Osservazione e quantificazione di comportamento di accoppiamento nel nematode del pino, Bursaphelenchus xylophilus

Summary

Viene presentato un protocollo per studiare il comportamento di accoppiamento del nematode del pino, Bursaphelenchus xylophilus. Le caratteristiche comportamentali di B. xylophilus sono descritte nel processo di accoppiamento.

Abstract

Un metodo per osservare e quantificare il comportamento di accoppiamento del nematode del pino, Bursaphelenchus xylophilus, è stato istituito allo stereomicroscopio. Per migliorare l'efficienza di accoppiamento di B. Xylophilus e per aumentare le possibilità di osservazione accoppiamento, adulti vergini sono stati coltivati e utilizzati per l'indagine. Le uova sono stati ottenuti mantenendo i nematodi in acqua e permettendo le femmine di deporre le uova per 10 min. Le larve di secondo stadio (J2) sono stati sincronizzati incubando le uova per 24 ore a 25 ° C al buio, e il primo J4 sono stati ottenuti coltivando la J2 con muffa grigia, Botrytis cinerea, per un altro 52 h. A questo punto di tempo, la maggior parte dei nematodi J4 potrebbero essere chiaramente distinti come maschio o femmina usando la loro morfologia genitale. Il maschio e la femmina J4 sono stati raccolti e coltivate separatamente in due diverse piastre di Petri per 24 ore per ottenere nematodi adulti vergini. Un maschio e una femmina vergine vergine sono stati associati in una goccia di water nel pozzo di una diapositiva concava. Il comportamento di accoppiamento è stato girato con un videoregistratore allo stereomicroscopio. L'intera durata del processo di accoppiamento era 82,8 ± 3,91 min (media ± SE) e potrebbe essere diviso in 4 diverse fasi: ricerca, contatto, che copulano, e persistente. Il verbale medi di durata erano 21,8 ± 2,0, 28,0 ± 1,9, 25,8 ± 0,7 e 7,2 ± 0,5, rispettivamente. Undici sub-comportamenti sono stati descritti: crociera, si avvicina, incontrando, toccando, hoop, localizzare, allegando, eiaculazione, la separazione, quiescenza, e il roaming. È interessante notare che, evidente la concorrenza intra-sessuale è stata osservata quando una femmina è stata raggruppata con 3 maschi o un maschio con 3 femmine. Questo protocollo è utile e prezioso, non solo in indagare il comportamento di accoppiamento di B. xylophilus, ma anche in qualità di riferimento per studi comportamentali degli altri nematodi.

Introduction

Il nematode del pino, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner e Buhrer) Nickle, è una delle specie invasive più distruttive, che causa l'appassimento e la morte dei pini. Si ritiene che questo nematode patogeno sia originario degli Stati Uniti, ma è stato trasportato in diversi paesi, tra cui Cina, Giappone, Corea del Sud e Portogallo. Recentemente, è stato segnalato anche in Spagna, uccidendo milioni di pini con enormi perdite economiche e minacciando la produzione forestale e la stabilità ecologica^1-5.

Una volta che un pino ospite viene infettato dai nematodi del pino, migliaia di milioni di prole si propagano rapidamente ....

Protocol

1. Acquisizione di Virgin adulti Nematodi

1. Nematode del pino isolato e condizioni di coltura
   NOTA: Il B. xylophilus isolare Nxy61 è stato originariamente estratto da un malato massoniana Pinus nella zona di Ningbo della provincia di Zhejiang in Cina.
   1. Preparare Potato Dextrose Agar (PDA, vedere la Tabella dei Materiali) piastre per la coltivazione di Botrytis cinerea.
   2. Per l'inoculazione, pugno un pezzo di tappeto funghi con diametro di 10 mm da un tappeto di B. cinerea e metterlo al centro di una nuova piastra PDA. Culture B. cinerea per 5 d ....

Results

Il tasso di successo di accoppiamento (R) degli adulti vergini era 86,67% in media, che era significativamente più elevata di quella degli adulti selezionati casualmente: 13,33 ± 4,65% (F = 1301,71, df = 1, p = 0,0001) (Figura 2). Questa scoperta suggerisce che è più facile osservare il comportamento di accoppiamento di B. xylophilus con gli adulti vergini che con gli adulti selezionati casualmente.

Discussion

test comportamentali sono un aspetto fondamentale di ecologia chimica, la neurobiologia, la biologia molecolare e la genetica. Nematodi, e in particolare C. elegans, sono ampiamente utilizzati per gli studi in questi settori. Il comportamento di accoppiamento di C. elegans è stato studiato in precedenza ^10-11. Tuttavia, B. xylophilus è gonochoristic e diverso dagli ermafroditi C. elegans, e il suo processo di accoppiamento ha diverse caratteristiche comportamentali ^9.<.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
B. xylophilus isolato Nxy61			Estratto da Pinus massoniana nell'area di Ningbo in Cina
Ceppo			Ottenuto da Forestry Academy of China
Baermann imbuti	Sengong
falcon tubi Sengong	Sengong
	Sengong
pipetta	Sengong
sterile dd H2O			Sterilizzato ad alta pressione di vapore a 121 gradi; C per 30 min.
Piastre di Petri	Sengong
PDA medio	Huankai Bio.	021050
incubatore	Sengong
Flusso laminare	Sengong
capillare in vetro	Sengong
Stereoscopio	Leica	LED5000 RL
Stereomicroscopio invertito	Zeiss	A1
vetrini concavi	Sengong