High Throughput, in tempo reale, Dual-lettura Prove di intracellulare antimicrobica attività e eucariotica citotossicità cellulare

Sommario

È stato sviluppato un test in tempo reale ad alta produttività per identificare contemporaneamente (1) antimicrobici penetranti nelle cellule eucariotiche che prendono di mira un patogeno batterico intracellulare e (2) valutare la citotossicità delle cellule eucariotiche. Una variante della stessa tecnologia è stata successivamente combinata con la tecnologia di dispensazione digitale per consentire studi di sinergia facili, ad alta risoluzione, dose-risposta e bidimensionali e tridimensionali.

Abstract

Le misure tradizionali dell'attività antimicrobica intracellulare e della citotossicità delle cellule eucariotiche si basano su saggi endpoint. Tali saggi endpoint richiedono diverse fasi sperimentali aggiuntive prima della lettura, come la lisi cellulare, la determinazione dell'unità formante colonie o l'aggiunta di reagenti. Quando si eseguono migliaia di saggi, ad esempio durante lo screening ad alto rendimento, lo sforzo a valle richiesto per questi tipi di saggi è considerevole. Pertanto, per facilitare la scoperta di antimicrobici ad alto rendimento, abbiamo sviluppato un test in tempo reale per identificare contemporaneamente gli inibitori della crescita batterica intracellulare e valutare la citotossicità delle cellule eucariotiche. In particolare, il rilevamento della crescita batterica intracellulare in tempo reale è stato reso possibile contrassegnando i ceppi di screening batterico con un operone di lux batterico (saggio di 1a^generazione) o con reporter proteici fluorescenti (2a^generazione, saggio ortogonale). Durante l'infezione iniziale dei macrofagi è stato aggiunto anche un colorante non tossico, impermeabile alla membrana cellulare, legante l'acido nucleico. Questi coloranti sono esclusi dalle cellule vitali. Tuttavia, le cellule ospiti non vitali perdono l'integrità della membrana consentendo l'ingresso e la marcatura fluorescente del DNA nucleare (acido desossiribonucleico). In particolare, il legame con il DNA è associato a un grande aumento della resa quantica fluorescente che fornisce una lettura basata sulla soluzione della morte della cellula ospite. Abbiamo utilizzato questo test combinato per eseguire uno screening ad alto rendimento in formato micropiastra e per valutare la crescita intracellulare e la citotossicità mediante microscopia. In particolare, gli antimicrobici possono dimostrare una sinergia in cui l'effetto combinato di due o più antimicrobici, se applicati insieme, è maggiore rispetto a quando applicati separatamente. I test per la sinergia in vitro contro i patogeni intracellulari sono normalmente un compito prodigioso, poiché devono essere valutate permutazioni combinatorie di antibiotici a diverse concentrazioni. Tuttavia, abbiamo scoperto che il nostro test in tempo reale, combinato con la tecnologia di dispensazione digitale automatizzata, consentiva test sinergici facili. Utilizzando questi approcci, siamo stati in grado di esaminare sistematicamente l'azione di un gran numero di antimicrobici da soli e in combinazione contro il patogeno intracellulare, la Legionella pneumophila.

Introduzione

Gli agenti patogeni che crescono o risiedono temporaneamente nei compartimenti intracellulari sono difficili da sradicare terapeuticamente. Patogeni intracellulari obbligati o relativamente obbligati come Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Brucella spp., Francisella tularensis e Mycobacterium spp. Spesso richiedono cicli prolungati di terapia antimicrobica per la cura che possono variare da mesi a addirittura anni. Inoltre, i patogeni extracellulari possono occupare transitoriamente nicchie intracellulari e in questo modo sfuggire alla clearance con i normali cicli di terapia antimicrobica e successivamente....

Protocollo

1. Saggio in tempo reale della crescita intracellulare e della citotossicità su cellule eucariotiche

1. Preparazione delle cellule ospiti (cellule J774A.1)
   1. Coltivare J774A.1 Mus musculus cellule di tipo macrofagico in sospensione in RPMI 1640 con 9% di siero di vitello supplementato con ferro. Passaggio iniziale in fiasche per coltura cellulare. Dopo che le cellule sono diventate confluenti in una fiasca di 75 cm²² flacone da coltura cellulare in 15 ml di mezzo, suddiviso per scraping e diluizione fino a 65 ml con lo stesso tipo di mezzo, di cui 15 ml vengono reimmessi nel flacone da coltura cellulare e 50 ml vengono trasferit....

Risultati

Saggio di crescita intracellulare in micropiastre

Figura 1 illustra i passaggi del saggio. I passaggi automatizzati mostrati possono essere eseguiti manualmente. Tuttavia, l'efficienza è notevolmente migliorata utilizzando sistemi automatizzati per la manipolazione dei liquidi.

Figura 2 mostra risultati rappresentativi ottenuti da un s.......

Discussione

Descriviamo saggi in tempo reale per il rilevamento simultaneo della crescita batterica intracellulare e della citotossicità delle cellule ospiti. Il protocollo prevede diversi passaggi critici. Innanzitutto, per ottenere prestazioni affidabili del saggio, è necessario che vi sia una sufficiente separazione spettrale tra le letture batteriche e quelle di citotossicità. Tale separazione è intrinseca per le combinazioni di reporter di operoni luciferasi e coloranti fluorescenti leganti il DNA. Tuttavia, sulla base della no.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cellule J774A.1	Collezione di colture di tipo americano	TIB-67	Cellula ospite
ACES	Sigma-Aldrich	A9758	Per la produzione di agar con estratto di lievito di carbone tamponato e terreno di coltura con estratto di lievito tamponato
Estratto di lievito, ultrafiltrato	Becton-Dickinson/Difco	210929	Per la produzione di agar con estratto di lievito di carbone tamponato e terreno di coltura con estratto di lievito tamponato; gradi inferiori possono causare una crescita alterata e/o alterare la sensibilità della Legionella agli inibitori della crescita
Acido alfa-chetoglutarico, sale monopotassico	Sigma-Aldrich	K2000	Per la produzione di agar con estratto di lievito di carbone tamponato e terreno di estratto di lievito tamponato
Piruvato di sodio	Sigma-Aldrich	P5280	Per la produzione di agar con estratto di lievito di carbone tamponato e terreno di estratto di lievito tamponato
Fosfato di potassio, bibasico	Thermo Fisher Scientific	P288-500	Per la produzione di agar con estratto di lievito di carbone tamponato e mezzo di estratto di lievito tamponato
L-cisteina	Sigma-Aldrich	C-7755	Per la produzione di agar con estratto di lievito di carbone tamponato e terreno
con estratto di lievito tamponatoCitrato di ferro ammonico (III)	Sigma-Aldrich	F5879	Per la produzione di agar con estratto di lievito di carbone tamponato e terreno di coltura con estratto di lievito tamponato; al suo posto può essere utilizzato il pirofosfato ferrico, ma è più difficile da pesare con precisione
Soluzione di idrossido di potassio, concentrata	Thermo Fisher Scientific	SP236-500	Per la produzione di agar con estratto di lievito di carbone tamponato e terreno con estratto di lievito tamponato
Acqua deonizzata	N/A	N/A	Per la produzione di agar con estratto di lievito di carbone tamponato e terreno di coltura con estratto di lievito tamponato
Timidina (grado di coltura tissutale)	Sigma-Aldrich	T1895	Per integrare sia RPMI 1640 che l'estratto di lievito tamponato agar/medium - per quest'ultimo può essere utilizzata la timidina di grado inferiore, ma può causare una crescita cellulare alterata e/o la morte cellulare in RPMI 1640
RPMI 1640, formulazione standard	Corning via Thermo Fisher Scientific	10-040-CV	Per la crescita di cellule J774A.1 prima della piastra; include 2 mM di L-glutammina
RPMI 1640 privo di rosso fenolo	Corning tramite Thermo Fisher Scientific	17-105-CV	Per la piastratura di cellule J774A.1 in piastre da 384 pozzetti (non adatto per la crescita prima della piastra); manca anche di L-glutammina - supplemento a 2 mM prima dell'uso
di L-glutammina, 200 mM in NaCl allo 0,85% (grado di coltura tissutale)	HyClone via Thermo Fisher Scientific	SH30034.02	Per l'integrazione di RPMI 1640 privo di L-glutammina, a 2 mM di concentrazione finale
Siero di vitello integrato con ferro	Gemini Bioproducts	100-510	Per l'integrazione di RPMI 1640, al 9,1% di concentrazione finale
Soluzione di Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154	Per la colorazione per la determinazione della morte cellulare J774A.1 durante il conteggio della densità cellulare
SYTOX Green, 5 mM di soluzione in DMSO	Thermo Fisher Scientific	S7020	Per la colorazione per la determinazione della morte cellulare J774A.1 mediante lettura a fluorescenza o microscopia a epifluorescenza (in combinazione con batteri fluorescenti rosso-arancio o rosso lontano). Utilizzare alla concentrazione finale di 125 nM.
Incubatore per colture cellulari	Thermo Fisher Scientific	13-255-26	Per l'incubazione di cellule J774A.1 (sia prima che dopo l'infezione); può essere utilizzato anche per l'incubazione di batteri, oppure può essere utilizzato un incubatore in atmosfera standard)
Agitatore orbitale	BellCo Glass	7744-01010	Per l'incubazione con agitazione di cellule J774A.1 prima dell'infezione; si inserisce all'interno di incubatori per colture cellulari; include base shaker 7744-01000 e vassoio 7740-01010 (disponibili anche separatamente)
Palloni per agitatore (250 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-04	Per l'incubazione con agitazione di cellule J774A.1 prima dell'infezione
Morsetti per flaconi (250 ml)	BellCo Glass	7744-16250	Per l'incubazione con agitazione di cellule J774A.1 prima dell'infezione
Flaconi per agitatori (1.000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-07	Per l'incubazione con agitazione di cellule J774A.1 prima dell'infezione
Morsetti per agitatori per fiasche (1.000 ml)	BellCo Glass	7744-16100	Per l'incubazione con agitazione di cellule J774A.1 prima dell'infezione
Tappi in schiuma spugna per fiaschi (250 ml-1.000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-1490-038	Per l'incubazione con agitazione di cellule J774A.1 prima dell'infezione; riduce il rischio di contaminazione rispetto ai tappi metallici standard Pompa
peristaltica multicanale programmabile MultiDrop Combi	Thermo Fisher Scientific	5840300	Per l'erogazione di cellule J774A.1, terreno e sospensione batterica contenenti fluorofori in un gran numero di piastre da 384 pozzetti
Collettore combinato con foro standard	Thermo Fisher Scientific	24072670	Volume di preerogazione predefinito di 20 μ l è insufficiente a compensare l'assestamento — aumento a 80 μ l
Piastre bianche a 384 pozzetti trattate per la coltura dei tessuti	Corning	3570	Per la lettura della luminescenza e della fluorescenza; Catalogo Greiner # 781080 testato con successo
anche DMSO (grado di coltura tissutale, in fiale sigillate)	Sigma-Aldrich	D2650	Per sciogliere il controllo positivo e testare i composti
Azitromicina	Sigma-Aldrich	PHR1088	Controllo positivo antibiotico
Saponina (dalla corteccia di Quillaja)	Sigma-Aldrich	S-4521	Controllo positivo della citossicità
Pipettatore	multicanaleThermo Fisher Scientific	Finnpipette	Per il trasferimento di quantità fisse di composti a controllo positivo; il pipettatore deve essere dotato di dispensazione digitale con fermi per consentire l'erogazione ripetitiva di volumi fissi
Robot di trasferimento a perno Epson	Epson/ICCB-L	(attrezzatura personalizzata)	Per il trasferimento di quantità fisse di composti di prova da array di librerie
Sistema di dosaggio digitale D300	Hewlett-Packard tramite Tecan	D300	Per il trasferimento di quantità variabili di composti in esame che vanno da 11 picolitri a 10 µ l
Cartucce T8+ per sistema di dosaggio digitale D300	Hewlett-Packard via Tecan	T8+	Per l'erogazione di composti di prova
Microscopio a epifluorescenza con fotocamera digitale collegata al computer	Nikon	Ti	Per l'imaging di cellule vive; qualsiasi microscopio a fluorescenza standard può sostituire, con ottica a contrasto di fase o DIC, la fluorescenza verde (fluoresceina), da rosso-arancio a rosso (Texas Red) e rosso lontano (Cy5), con olio 100X per la massima risoluzione Piastre per
colture tissutali con fondo in vetro	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C	Per l'imaging di cellule vive. Piatti come il MatTek consentono la visualizzazione microscopica con ingrandimento 600X o 1.000X attraverso l'uso di un microscopio epifluorescente invertito o confocale. Queste stoviglie specifiche hanno un diametro nominale di 3,5 cm, un diametro interno di 3,3 cm, con vetrini copricoperchio di diametro #1,5 di diametro 20 mm inseriti nei fondi.
Photoshop CS6	Adobe		, Adobe Photoshop o programmi simili possono essere utilizzati per pseudocolorare e unire immagini luminose, microscopiche e fluorescenti.
Mathematica 10	Wolfam		Per la generazione di isobologrammi bidimensionali isocontour e isobologrammi tridimensionali di superficie.

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