Unicellulare espressione genica Utilizzando Multiplex RT-qPCR per caratterizzare eterogeneità delle rare popolazioni linfoidi

Summary

Questo protocollo descrive come valutare l'espressione di una vasta gamma di geni a livello clonale. Single-cell RT-qPCR produce risultati altamente affidabili con una forte sensibilità per le centinaia di campioni e geni.

Abstract

Espressione genica eterogeneità è una caratteristica interessante per indagare nelle popolazioni linfoidi. Espressione genica in queste cellule varia durante l'attivazione delle cellule, stress, o la stimolazione. Single-cell espressione genica multiplex consente la valutazione simultanea di decine di geni ^{1, 2, 3.} A livello di singola cellula, l'espressione genica multiplex determina popolazione eterogeneità ^{4, 5.} Esso permette la distinzione di eterogeneità della popolazione per determinare sia la probabile mix di diversi stadi precursori tra cellule mature e anche la diversità delle risposte delle cellule agli stimoli.

Cellule linfoidi innate (ILC) Recentemente sono state descritte come una popolazione di effettori innate della risposta immunitaria ^{6, 7.} In questo protocollo, l'eterogeneità delle cellule della ILC haVano Patic è indagato durante l'omeostasi.

Attualmente, la tecnica più utilizzata per valutare l'espressione genica è RT-qPCR. Questo metodo misura l'espressione genica solo un gene alla volta. Inoltre, questo metodo non può stimare eterogeneità di espressione genica, poiché più celle sono necessari per una prova. Questo porta alla misurazione dell'espressione genica media della popolazione. Nel valutare un gran numero di geni, RT-qPCR diventa un tempo-, e il metodo di campionamento che consumano reagent-. Quindi, i compromessi limitano il numero di geni o popolazioni di cellule che possono essere valutati, aumentando il rischio di perdere il quadro globale.

Questo manoscritto descrive come multiplex singola cellula RT-qPCR può essere utilizzato per superare queste limitazioni. Questa tecnica ha beneficiato di recente microfluidica progressi tecnologici ^{1, 2.} Le reazioni che si verificano in multiplex chip RT-qPCR non lo fanno exceed il livello nanolitro. Quindi, l'espressione genica cella singola, nonché simultanea espressione genica multipla, possono essere eseguite in un reagent-, di prova e conveniente modo. È possibile testare genica firma eterogeneità a livello clonale tra sottogruppi di cellule in una popolazione a diversi stadi di sviluppo o in diverse condizioni ^{4, 5.} Lavorando in rare popolazioni con un gran numero di condizioni a livello di singola cellula non è più una limitazione.

Introduction

Nel corso degli ultimi anni, le cellule linfoidi innate (ILCS) sono stati sempre più studiati. Nonostante la loro mancanza di recettori antigene-specifiche, essi appartengono al lignaggio linfoidi e rappresentano sentinelle importanti per l'omeostasi dei tessuti e l'infiammazione. ILCs sono attualmente divisi in tre gruppi in base alla loro espressione di specifiche combinazioni di fattori di trascrizione e sulla loro capacità di produrre citochine ^{6, 7.}

ILC contribuiscono a numerose situazioni omeostatici e fisiopatologici in diversi organi attraverso la produzione di citochine specifiche ^{8, 9.} Per essere in grado di comprendere il ruolo di queste cellule, è importante determinare le varie sottopopolazioni ILC per organo e per identificare le loro relazioni evolutive. Inoltre, fenomeni di plasticità tra i diversi sottoinsiemi sono stati correlati. Studiando l'eterogeneitàdelle cellule presenti in un organo, è possibile delimitare la loro fase di maturazione e distinguere le loro funzioni specifiche.

Per illustrare la tecnica di multiplex cella singola RT-qPCR, ILC epatici sono stati scelti, con una particolare attenzione per la loro eterogeneità all'interno dello stesso gruppo ILC (tipo 1 ILC) ^10. Innanzitutto, attraverso l'uso di citometria a flusso, tre popolazioni ILC distinti stati caratterizzati nel fegato. Gruppo 1 ILC rappresenta circa il 80% degli effettori innati, mentre le altre due popolazioni sono rari popolazioni ILC epatiche (meno del 5% degli effettori innati). Quelle popolazioni sono stati ordinati utilizzando marcatori superficie cellulare ampiamente espresse delle popolazioni ILC. Come risultato, scelti popolazioni ILC nel fegato guardano uno sostanzialmente simile ad un altro.

Multiplex cella singola RT-qPCR è emerso come uno dei migliori tecniche per investigare prontamente l'eterogeneità di queste popolazioni ¹¹ . Due caratteristiche principali sono determinate dalla sfruttando il multiplex cella singola tecnica di RT-qPCR. Innanzitutto, cercando a livello clonale, è possibile recuperare l'espressione genica specifica delle cellule per il confronto tra le cellule che apparentemente mostrano stadi di sviluppo simili. Poi, cercando in una combinazione pre-selezionata di espressione genica, si determinerà nuove firme genetiche sulla base di modelli di espressione genica simultanee a un certo punto del tempo. Questi aspetti permettono la raccolta di una grande varietà di dati di espressione per un gran numero di cellule, anche in rare popolazioni, dato che la tecnica viene eseguita a livello clonale. In tal modo, l'eterogeneità ILC nel fegato può essere adeguatamente valutata.

Avanti, di classificare tutte le cellule con un fenotipo ILC globale, un'ampia panoramica della espressione genica multiple del fegato popolazioni ILC si ottiene, anche se rappresentano popolazioni estremamente rari. Un chip microfluidica-based consente la sperimentazione con ancorauna piccola quantità di materiale cellulare. Di conseguenza, i profili di espressione genica di popolazioni di cellule rare possono essere ottenuti. Usando in linea gene firma software di analisi, i cluster di popolazione cellulare e potenziali relazioni di cellule può essere indagato. Di conseguenza, i test funzionali possono essere eseguiti per convalidare i dati di clustering al livello in vivo.

Decine di espressione genica può essere stabilita contemporaneamente su centinaia o più celle singole sullo stesso chip ^{3, 11, 12.} Progettazione del saggio è la parte più lunga e più importante di questo esperimento. La determinazione dei geni rilevanti per l'ipotesi da testare è fondamentale per ottenere risultati rilevanti. In secondo luogo, sono necessari dei controlli interni (come marcatori di superficie noti utilizzati per l'ordinamento) e controlli specifici. Ciò è fondamentale per testare la specificità di primer di amplificazione, l'efficienza dell'amplificazione, e tegli assenza di concorrenza primer. Pertanto, lavorando con multiplex cella singola RT-qPCR è una tecnica risparmiare tempo, come espressione multipla gene di una cella è valutata allo stesso tempo.

Utilizzando lo stesso chip e miscelazione dei reagenti per tutte le celle limita i possibili errori di manipolazione e consente riproducibilità tra i campioni. Complessivamente, i diversi aspetti della multiplex singola cellula RT-qPCR consente la produzione di risultati altamente affidabili a livello clonale, con un grande livello di sensibilità per un'ampia varietà di campioni e geni. I risultati ottenuti offrono dati potenti e affidabili per i test di biostatistica.

Ciò può essere ottenuto grazie all'aspetto microfluidica del metodo, che consente di lavorare su piccolissime quantità di materiale e porta a risultati esaustivi. Infine, utilizzando software online, è possibile confrontare le popolazioni desiderati.

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati del da parte del Comitato per la sicurezza dell'Istituto Pasteur in conformità con l'agricoltura Ministero francese e gli orientamenti UE.

1. Preparare un 96 pozzetti Ordinamento Piastra Single-cell

1. Preparare mix pre-amplificazione in una provetta da 1,5 ml aggiungendo 5,0 ml di specifiche tampone retrotrascrizione, 1,3 ml di bassa dell'acido etilendiamminotetraacetico tampone (EDTA) TE (10 soluzione mM TE, pH 8, e la soluzione 0,1 mM EDTA, 0,2 mM filtrato ), e 0,2 ml di Taq DNA polimerasi per pozzetto (Figura 1a).
2. Su una piastra a 96 pozzetti, distribuire 6,5 microlitri di miscela pre-amplificazione in ciascun pozzetto (fino a 48 pozzetti). Questa piastra è la piastra di ordinamento cella singola 96 pozzetti.
   NOTA: L'utilizzo di un pipetta elettronica è consigliato per questo protocollo. Permette di misure precise e riproducibili del volume e fa risparmiare tempo.

(A) In 96 pozzetti single-cell sorting piatto, la miscela di pre-amplificazione è distribuito per primo, seguito dal mix dosaggio 0.2X. (B) La documentazione di ogni singola posizione cellule dovrebbe essere mantenuta su un foglio di calcolo. Un bene senza una cellula è chiamato un pozzo "no input" e può essere utilizzato come controllo. Due righe possono essere risparmiati per controllare l'efficienza di fondo con diluizione cDNA (sequenziali diluizioni uno-a-dieci dal equivalente di 10 ⁵ cellule di una cella). (C) Sulla piastra di test a 96 pozzetti, il reagente test di carico è distribuito prima, seguita dall'aggiunta di primer. Non dimenticare di mantenere un layout di ogni posizione primer. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

3. Preparare una miscela test 0.2x in una provetta da 1,5 ml aggiungendo 1,4 ml di ciascun primer (primer 20x, fino a 48 diverse sonde; vedere Tabella 1). Regolare il volume finale a 140 ml con basso tampone EDTA TE.
4. Distribuire 2.5 ml di miscela test 0.2x ai 48 pozzetti della piastra di ordinamento cella singola a 96 pozzetti contenente la miscela di pre-amplificazione.
   NOTA: Il volume finale in ciascun pozzetto della piastra del campione 96 pozzetti dovrebbe essere 9 microlitri.
5. Sigillare la piastra con un film di copertura. Vortice la piastra e spin giù a 280 g per 45 sec. Conservare la piastra a 96 pozzetti di smistamento single-cell a -20 ° C o usarlo subito.

2. La dissociazione Single Cell

1. Utilizzando un sistema di erogazione di CO _2, un mouse eutanasia dall'ipossia. Fissare il mouse su un piatto dissezione e aprire la cavità peritoneale longitudinalmente con le forbici.
2. Recuperare ILCs dal fegato.
   1. Prima di isolamento del fegato, a filo del livcellule ER-circolanti.
      1. Per far risaltare la vena porta, spostare il piccolo e crasso al lato sinistro del mouse; la vena porta appare come la più grande vena nella cavità peritoneale.
      2. Con una siringa da 10 ml e un ago 0,45 millimetri, lavare il fegato con mezzo tampone fosfato salino (PBS) attraverso la vena porta. Per facilitare vampate di fegato, tagliare l'arteria gastrica con le forbici.
      3. Per rimuovere la cistifellea, pizzicare la base della colecisti con una pinza e separarlo dal fegato con le forbici.
      4. Per isolare il fegato, stringere la base del fegato con una pinza, e con le forbici, separare il fegato dal resto della cavità peritoneale.
      5. Trasferire il fegato in un tubo Potter con 5 ml di terreno Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 2% di siero fetale bovino (FCS).
3. Dissociare il fegato con una dissociazione meccanico utilizzando un pestello. Trasferire il mezzo ad una provetta da 15 ml. Portare il volume totalea 14 ml con RPMI 2% FCS. Lasciare la sospensione cellulare in ghiaccio per 15-20 minuti a decantare epatociti.
4. Recuperare il surnatante (senza gli epatociti) in un nuovo tubo 15 ml con una pipetta 1 ml (12 ml del surnatante può aspettare). Centrifugare a 120 xg per 7 minuti a 10 ° C. Eliminare il surnatante dopo la centrifugazione.
5. Risospendere il pellet ottenuto al punto 2.4 in 14 ml di terreno gradiente di densità (ad esempio, Percoll 40%). Centrifugare a 600 xg per 20 min a 20 ° C. Rimuovere il surnatante tramite aspirazione.
6. Risospendere il pellet in 1 ml di acetato di potassio (ACK). Lasciare a temperatura ambiente per 1 min. Dopo 1 minuto, portare il volume totale di 14 ml con la soluzione di Hank Balanced Salato (HBSS) 2% FCS. Centrifugare a 120 xg per 7 minuti a 10 ° C. Eliminare il surnatante.
7. Macchiare le cellule.
   1. Risospendere il pellet in 300 ml di mix anticorpo biotinilato (si veda la tabella materiali, aggiungere tutti gli anticorpi biotinilati parlarendr) e trasferire le cellule in 1,5 ml di tubo. Lasciare al buio per 20 minuti a 4 ° C.
   2. Portare il volume totale di 1 ml con HBSS 2% FCS. Centrifugare a 120 xg per 7 minuti a 10 ° C. Risospendere il pellet in 300 ml di mix di anticorpi fluorocromo accoppiati e streptavidina coniugato a un fluorocromo (vedere la tabella dei materiali; aggiungere tutti gli anticorpi fluorocromi accoppiati menzionati). Lasciare al buio per 20 minuti a 4 ° C.
8. Portare il volume totale di 1 ml con HBSS 2% FCS. Centrifugare a 120 xg per 7 minuti a 10 ° C. Rimuovere il surnatante con una pipetta 1 ml. Risospendere il pellet in 1 ml HBSS e ioduro di propidio (Pi; 1: 4.000).
   NOTA: Quando si usano i marcatori di superficie cellulare ILC ampiamente espressi, sono definiti 3 popolazioni: NKp46 ⁺ IL-7Rα ^-, NKp46 ⁺ IL-7Rα ^+, e NKp46 ^- IL-7Rα ^+. Tutte le popolazioni sono ordinati lignaggio ^- CD3 ^- CD4 ^- CD45.2 ^+.

3. Single-cell fluorescenza-attivato cell sorting (FACS)

1. Utilizzare FACS per ordinare singole cellule ^13.
   NOTA: tipi di cellule differenti possono essere scelti sulla stessa piastra a 96 pozzetti classificare singola cellula (Figura 2).
   1. Utilizzare FACS per ordinare una cellula per pozzetto contenente la miscela test 0.2x e il mix preamplificazione sulla piastra a 96 pozzetti classificare singola cellula. Utilizzare una piastra di ordinamento cella singola da 96 pozzetti appena preparata o scongelare, se conservati a -20 ° C.
      1. Mettere una piastra a 96 pozzetti a tenuta sul supporto piastra FACS. Utilizzare una piastra a 96 pozzetti vuoto come test. Posizionare la piastra con il A1-bene sulla sinistra e verso lo sperimentatore.
      2. Regolare il portatarga per ottenere una goccia nel centro della A1 pozzetti con perline di verifica.
      3. Ripetere il passaggio 3.1.1.2 con tutti i pozzi in linea A.
      4. Rimuovere il sigillo dalla piastra a 96 pozzetti e di ordinamento 100 perle di verifica per bene. Verificare la presenza di dformazione rop nel centro dei pozzetti.
      5. Quando regolato correttamente, posizionare la piastra di ordinamento cella singola da 96 pozzetti sul supporto piastra. Disegnare il layout della piastra e ordinare 1 cellule per pozzetto.
         NOTA: Il corretto posizionamento di ogni cella sulla piastra di smistamento 96 pozzetti singola cellula è essenziale. Un layout piatto dovrebbe essere mantenuta su un foglio elettronico. Il layout piastra sarà utilizzato nei successivi passaggi (Figura 1b) ^14. Lasciare un pozzetto contenente miscela test 0.2x e mix di pre-amplificazione sul piatto del campione a 96 pozzetti, senza cellule. Questo pozzetto viene usato come controllo non-input. Lasciare due file di 6 pozzetti per una diluizione cDNA. Questi pozzi sono utilizzati come controlli per l'efficienza di primer (Figura 1b).
      6. Conservare la piastra a 96 pozzetti di smistamento single-cell a -20 ° C o usarlo subito.

4. Pre-amplificazione

1. Utilizzare una piastra di ordinamento cella singola OBT freschi o scongelati a 96 pozzettiained al punto 3.1.1.6. Vortice la piastra e girare verso il basso (280 xg per 45 sec).
2. Posizionare la piastra di ordinamento cella singola da 96 pozzetti sul termociclatore. Eseguire la trascrizione inversa e preamplificazione secondo il programma di cui in Figura 3 e nella tabella 2.

Figura 3: programma di pre-amplificazione. Per avere materiale sufficiente, è necessario pre-amplificazione specifici geni bersaglio su singole cellule ordinati. La piastra di ordinamento monocellulari 96 pozzetti è caricato su un termociclatore a seguire il programma pre-amplificazione. I prodotti pre-amplificazione vengono diluiti con bassa EDTA tampone TE e possono essere utilizzati immediatamente o congelati a -20 ° C. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

3. Diluire il pre-ampcampioni con diplomi con l'aggiunta di 36 ml di bassa tampone EDTA TE in ciascun pozzetto.
4. Sigillare la piastra con un film di copertura. Vortice la piastra e girare verso il basso (280 g per 45 sec). Conservare il, 96-pozzetti di ordinamento pre-amplificato single-cell a -20 ° C o usarlo subito.

5. preparare un campione piastra a 96 pozzetti

1. Preparare 191 ml di master mix con l'aggiunta di 175 ml di qPCR master mix e 17,5 ml di caricamento del campione reagente.
2. Su una nuova piastra a 96 pozzetti, distribuire 3,6 microlitri di master mix in ciascun pozzetto (fino a 48 pozzetti). Questo è il piatto del campione a 96 pozzetti.
3. Trasferire 2,9 ml di cDNA pre-amplificato dalla piastra del campione a 96 pozzetti alla nuova piastra a 96 pozzetti. Mantenere la stessa posizione per ciascun campione tra la piastra cell sorting 96-singolo e la piastra del campione a 96 pozzetti.
4. Sigillare la piastra con un film di copertura. Vortice la piastra e girare verso il basso (280 xg per 45 sec). Posizionare la nuova piastra a 96 pozzetti sul ghiaccio al riparo dalla luce. Conservare il 96 pozzetti sampio piatto a -20 ° C o utilizzare immediatamente.

6. Preparare una piastra Assay ben 96

1. Su una nuova piastra a 96 pozzetti, distribuire 3 ml di dosaggio di carico di reagente in ciascun pozzetto (fino a 48 pozzetti). Questa piastra è chiamata la micropiastra a 96 pozzetti.
2. Aggiungere 3 ml di primer in ogni pozzetto. Tenere un layout su un software di foglio di calcolo (Figura 1c e Tabella 1; utilizzare tutte primer elencati nella tabella 1). Il corretto posizionamento di ogni primer sulla piastra di test a 96 pozzetti è essenziale per i successivi passaggi.
   1. Se il numero di campioni è inferiore a 48, aggiungere acqua invece di primer per pozzi inutilizzati.
3. Sigillare la piastra con un film di copertura. Vortice la piastra e girare verso il basso (280 xg per 45 sec). Conservare la piastra a 96 pozzetti test a -20 ° C o usarlo subito.
   NOTA: per evitare cicli ripetuti di congelamento e scongelamento dei primer, distribuire i primer per il mix di pre-amplificazione e per il 96-WELl piastra di test allo stesso tempo.

7. Single-cell gene-espressione Chip

1. Posizionare il circuito integrato microfluidica (IFC) in panchina e controllare le valvole usando la siringa innevate. Aprire la siringa, posizionarlo perpendicolarmente alla valvola, e premere con decisione. L'o-ring deve muoversi. Riempire il circuito integrato con il liquido di controllo (0,3 ml di tubercolina).
2. Ripetere il passaggio 7.1 con la seconda valvola.
   NOTA: Nessun liquido deve essere versato sopra il chip.
3. Rimuovere la pellicola blu dal fondo della piastrina. Caricare il chip nel controller IFC. Sullo schermo del controller IFC, selezionare "PRIME" e poi su "Esegui". Il controllo delle linee microfluidica durano 10 min.
4. Estrarre il chip e ri-sigillare la pellicola blu sul fondo della piastrina.

Figura 4: Single-cell multiplex di espressione genica di chip di carico. Questi passaggi richiedono gprecisione reat, in particolare durante il trasferimento della piastra a 96 pozzetti per il multiplex gene chip-espressione della singola cellula. Per evitare errori di carico e misplacements, si consiglia vivamente di lavorare in modo sequenziale. Il volume preso per ogni trasferimento deve essere controllata durante il processo di pipettaggio. Infine, è importante per evitare eventuali bolle e per rimuoverli in caso di formazione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

5. Usando una pipetta a 8 canali, trasferimento 5 microlitri dalla piastra dosaggio 96 pozzetti sul lato A1 (lato sinistro) del chip. Riempire il lato sinistro del circuito integrato, come indicato in figura 4. Fare attenzione a disegnare sempre lo stesso volume nelle punte.
   1. Non creare bolle. Se appaiono bolle, rimuoverli con 10 consigli microlitri. Modifica suggerimenti per ogni pozzetto del chip.
6. Ripetere il passaggio 7.5 sul lato destro of chip con 5 microlitri dalla piastra campione 96 pozzetti.
7. Rimuovere la pellicola blu dal fondo della piastrina. Caricare il chip nel controller IFC. Sullo schermo del controller IFC, selezionare "Run Script" e poi "RUN". Il caricamento delle linee microfluidica dura 45 min.
8. Estrarre il chip e ri-sigillare la pellicola blu sul fondo della piastrina.

8. Eseguire il Chip

1. Sul computer microfluidica qPCR, selezionare il software "Raccolta dati". Una volta che comincia, selezionare "Nuovo Esegui".
2. Selezionare "Eject", rimuovere la pellicola blu dal fondo della piastrina, e caricare il chip. Posizionare il chip per ottenere A1 bene sulla sinistra e verso lo sperimentatore.
3. Su "l'impostazione del progetto," selezionare "Nessuno" e poi su "Avanti".
4. Selezionare "Esegui nuovo chip", "directory nuovo chip" (creare una cartella per l'esperimento), e "Avanti".
5. Su "L'espressione genica" selezionare "; Riferimento passivo = ROX "(carbossi-x-rodamina) e" Sonda unico; "selezionare il filtro corretto secondo i primer Selezionare." Avanti ".
6. Selezionare "Sfoglia" e selezionare il programma corretto in base ai primer utilizzati.
   NOTA: "Default-10min-Hotstart.pcl" è il programma più utilizzato per multiplex cella singola RT-qPCR.
7. Selezionare "Start Esegui". La reazione dura circa 90 min.
8. Una volta terminato, selezionare "Eject-Done".

9. Analisi dei dati

1. Aprire il software "Real-Time PCR Analisi", selezionare "File" e "Open", trovare la cartella esperimento, e selezionare "il file ChipRun.bml."
2. Clicca su "Analisi View", "Tabella risultati" e "Heat Map View;" campi contrassegnati con una "X" sono al di sotto del livello di rilevamento di soglia e / o aveva curve di amplificazione cattivi.
3. Nome i campioni. Vai a "Configurazione di esempio" e SELect "Nuovo SBS 96." Clicca su "Mapping" e selezionare "..." Copia e incolla il layout design campione dal software del foglio elettronico. Definire il layout incollato come "Nome del campione."
4. Nome i saggi. Ripetere il punto 9.3 con i nomi di primer in "Setup Detector". Definire il layout incollato come "Nome Detector".
5. Clicca su "Analisi vista" e "Analizza"; i nomi dei campioni e di primer saranno attribuiti automaticamente ai campioni e primer (Figura 7).
6. Calcolare Ct, Delta Ct, e Piega Change per ogni campione. Utilizzare un gene housekeeping come controllo interno (qui, GAPDH):
   ΔCt = Ct _campione - _{controllo interno} Ct
   Piegare Change = 2 ^{- (controllo ΔCtsample-ΔCtnegative)}
   1. Fare clic su "Setup Detector" e selezionare il pozzo senza alcun controllo di input (utilizzare il gene housekeeping come controllo interno per normalizzare l'espressione genica). Selezionare "EDitor "," definire il riferimento, "e" Update ".
   2. Selezionare tutti i pozzetti a cui verrà applicato il controllo interno sopra definito. Selezionare "Editor" e "definire Test". Selezionare un gene di riferimento appropriato e fare clic su "Aggiorna".
   3. Selezionare "Impostazioni di esempio" per selezionare bene il controllo negativo. Selezionare "Editor" e definire "di riferimento". Fai clic su "Update".
   4. Selezionare "Analisi View" e "Analizza"; Delta del Ct e piega Change verranno automaticamente calcolate.
7. Esportare i dati. Selezionare "File" e "Esporta, salva come" tabella dei risultati ", selezionare la cartella di destinazione e premere" Salva "e" Exit ".
8. Ripetere il passaggio 9.7, ma invece di "tabella dei risultati," Salva con nome "HeatMap risultati".

Results

popolazioni linfoidi grandi differenze in termini di espressione genica. In questo protocollo, fegato vano ILC eterogeneità è stata studiata usando multiplex cella singola RT-qPCR espressione genica. A differenza di altre tecniche di espressione genica, multiplex cella singola RT-qPCR espressione genica permette lavori su varie popolazioni, anche i più rari, allo stesso tempo. Questa specificità, accoppiato con un elevata sensibilità a livello clonale, permette la ricerca di differenze d...

Discussion

Questo protocollo descrive come ottenere informazioni esaustive espressione genica a livello clonale. Qui, abbiamo studiato il fegato ILC eterogeneità vano. Dopo l'ordinamento cella singola di diverse popolazioni ILC (sulla base di marcatori di superficie ILC ampiamente espresse), i campioni sono stati pre-amplificati per specifici geni pre-selezionati. Poi, il cDNA ottenuto e primer sono stati caricati su un multiplex RT-qPCR chip microfluidico. Infine, abbiamo ottenuto l'espressione di 48 geni diversi dal 48 s...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit qRT-PCR Cells Direct One Step	Biosystems applicati	11753100	Kit di rilevamento della sonda di innesco. Contiene 2x miscela di reazione, enzima platinio SSIII.
Tampone EDTA a basso TE	Affymetrix	75793 100ML
Piastre a 96 pozzetti	Thermofisher Scientific	AB 1100	Piastre a 96 pozzetti adattate per la selezione cellulare e il termociclo
Film di copertura	Dominique Dutscher	106570	film di copertura in alluminio; evitare la contaminazione e l'evaporazione
Actb	Thermofisher Scientific	Mm00607939_s1	20x primer
Aes	Thermofisher Scientific	Mm01148854_s1	20x primer
Ahr	Thermofisher Scientific	Mm00478932_s1	20x primer
Bcl2	Thermofisher Scientific	Mm00477631_s1	20x primer
c-myc	Thermofisher Scientific	Mm00487804_s1	20x primer
Cbfb	Thermofisher Scientific	Mm01251026_s1	20x primer
Cd27	Thermofisher Scientific	Mm01185212_s1	20x primer
Cd49a	Thermofisher Scientific	Mm01306375_s1	20x primer
CD49b	Thermofisher Scientific	Mm00434371_s1	20x primer
Cxcr5	Thermofisher Scientific	Mm00432086_s1	20x primer
Cxcr6	Thermofisher Scientific	Mm02620517_s1	20x primer
Eomes	Thermofisher Scientific	Mm01351985_s1	20x primer
Ets1	Thermofisher Scientific	Mm01175819_s1	20x primer
Foxo1	Thermofisher Scientific	Mm00490672_s1	20x primer
Gapdh	Thermofisher Scientific	Mm03302249_s1	20x primer
Gata3	Thermofisher Scientific	Mm00484683_s1	20x primer
Gm-csf	Thermofisher Scientific	Mm01136644_s1	20x primer
Hes1	Thermofisher Scientific Mm01342805_s1		20x primer
Hprt	Thermofisher Scientific	Mm00446968_s1	20x primer
Id2	Thermofisher Scientific	Mm01293217_s1	20x primer
Il-12rb2	Thermofisher Scientific	Mm00711781_s1	20x primer
Il-18r1	Thermofisher Scientific	Mm00515178_s1	20x primer
Il-1rl1	Thermofisher Scientific Mm00434237_s1		20x primer
Il-22	Thermofisher Scientific Mm001226722_s1		20x primer
Il-23r	Thermofisher Scientific	Mm00519943_s1	20x primer
Il-2ra	Thermofisher Scientific	Mm01340213_s1	20x primer
Il-2rb	Thermofisher Scientific	Mm01195267_s1	20x primer
IL-7r	Thermofisher Scientific	Mm00434295_s1	20x primer
Klr5	Thermofisher Scientific	Mm04207528_s1	20x primer
Lef1	Thermofisher Scientific	Mm00550265_s1	20x primer
Ncr1	Thermofisher Scientific	Mm01337324_s1	20x primer
Nfil3	Thermofisher Scientific	Mm01339838_s1	20x primer
Notch1	Thermofisher Scientific	Mm00435249_s1	20x primer
Notch2	Thermofisher Scientific	Mm00803069_s1	20x primer
Rora	Thermofisher Scientific	Mm01173766_s1	20x primer
Rorc	Thermofisher Scientific	Mm01261022_s1	20x primer
Runx3	Thermofisher Scientific	Mm00490666_s1	20x primer
Tbx21	Thermofisher Scientific	Mm01299453_s1	20x primer
Tcf3	Thermofisher Scientific	Mm01175588_s1	20x primer
Tcf7	Thermofisher Scientific	Mm00493445_s1	20x primer
Tle1	Thermofisher Scientific	Mm00495643_s1	20x primer
Tle3	Thermofisher Scientific	Mm00437097_s1	20x primer
Tsc22d3	Thermofisher Scientific	Mm01306210_s1	20x primer
Tnfrsf11a	Thermofisher Scientific	Mm00437132_s1	20x primer
Tox	Thermofisher Scientific	Mm00455231_s1	20x primer
Zbtb16	Thermofisher Scientific	Mm01176868_s1	20x primer
Zbtb7b	Thermofisher Scientific	Mm00784709_s1	20x primer
qPCR Master mix	Applied BioSystems	P/N 4304437
2x Reagente di caricamento del saggio	Fluidigm	P/N 85000736	Terreno a densità specifica per caricare saggi in chip microfluidico multiplex RT-qPCR.
2x Reagente di caricamento del campione	Fluidigm	P/N 85000735	Terreno a densità specifica per caricare i campioni nel chip microfluidico multiplex RT-qPCR.
48.48 chip microfluidico multiplex RT qPCR	Fluidigm	BMK-M-48.48	48.48 Dynamic Array IFC per l'espressione genica; chip per reazione RT-qPCR multiplex a cella singola
48.48 multiplex RT qPCR controllore di chip microfluidico	Fluidigm	89000020	48.48 IFC Controller; controllare il sistema fluidico interno del chip, caricare campioni e saggi nelle camere di reazione
multiplex RT qPCR termociclatore microfluidico	Fluidigm	GE48.48	48.48 Dynamic Array IFC termociclatore
a 96 pozzetti	Thermofisher Scientific	AB 1100	Piastre a 96 pozzetti adattate per la selezione cellulare e il termociclo
di topi C57Bl/6	Janvier	C57Bl/6 miceJ@RJ
siringa da 10 ml	BD Biosciences	309639
PBS	Life Technologies	14040174
HBSS	Life Technologies	24020133
RPMI	Life Technologies	61870044
FCS	CVFSVF000U	Eurobio Abcys	Siero fetale di vitello standard
Potter tubo	N/A Tubo
15 ml	Corning	352097
Tubo da 1,5 ml	Sigma-Aldrich	T9661-1000EA
Macchina FACS	N/A
centrifuga	Thermofisher Scientific 75004538
1.000 µ l punte	Fisher Scientific	10313272
P1000	Gilson	F123602
Percoll	Dominique Dutscher	17-0891-01
Facs tubo	Falcon	352235
anti-CD8 Anticorpo di topo alla biotina	Anticorpo di lignaggio	Sony	1103520
anti-CD19 Anticorpo di topo alla biotina	Anticorpo di	lignaggio	1177520
anti-TCRab Anticorpo di topo alla biotina	BioLegend	Anticorpo di	lignaggio
anti-TCRgd Anticorpo di topo di biotina	BD Biosciences	Anticorpo di lignaggio	di 553176
anti-Ter119 Anticorpo di topo di biotina	BD Biosciences	Anticorpo di lignaggio	di 553672
anti-Gr1 Anticorpo di topo di biotina	BD Biosciences	Anticorpo di	lignaggio
anticorpo anti-CD45.2 PerCPCy5.5 anticorpo di topo	BioLegend	109828
anti-IL7ra PeCy7 anticorpo di topo	ebioSciences	25-1271-82
anti-CD3 BV510 anticorpo di topo	BD Biosciences	563024
anti-CD4 BV786 anticorpo di topo	BD Biosciences	563727
anti-NKp46 PE anticorpo di topo	ebioSciences	12-3351-82
Streptavidina	Sony	2626025
		Pipetta elettronica Eppendorf
		4986000017
Pipetta		30089405Rainin
		L8-10XLS+
Accuis	BD Bioscience	345249	per FACS