Osservazione e quantificazione di comportamento di accoppiamento nel nematode del pino, Bursaphelenchus xylophilus

Summary

Viene presentato un protocollo per studiare il comportamento di accoppiamento del nematode del pino, Bursaphelenchus xylophilus. Le caratteristiche comportamentali di B. xylophilus sono descritte nel processo di accoppiamento.

Abstract

Un metodo per osservare e quantificare il comportamento di accoppiamento del nematode del pino, Bursaphelenchus xylophilus, è stato istituito allo stereomicroscopio. Per migliorare l'efficienza di accoppiamento di B. Xylophilus e per aumentare le possibilità di osservazione accoppiamento, adulti vergini sono stati coltivati e utilizzati per l'indagine. Le uova sono stati ottenuti mantenendo i nematodi in acqua e permettendo le femmine di deporre le uova per 10 min. Le larve di secondo stadio (J2) sono stati sincronizzati incubando le uova per 24 ore a 25 ° C al buio, e il primo J4 sono stati ottenuti coltivando la J2 con muffa grigia, Botrytis cinerea, per un altro 52 h. A questo punto di tempo, la maggior parte dei nematodi J4 potrebbero essere chiaramente distinti come maschio o femmina usando la loro morfologia genitale. Il maschio e la femmina J4 sono stati raccolti e coltivate separatamente in due diverse piastre di Petri per 24 ore per ottenere nematodi adulti vergini. Un maschio e una femmina vergine vergine sono stati associati in una goccia di water nel pozzo di una diapositiva concava. Il comportamento di accoppiamento è stato girato con un videoregistratore allo stereomicroscopio. L'intera durata del processo di accoppiamento era 82,8 ± 3,91 min (media ± SE) e potrebbe essere diviso in 4 diverse fasi: ricerca, contatto, che copulano, e persistente. Il verbale medi di durata erano 21,8 ± 2,0, 28,0 ± 1,9, 25,8 ± 0,7 e 7,2 ± 0,5, rispettivamente. Undici sub-comportamenti sono stati descritti: crociera, si avvicina, incontrando, toccando, hoop, localizzare, allegando, eiaculazione, la separazione, quiescenza, e il roaming. È interessante notare che, evidente la concorrenza intra-sessuale è stata osservata quando una femmina è stata raggruppata con 3 maschi o un maschio con 3 femmine. Questo protocollo è utile e prezioso, non solo in indagare il comportamento di accoppiamento di B. xylophilus, ma anche in qualità di riferimento per studi comportamentali degli altri nematodi.

Introduction

Il nematode del pino, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner e Buhrer) Nickle, è una delle specie invasive più distruttive, che causa l'appassimento e la morte dei pini. Si ritiene che questo nematode patogeno sia originario degli Stati Uniti, ma è stato trasportato in diversi paesi, tra cui Cina, Giappone, Corea del Sud e Portogallo. Recentemente, è stato segnalato anche in Spagna, uccidendo milioni di pini con enormi perdite economiche e minacciando la produzione forestale e la stabilità ecologica^1-5.

Una volta che un pino ospite viene infettato dai nematodi del pino, migliaia di milioni di prole si propagano rapidamente all'interno del tronco. Ciò provoca una disfunzione dello xilema, con conseguente appassimento e infine la morte dell'albero ospite⁶. Tuttavia, attualmente non esiste un modo efficace per controllare questa malattia. Il comportamento di accoppiamento potrebbe svolgere un ruolo importante nell'elevata fecondità di questo nematode⁷. Abbiamo quindi studiato il comportamento di accoppiamento di B. xylophilus in laboratorio, cercando di trovare un modo efficace per disturbare il suo accoppiamento e diminuire la sua fecondità.

Questo protocollo ha lo scopo di introdurre i metodi dettagliati su come ottenere gli adulti vergini di B. xylophilus e su come osservare e analizzare il comportamento di accoppiamento utilizzando un videoregistratore e uno stereomicroscopio. Questo protocollo può essere utilizzato anche come riferimento per studi comportamentali di altri nematodi.

Protocol

1. Acquisizione di Virgin adulti Nematodi

1. Nematode del pino isolato e condizioni di coltura
   NOTA: Il B. xylophilus isolare Nxy61 è stato originariamente estratto da un malato massoniana Pinus nella zona di Ningbo della provincia di Zhejiang in Cina.
   1. Preparare Potato Dextrose Agar (PDA, vedere la Tabella dei Materiali) piastre per la coltivazione di Botrytis cinerea.
   2. Per l'inoculazione, pugno un pezzo di tappeto funghi con diametro di 10 mm da un tappeto di B. cinerea e metterlo al centro di una nuova piastra PDA. Culture B. cinerea per 5 d a 25 ° C al buio.
   3. Cultura i nematodi pineta nella capsula di Petri preparato contenente B. cinerea a 25 ° C al buio.
2. Acquisizione di B. xylophilus uova
   1. Posizionare un tubo di gomma bloccato sotto un imbuto e tenere l'imbuto preparata in un rack per montare ilApparecchio imbuto Baermann. Inserire due strati di carta filtro, invece di garza in bocca dell'imbuto.
   2. Trasferire le colture fungine per la messa a punto imbuto e aggiungere acqua fino a quando il tappeto fungina è immerso. Attendere 2 h, e nematodi usciranno dalla cultura fungina, attraversare la carta da filtro, e stabilirsi nella parte più bassa dell'imbuto Baermann.
   3. Raccogliere il primo paio di gocce di acqua dal fondo del tubo in un tubo da 15 ml e raccogliere nematodi rilasciando lentamente il morsetto sul tubo.
   4. Centrifugare le collezioni precedenti a 3.000 xg per 2 minuti a temperatura ambiente.
   5. Rimuovere lo strato superiore di acqua con una pipetta e risospendere con 1 ml di sterile bidistillata (dd) H ₂ O.
   6. Con una pipetta, trasferire la risospensione sopra per un piatto di Petri nuovo vetro (6 cm di diametro). Aggiungere 3 mL di soluzione sterile dd H ₂ O alla piastra di Petri per garantire che i nematodi sono in grado di nuotare liberamente.
   7. Tenere i nematodi nel bicchieres Petri per 10 min a 25 ° C al buio. Le uova saranno deposte da femmine gravide. A causa della loro superficie glicoproteina, le uova si attacchi al fondo del piatto di vetro Petri.
   8. Rimuovere l'acqua e vermi con attenzione, senza disturbare le uova. Aggiungere 3 ml di sterile dd H ₂ O per il piatto di vetro Petri immediatamente per evitare che le uova si secchi.
   9. Ripetere il passaggio 1.2.8 3x per rimuovere tutte le larve e gli adulti, e di ottenere le uova puri. Aggiungere un supplemento di 2 ml (5 ml in totale) di sterile dd H ₂ O alla piastra di Petri.
3. Acquisizione dei giovani quarto stadio (larve J4)
   1. Hatch le uova raccolte per 24 ore al buio a 25 ° C per ottenere J2 larve.
   2. Trasferire le larve J2 con una pipetta in una provetta 15 mL, centrifugare a 3000 xg per 2 minuti, e rimuovere lo strato superiore di acqua.
   3. Risospendere le larve J2 con 200 ml di sterile dd H ₂ O, e poi trasferirlila piastra PDA contenente B. cinerea.
   4. Cultura larve J2 per 52 ore a 25 ° C al buio. A questo punto di tempo, la maggior parte delle larve J2 avrà sviluppato nella fase iniziale della J4 larve.
4. Acquisizione di nematodi Adulto Vergine
   1. Preparare un ago per la raccolta di nematodi disegnando un capillare di vetro dopo il riscaldamento sopra un bruciatore di alcol.
      NOTA: La punta di questo ago capillare di solito deve essere di 50 micron di diametro, circa la larghezza del corpo di un nematode adulti, in modo che possa essere utilizzata come strumento per prelevare un singolo nematode.
   2. Assemblare un imbuto Baermann ed estrarre nematodi delle culture fungine per 2 ore, come descritto ai punti 1.2.1 - 1.2.3.
   3. Trasferire il J4 con acqua in un piatto pulito Petri.
   4. Osservare i nematodi allo stereomicroscopio e distinguere tra maschi e femmine per la morfologia dei genitali, come descritto da Mamiya e Kiyohara ⁸ (Figura 1 ). Prendete una nematode del sesso desiderato con l'ago capillare preparato e trasferirla alla piastra fungine-cultura adeguata per i maschi o femmine.
      NOTA: Non ci sono più donne che uomini, con la percentuale di femmine a 60 - 70%. La vulva femminile è ovviamente diversa dalla spicule maschile. Rispetto al l'adulto, il spicule o vulva in fase iniziale J4 è più piccolo, ma possono ancora essere facilmente visibile e distinto. Il nematode è sempre in movimento nell'acqua, che a volte aumenta la difficoltà di distinguere maschi e femmine.
   5. Cultura larve J4 per altre 24 ore a 25 ° C al buio.
      NOTA: Tutte le nematodi dovrebbero sviluppare in adulti, ma dal momento che sono disaccoppiati, essi sono considerati come adulti vergini.
   6. Assemblare due Baermann imbuti ed estrarre i adulti vergini dalle colture fungine per 2 ore, come descritto ai punti 1.2.1 - 1.2.3, e trasferire i maschi adulti e femmine vergini in due piatti separati puliti Petri.

2. Osservazione e registrazione video di comportamento di accoppiamento

1. Preparare diverse diapositive concave e aggiungere 200 ml di sterile dd H ₂ O a ciascuno dei loro pozzi.
2. Sollevare il preparato maschio adulto vergini o femminile e con un ago capillare e mettere solo un nematode nell'acqua di ogni diapositiva concava.
3. Mantenere le vergini adulti all'interno del pozzo per 1 ora per far loro adattarsi al nuovo ambiente acquoso.
4. Associare un maschio e femmina vergine trasferendo uno di loro da un bene ad un altro con una pipetta.
5. Osservare il comportamento di accoppiamento del 1♀ + 1♂ combinazione nella diapositiva concava allo stereomicroscopio.
6. Per analizzare l'efficienza di accoppiamento degli adulti vergini, calcolare il loro tasso di successo di accoppiamento (R) e confrontarlo con quello delle coppie di adulti selezionati in modo casuale. Calcolare R come la percentuale di repliche in cui si è osservata copulazione rispetto al numero totale di repliche studiati.
7. Per studiare scelta l'accoppiamento e la concorrenza intrasessuale, gruppo e osservare nematodi vergini di due diverse combinazioni: 1♀ + 3♂ e 3♀ + 1♂.
8. Al fine di raccogliere dati per l'analisi qualitativa e quantitativa, filmare il comportamento di accoppiamento con il video microscopia. Normalmente, l'intero processo di accoppiamento, dal momento in cui i nematodi sono posti nel pozzo della slitta concava al momento in cui si allontanano dopo l'accoppiamento, viene completata entro 2 ore. Pertanto, registrare il processo di accoppiamento continuo per almeno 2 ore come una replica. Completa almeno 30 replicati in totale per ciascuna combinazione.
   NOTA: Aggiungere più sterile dd H ₂ O (di solito 50 mL) ogni 0,5 h al pozzo per compensare l'evaporazione durante il processo di registrazione.

3. Raccolta dati

1. Guarda tutti i video accuratamente sullo schermo del computer e caratterizzare i sub-comportamenti qualitativamente.
2. Misurare la durata di accoppiamento utilizzando thfunzione e frame-by-frame del videoregistratore. sottrarre manualmente il tempo a partire dal punto finale.
3. Per la combinazione 1♀ + 1♂, analizzare ogni registrazione video e misurare la durata dei seguenti eventi:
   1. Misurare la durata di ricerca (cioè, il tempo da quando la femmina e maschio sono introdotti nel pozzo del vetrino concava al momento incontrano e contatto tra loro).
   2. Misurare la durata del contatto (cioè, il tempo dal primo contatto al momento in cui il maschio è esattamente posizionato vulva della femmina del primo accoppiamento).
   3. Misurare la durata di copulare (cioè, il tempo da quando il maschio è posizionata precisamente vulva della femmina fino a che scivola dal corpo della femmina dopo l'eiaculazione). Nota: alcuni nematodi possono copulare più volte in 2 ore. In tali casi, misurare la durata di copulazione dalla prima copulazione alla fine del last uno, compreso il tempo in mezzo.
   4. Misurare la durata di persistente (cioè, il periodo successivo accoppiamento finché il nuoto maschio e femmina distanti l'uno dall'altro e sono separati da una distanza di più di lunghezza del corpo dei nematodi '(di solito 1 mm)).
4. Contare la frequenza copulazione e la durata di ogni accoppiamento e la durata media di tutti copulazioni in 2 h per ciascuna delle diverse combinazioni (cioè, 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ e 1♀ + 3♂).
5. Calcolare il tasso di successo di accoppiamento per il primo contatto (P) per le diverse combinazioni come il tasso di successo di accoppiamento dopo il primo contatto, che è condotto immediatamente e senza alcuna interruzione. Nella fase a contatto, più contatti possono essere osservati prima copula reale.
   1. Quando la distanza tra due individui è superiore alla lunghezza del corpo, si consideri un contatto essere finita. Per una replica, record di P come il 100% quando l'accoppiamento is osserva immediatamente dopo il primo contatto, senza interruzione, o 0,00% se è stata osservata alcuna copulazione o se c'era copulazione ma dopo due o più contatti.
      NOTA: Ci sono stati 30 repliche per ogni combinazione qui descritta.

Results

Il tasso di successo di accoppiamento (R) degli adulti vergini era 86,67% in media, che era significativamente più elevata di quella degli adulti selezionati casualmente: 13,33 ± 4,65% (F = 1301,71, df = 1, p = 0,0001) (Figura 2). Questa scoperta suggerisce che è più facile osservare il comportamento di accoppiamento di B. xylophilus con gli adulti vergini che con gli adulti selezionati casualmente.

Discussion

test comportamentali sono un aspetto fondamentale di ecologia chimica, la neurobiologia, la biologia molecolare e la genetica. Nematodi, e in particolare C. elegans, sono ampiamente utilizzati per gli studi in questi settori. Il comportamento di accoppiamento di C. elegans è stato studiato in precedenza ^10-11. Tuttavia, B. xylophilus è gonochoristic e diverso dagli ermafroditi C. elegans, e il suo processo di accoppiamento ha diverse caratteristiche comportamentali ^9.<...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
B. xylophilus isolato Nxy61			Estratto da Pinus massoniana nell'area di Ningbo in Cina
Ceppo			Ottenuto da Forestry Academy of China
Baermann imbuti	Sengong
falcon tubi Sengong	Sengong
	Sengong
pipetta	Sengong
sterile dd H2O			Sterilizzato ad alta pressione di vapore a 121 gradi; C per 30 min.
Piastre di Petri	Sengong
PDA medio	Huankai Bio.	021050
incubatore	Sengong
Flusso laminare	Sengong
capillare in vetro	Sengong
Stereoscopio	Leica	LED5000 RL
Stereomicroscopio invertito	Zeiss	A1
vetrini concavi	Sengong