Unicellulare espressione genica Utilizzando Multiplex RT-qPCR per caratterizzare eterogeneità delle rare popolazioni linfoidi

Thibaut Perchet; Sylvestre Chea; Milena Hasan; Ana Cumano; Rachel Golub

doi:10.3791/54858

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Articolo metodologico

Unicellulare espressione genica Utilizzando Multiplex RT-qPCR per caratterizzare eterogeneità delle rare popolazioni linfoidi

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DOI:

10.3791/54858

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19 gennaio 2017

Thibaut Perchet¹ , Sylvestre Chea¹ , Milena Hasan² , Ana Cumano¹ , Rachel Golub¹

¹Unit for Lymphopoieseis, Immunology Department, INSERM U1223, University Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Institut Pasteur, ²Center for Translational Science, Institut Pasteur, INSERM UMS20

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive come valutare l'espressione di una vasta gamma di geni a livello clonale. Single-cell RT-qPCR produce risultati altamente affidabili con una forte sensibilità per le centinaia di campioni e geni.

Abstract

Espressione genica eterogeneità è una caratteristica interessante per indagare nelle popolazioni linfoidi. Espressione genica in queste cellule varia durante l'attivazione delle cellule, stress, o la stimolazione. Single-cell espressione genica multiplex consente la valutazione simultanea di decine di geni ^{^1,} ^{^2,} ^3. A livello di singola cellula, l'espressione genica multiplex determina popolazione eterogeneità ^{^4,} ^5. Esso permette la distinzione di eterogeneità della popolazione per determinare sia la probabile mix di diversi stadi precursori tra cellule mature e anche la diversità delle risposte delle cellule agli stimoli.

Cellule linfoidi innate (ILC) Recentemente sono state descritte come una popolazione di effettori innate della risposta immunitaria ^{^6,} ^7. In questo protocollo, l'eterogeneità delle cellule della ILC haVano Patic è indagato durante l'omeostasi.

Attualmente, la tecnica più utilizzata per valutare l'espressione genica è RT-qPCR. Questo metodo misura l'espressione genica solo un gene alla volta. Inoltre, questo metodo non può stimare eterogeneità di espressione genica, poiché più celle sono necessari per una prova. Questo porta alla misurazione dell'espressione genica media della popolazione. Nel valutare un gran numero di geni, RT-qPCR diventa un tempo-, e il metodo di campionamento che consumano reagent-. Quindi, i compromessi limitano il numero di geni o popolazioni di cellule che possono essere valutati, aumentando il rischio di perdere il quadro globale.

Questo manoscritto descrive come multiplex singola cellula RT-qPCR può essere utilizzato per superare queste limitazioni. Questa tecnica ha beneficiato di recente microfluidica progressi tecnologici ^{^1,} ^2. Le reazioni che si verificano in multiplex chip RT-qPCR non lo fanno exceed il livello nanolitro. Quindi, l'espressione genica cella singola, nonché simultanea espressione genica multipla, possono essere eseguite in un reagent-, di prova e conveniente modo. È possibile testare genica firma eterogeneità a livello clonale tra sottogruppi di cellule in una popolazione a diversi stadi di sviluppo o in diverse condizioni ^{^4,} ^5. Lavorando in rare popolazioni con un gran numero di condizioni a livello di singola cellula non è più una limitazione.

Introduzione

Nel corso degli ultimi anni, le cellule linfoidi innate (ILCS) sono stati sempre più studiati. Nonostante la loro mancanza di recettori antigene-specifiche, essi appartengono al lignaggio linfoidi e rappresentano sentinelle importanti per l'omeostasi dei tessuti e l'infiammazione. ILCs sono attualmente divisi in tre gruppi in base alla loro espressione di specifiche combinazioni di fattori di trascrizione e sulla loro capacità di produrre citochine ^{^6,} ^7.

ILC contribuiscono a numerose situazioni omeostatici e fisiopatologici in diversi organi attraverso la produzione di cit....