme rispetto alla somma degli effetti di ciascuno applicato separatamente. Da notare che, finora, sono stati eseguiti solo test di sinergia mirati e selettivi contro la Legionella pneumophila intracellulare a causa del grande sforzo richiesto nei test endpoint tradizionali moltiplicato per le permutazioni combinatorie richieste.

Per facilitare i test di sinergia, abbiamo utilizzato il nostro test di crescita intracellulare/citotossicità eucariotica in tempo reale in combinazione con la tecnologia di dispensazione digitale automatizzata⁶. Questa automazione ci ha permesso di erogare diluizioni seriali di composti disciolti in DMSO o in soluzione acquosa da soli o in combinazione in formato a 384 pozzetti. ¹¹ Inoltre, questa robusta tecnologia di manipolazione dei liquidi ci ha permesso di eseguire facilmente combinazioni di diluizione a risoluzione più elevata, radice quadrata di due (piuttosto che le combinazioni standard, a risoluzione inferiore, di raddoppio) per ottenere livelli più elevati di specificità nella nostra analisi bidimensionale delle sinergie a scacchiera. Questa risoluzione è stata particolarmente utile per affrontare le preoccupazioni nel campo delle sinergie sulla riproducibilità quando si utilizza la serie di diluizione a due volte¹². Infine, il nostro test era quantitativo e quindi misurava anche le gradazioni di inibizione. Di conseguenza, il test ha catturato la totalità delle informazioni inibitorie, esprimibili negli isobologrammi isocontour in cui gli isocontour collegano concentrazioni combinatorie con livelli simili di inibizione della crescita. ⁶ Questa strategia di tracciatura ha permesso la visualizzazione di curve combinatorie dose-risposta. Per illustrare la nostra metodologia, descriviamo il nostro protocollo per l'esecuzione di questi saggi e mostriamo risultati rappresentativi.

Protocollo

1. Saggio di crescita intracellulare in tempo reale e citotossicità delle cellule eucariotiche

1. Preparazione delle cellule ospiti (celle J774A.1)
   1. Coltura J774A.1 Mus musculus macrofagi in sospensione in RPMI 1640 con siero di vitello integrato con ferro al 9%. Passaggio iniziale in fiasche di coltura tissutale. Dopo che le cellule sono diventate confluenti in un pallone di coltura tissutale da 75^cm2 in 15 ml di terreno, divise mediante raschiatura e diluizione a 65 ml con lo stesso tipo di terreno, di cui 15 ml vengono restituiti al pallone di coltura tissutale e 50 ml trasferiti in un pallone di agitatore batterico da 250 ml.
   2. Per lo scale-up, coltura in sospensione in fiasche batteriche da 250 ml e/o 1.000 ml riempite a un quinto del volume con terreno di coltura tissutale. Aerare impostando la velocità di rotazione a circa 120 giri al minuto. Per una crescita costante, incubare esattamente al 5% di CO₂ e 37 °C.
   3. Raccogliere le cellule quando raggiungono una densità compresa tra 2,5 x 10⁶ cellule/ml e 5 x 10⁶ cellule/ml. Assicurarsi che la percentuale di cellule morte (più facilmente analizzabile mediante colorazione con blu di tripano) non superi il 25%, poiché le cellule morte aumenteranno il rumore di fondo nei saggi di citotossicità.
   4. Piastra in micropiastre bianche, trattate con coltura tissutale, a 384 pozzetti con 5 x 10⁴ cellule J774A.1 in terreno di coltura tissutale da 30 μl per pozzetto. Incubare le micropiastre durante la notte per ottenere una confluenza del 90% il giorno dell'esperimento.
2. Preparazione della Legionella pneumophila luminescente o fluorescente
   1. Passaggio di batteri L. pneumophila (Lp02::flaA::lux⁸) su terreno appropriato, cioè terreno di estratto di lievito di carbone tamponato (BCYE). Se si utilizza un ceppo auxotrofico di timidina, integrare il terreno con 100 μg/ml di timidina. Preparare patch di batteri per gli esperimenti spargendo gli organismi densamente su una nuova piastra BCYE e incubando un giorno (se da un precedente passaggio della piastra) o due o tre giorni (se da stock congelato) per ottenere una crescita confluente.
      1. Preparare le piastre BCYE sciogliendo 10 g di estratto di lievito, 10 g di acido N-(2-acetamido)-2-amminoetansolfonico, 0,35 g di K₂HPO₄ e 1 g di potassio monobasico α-chetoglutarato in 950 ml di acqua deionizzata. Regolare a pH 6,9 con idrossido di potassio (≥2,5 ml di soluzione molare 11,9).
      2. Aggiungere 15 g di agar agar e 2 g di carbone attivo e portare a 1 L di volume finale. Aggiungere un'ancoretta magnetica e un'autoclave. Raffreddare il terreno a 55 °C e aggiungere soluzioni sterilizzate con filtro contenenti 0,4 g di L-cisteina e 0,42 g di citrato di ferro (III) di ammonio disciolto in acqua deionizzata. Utilizzare la piastra di agitazione magnetica per mescolare prima di versare le piastre di Petri.
      3. Per testare la crescita di L. pneumophila nel terreno di crescita axenico, preparare il brodo di estratto di lievito ACES (AYE) combinando tutti i reagenti chimici utilizzati per BCYE, ad eccezione del carbone e dell'agar. Filtrare, sterilizzare e utilizzare immediatamente, oppure congelare per esperimenti successivi.
   2. Risospendere gli organismi nello stesso terreno di coltura tissutale utilizzato per le cellule J774A.1 con un'integrazione di 100 μg/ml di timidina, a seconda dei casi.
3. Infezione da macrofagi
   1. Aggiungere i composti di interesse per i test (composti di screening e controlli positivi e negativi per l'inibizione della crescita batterica e la lisi delle cellule eucariotiche). Preferibilmente, sciogliere le soluzioni madre a ≥500x in DMSO (dimetilsolfossido) o in una soluzione acquosa per consentire una sufficiente diluizione del veicolo.
      1. Sebbene le soluzioni madre possano essere conservate congelate, evitare i cicli di congelamento-scongelamento per i composti labili e gli antimicrobici.
   2. Diluire i batteri luminescenti fino a raggiungere un target di 2,5 x 10⁶ CFU (unità formante colonie)/m e i batteri marcati con reporter fluorescente a 1,0 x 10⁷ CFU/ml in terreno di coltura tissutale e aggiungere un colorante non tossico appropriato, impermeabile alla membrana e legante l'acido nucleico a una concentrazione del saggio finale di 2,5x.
   3. Aggiungere 20 μl di miscela a ciascun pozzetto di coltura J774A.1, volume finale del saggio 50 μl, concentrazione batterica finale 1 x 10⁶ CFU/ml (reporter dell'operone lux) o 4 x 10^{10 6} CFU/ml (reporter proteico fluorescente).
   4. Incubare a 37 °C per 1-3 giorni in CO₂ al 5% al 100% di umidità relativa per evitare effetti di bordo per evaporazione.
4. Lettura del saggio
   1. Leggere la crescita batterica e la tossicità delle cellule eucariotiche su un luminometro e un fluorimetro per micropiastre in base ai reporter utilizzati.
      1. Per evitare gli effetti dei bordi associati alla temperatura, equilibrare termicamente le micropiastre prima della lettura della luminescenza posizionandole in un singolo strato su un banco da laboratorio con i coperchi socchiusi per circa 20 minuti (o in una cabina di sicurezza biologica con i coperchi aperti per circa 10 minuti).
   2. Riportare le micropiastre all'incubatore se si desidera la lettura in tempo reale in punti temporali successivi.

2. Analisi dei dati

1. Normalizzare i dati in controlli positivi e negativi per calcolare la percentuale o l'inibizione del ripiegamento per la crescita batterica intracellulare e la percentuale di citotossicità per le cellule eucariotiche.
2. Per valutare la robustezza del saggio, calcolare la separazione statistica tra controlli positivi e negativi sia per l'inibizione della crescita batterica che per la citotossicità utilizzando l'analisi del fattore Z (Z') dove Z' = 1 - 3(σ_p + σ_n)/|μ_p + μ_n|. In questa equazione, σ_p e σ_n sono le deviazioni standard rispettivamente per i pozzetti di controllo positivo e negativo; μ_p e μ_n sono i valori medi rispettivamente per i pozzetti di controllo positivo e negativo.
   1. Per i saggi di screening ad alto rendimento, calcolare gli z-score standard (o altre misure statistiche quantitative alternative) per valutare gli effetti dei composti in esame di interesse. In alternativa, calcolare una semplice riduzione della piega o una riduzione della piega logaritmica come misura potenzialmente fisiologicamente più rilevante dell'entità dell'effetto per i batteri che si replicano geometricamente.

3. Test dose-risposta monodimensionale e multidimensionale (cioè sinergica) e interpretazione dei dati

1. Preparare macrofagi e batteri come descritto nella sezione 1 del protocollo.
2. Appena prima dell'infezione o dell'incubazione axenica, aggiungere antimicrobici di interesse sperimentale in una serie seriale, a doppia diluizione, con l'obiettivo di estendere sul segmento alto una concentrazione che elimini completamente la crescita (cioè la concentrazione inibitoria minima o MIC) e sul segmento basso una concentrazione che non mostri alcuna attività evidente.
3. Utilizza un sistema automatizzato di manipolazione dei liquidi per facilitare la configurazione dei test di sinergia combinatoria e dose-risposta singola attraverso l'aggiunta diretta e automatizzata di diluizioni antimicrobiche secondo il protocollo del produttore.
4. Considera l'uso di diluizioni di sub-raddoppio, ad esempio, volte e repliche di test per aumentare l'accuratezza e la riproducibilità dei dati.
5. Per l'infezione da macrofagi, diluire i batteri luminescenti fino a raggiungere un target di 2,5 x 10⁶ CFU (unità formante colonie)/ml nel terreno di coltura tissutale. Aggiungere 20 μl di miscela a ciascun pozzetto di coltura J774A.1, volume finale del saggio 50 μl, concentrazione batterica finale 1 x 10⁶ CFU/ml; e incubare a 37 °C in 5% CO₂ al 100% di umidità relativa.
   1. Per i test di crescita axenic, diluire i batteri luminescenti alla concentrazione finale di 1 x 10⁶ CFU/ml in terreno AYE, aggiungere 50 μl a ciascun pozzetto di una piastra da 384 pozzetti e incubare a 37 °C in CO₂ al 5% al 100% di umidità relativa.
6. Calcola l'indice di concentrazione frazionario dell'inibitore per le combinazioni antimicrobiche che inibiscono la crescita batterica. Per ogni farmaco nella combinazione (a, b, . . n) che determina un'inibizione completa o >99% della crescita batterica, calcolare la concentrazione inibitoria frazionaria individuale (FIC_{a, b, . . n.)} come segue: FIC_a = la concentrazione del composto "a" divisa per la concentrazione minima dell'inibitore di "a" per se stessa. _. Utilizzando la stessa formula, calcola FIC_b, ecc. Quindi calcola l'indice FIC combinatorio o FIC = FIC_a + FIC_b + . . . FIC_n per ogni combinazione inibitoria.
   1. Utilizzare l'indice combinatorio che si discosta maggiormente da 1,0 per valutare la sinergia. Considera un cutoff di ≤0,5 come indicazione conservativa di un effetto sinergico e ≥4, un effetto antagonista. ¹²
   2. Tracciare gli isobologrammi, gli isobologrammi di isocontorno e/o gli isobologrammi^{di superficie 6} come rappresentazioni grafiche alternative di effetti combinatori.

Risultati

Saggio di crescita intracellulare su micropiastra

La Figura 1 illustra le fasi del test. I passaggi automatizzati mostrati possono essere eseguiti manualmente. Tuttavia, la produttività è notevolmente facilitata dall'utilizzo di sistemi di manipolazione dei liquidi.

La Figura 2 mostra i risultati rappresentativi di un test di citotossi...

Discussione

Descriviamo saggi in tempo reale per il rilevamento simultaneo della crescita batterica intracellulare e della citotossicità delle cellule ospiti. Il protocollo prevede diversi passaggi critici. Innanzitutto, per ottenere prestazioni affidabili del saggio, è necessario che vi sia una sufficiente separazione spettrale tra le letture batteriche e quelle di citotossicità. Tale separazione è intrinseca per le combinazioni di reporter di operoni luciferasi e coloranti fluorescenti leganti il DNA. Tuttavia, sulla base della no...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cellule J774A.1	Collezione di colture di tipo americano	TIB-67	Cellula ospite
ACES	Sigma-Aldrich	A9758	Per la produzione di agar con estratto di lievito di carbone tamponato e terreno di coltura con estratto di lievito tamponato
Estratto di lievito, ultrafiltrato	Becton-Dickinson/Difco	210929	Per la produzione di agar con estratto di lievito di carbone tamponato e terreno di coltura con estratto di lievito tamponato; gradi inferiori possono causare una crescita alterata e/o alterare la sensibilità della Legionella agli inibitori della crescita
Acido alfa-chetoglutarico, sale monopotassico	Sigma-Aldrich	K2000	Per la produzione di agar con estratto di lievito di carbone tamponato e terreno di estratto di lievito tamponato
Piruvato di sodio	Sigma-Aldrich	P5280	Per la produzione di agar con estratto di lievito di carbone tamponato e terreno di estratto di lievito tamponato
Fosfato di potassio, bibasico	Thermo Fisher Scientific	P288-500	Per la produzione di agar con estratto di lievito di carbone tamponato e mezzo di estratto di lievito tamponato
L-cisteina	Sigma-Aldrich	C-7755	Per la produzione di agar con estratto di lievito di carbone tamponato e terreno
con estratto di lievito tamponatoCitrato di ferro ammonico (III)	Sigma-Aldrich	F5879	Per la produzione di agar con estratto di lievito di carbone tamponato e terreno di coltura con estratto di lievito tamponato; al suo posto può essere utilizzato il pirofosfato ferrico, ma è più difficile da pesare con precisione
Soluzione di idrossido di potassio, concentrata	Thermo Fisher Scientific	SP236-500	Per la produzione di agar con estratto di lievito di carbone tamponato e terreno con estratto di lievito tamponato
Acqua deonizzata	N/A	N/A	Per la produzione di agar con estratto di lievito di carbone tamponato e terreno di coltura con estratto di lievito tamponato
Timidina (grado di coltura tissutale)	Sigma-Aldrich	T1895	Per integrare sia RPMI 1640 che l'estratto di lievito tamponato agar/medium - per quest'ultimo può essere utilizzata la timidina di grado inferiore, ma può causare una crescita cellulare alterata e/o la morte cellulare in RPMI 1640
RPMI 1640, formulazione standard	Corning via Thermo Fisher Scientific	10-040-CV	Per la crescita di cellule J774A.1 prima della piastra; include 2 mM di L-glutammina
RPMI 1640 privo di rosso fenolo	Corning tramite Thermo Fisher Scientific	17-105-CV	Per la piastratura di cellule J774A.1 in piastre da 384 pozzetti (non adatto per la crescita prima della piastra); manca anche di L-glutammina - supplemento a 2 mM prima dell'uso
di L-glutammina, 200 mM in NaCl allo 0,85% (grado di coltura tissutale)	HyClone via Thermo Fisher Scientific	SH30034.02	Per l'integrazione di RPMI 1640 privo di L-glutammina, a 2 mM di concentrazione finale
Siero di vitello integrato con ferro	Gemini Bioproducts	100-510	Per l'integrazione di RPMI 1640, al 9,1% di concentrazione finale
Soluzione di Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154	Per la colorazione per la determinazione della morte cellulare J774A.1 durante il conteggio della densità cellulare
SYTOX Green, 5 mM di soluzione in DMSO	Thermo Fisher Scientific	S7020	Per la colorazione per la determinazione della morte cellulare J774A.1 mediante lettura a fluorescenza o microscopia a epifluorescenza (in combinazione con batteri fluorescenti rosso-arancio o rosso lontano). Utilizzare alla concentrazione finale di 125 nM.
Incubatore per colture cellulari	Thermo Fisher Scientific	13-255-26	Per l'incubazione di cellule J774A.1 (sia prima che dopo l'infezione); può essere utilizzato anche per l'incubazione di batteri, oppure può essere utilizzato un incubatore in atmosfera standard)
Agitatore orbitale	BellCo Glass	7744-01010	Per l'incubazione con agitazione di cellule J774A.1 prima dell'infezione; si inserisce all'interno di incubatori per colture cellulari; include base shaker 7744-01000 e vassoio 7740-01010 (disponibili anche separatamente)
Palloni per agitatore (250 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-04	Per l'incubazione con agitazione di cellule J774A.1 prima dell'infezione
Morsetti per flaconi (250 ml)	BellCo Glass	7744-16250	Per l'incubazione con agitazione di cellule J774A.1 prima dell'infezione
Flaconi per agitatori (1.000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-07	Per l'incubazione con agitazione di cellule J774A.1 prima dell'infezione
Morsetti per agitatori per fiasche (1.000 ml)	BellCo Glass	7744-16100	Per l'incubazione con agitazione di cellule J774A.1 prima dell'infezione
Tappi in schiuma spugna per fiaschi (250 ml-1.000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-1490-038	Per l'incubazione con agitazione di cellule J774A.1 prima dell'infezione; riduce il rischio di contaminazione rispetto ai tappi metallici standard Pompa
peristaltica multicanale programmabile MultiDrop Combi	Thermo Fisher Scientific	5840300	Per l'erogazione di cellule J774A.1, terreno e sospensione batterica contenenti fluorofori in un gran numero di piastre da 384 pozzetti
Collettore combinato con foro standard	Thermo Fisher Scientific	24072670	Volume di preerogazione predefinito di 20 μ l è insufficiente a compensare l'assestamento — aumento a 80 μ l
Piastre bianche a 384 pozzetti trattate per la coltura dei tessuti	Corning	3570	Per la lettura della luminescenza e della fluorescenza; Catalogo Greiner # 781080 testato con successo
anche DMSO (grado di coltura tissutale, in fiale sigillate)	Sigma-Aldrich	D2650	Per sciogliere il controllo positivo e testare i composti
Azitromicina	Sigma-Aldrich	PHR1088	Controllo positivo antibiotico
Saponina (dalla corteccia di Quillaja)	Sigma-Aldrich	S-4521	Controllo positivo della citossicità
Pipettatore	multicanaleThermo Fisher Scientific	Finnpipette	Per il trasferimento di quantità fisse di composti a controllo positivo; il pipettatore deve essere dotato di dispensazione digitale con fermi per consentire l'erogazione ripetitiva di volumi fissi
Robot di trasferimento a perno Epson	Epson/ICCB-L	(attrezzatura personalizzata)	Per il trasferimento di quantità fisse di composti di prova da array di librerie
Sistema di dosaggio digitale D300	Hewlett-Packard tramite Tecan	D300	Per il trasferimento di quantità variabili di composti in esame che vanno da 11 picolitri a 10 µ l
Cartucce T8+ per sistema di dosaggio digitale D300	Hewlett-Packard via Tecan	T8+	Per l'erogazione di composti di prova
Microscopio a epifluorescenza con fotocamera digitale collegata al computer	Nikon	Ti	Per l'imaging di cellule vive; qualsiasi microscopio a fluorescenza standard può sostituire, con ottica a contrasto di fase o DIC, la fluorescenza verde (fluoresceina), da rosso-arancio a rosso (Texas Red) e rosso lontano (Cy5), con olio 100X per la massima risoluzione Piastre per
colture tissutali con fondo in vetro	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C	Per l'imaging di cellule vive. Piatti come il MatTek consentono la visualizzazione microscopica con ingrandimento 600X o 1.000X attraverso l'uso di un microscopio epifluorescente invertito o confocale. Queste stoviglie specifiche hanno un diametro nominale di 3,5 cm, un diametro interno di 3,3 cm, con vetrini copricoperchio di diametro #1,5 di diametro 20 mm inseriti nei fondi.
Photoshop CS6	Adobe		, Adobe Photoshop o programmi simili possono essere utilizzati per pseudocolorare e unire immagini luminose, microscopiche e fluorescenti.
Mathematica 10	Wolfam		Per la generazione di isobologrammi bidimensionali isocontour e isobologrammi tridimensionali di superficie.