Questo protocollo utilizza sia coexpression subunità e postlysis subunità miscelazione per un esame più approfondito di assemblaggio proteasoma ricombinante.
Articolo metodologico
Questo protocollo utilizza sia coexpression subunità e postlysis subunità miscelazione per un esame più approfondito di assemblaggio proteasoma ricombinante.
Proteasomi si trovano in tutti i campi della vita. Essi forniscono la principale via di degradazione delle proteine intracellulari negli eucarioti, anche se il loro montaggio non è completamente noto. Tutti i proteasomi contengono una particella strutturalmente conservato nucleo (CP), o 20S proteasoma, contenente due anelli subunità beta heptameric a sandwich tra due anelli α subunità heptameric. Archaeal 20S proteasomi sono compositivo semplice rispetto alle loro controparti eucariotiche, ma entrambi condividono un meccanismo di montaggio comune. Di conseguenza, archaeal 20S proteasomi continuano ad essere modelli importanti per il montaggio del proteasoma eucariotica. In particolare, l'espressione ricombinante della 20S archeali proteasomi accoppiato con nondenaturing gel di poliacrilammide (PAGE) ha prodotto molti importanti intuizioni proteasoma biogenesi. Qui, si discute un mezzo per migliorare la solita strategia di coexpression di α proteasoma archeali e subunità beta prima nondenaturing PAGINA. Abbiamo dimostrato che, anche se rapido ed efficace, un approccio coexpression solo può mancare intermedi chiave di montaggio. Nel caso del proteasoma, coexpression potrebbe non consentire il rilevamento del semi-proteasoma, una contenente una α-anello completo intermedio e una β-anello completo. Tuttavia, questo intermedio è facilmente rilevata tramite lisato di miscelazione. Si suggerisce che la combinazione coexpression con lisato di miscelazione produce un approccio più completo per l'analisi di assemblaggio, ma rimane non intensiva del lavoro. Questo approccio può essere utile per lo studio di altri complessi multiproteici ricombinanti.
Complessi multiproteici svolgono numerose attività cellulari critiche 1. Per molti di questi complessi, molto di più si sa sulla loro struttura e la funzione di circa il loro montaggio 2,3. Il proteasoma è un tale complesso e si trova in tutti i campi della vita. In eucarioti, questa macchina molecolare è alla base del sistema Proteasome / ubiquitina (UPS) e fornisce la principale via di degradazione delle proteine intracellulari 4. Il proteasoma eucarioti (indicato come il proteasoma 26S) è composto da due grandi gruppi di sub: un proteasoma 20S, o Core Particle (CP) 5, che può essere limitato a una o entrambe le estremità....
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1. Espressione batterica.
Nota: plasmidi di espressione utilizzati in questo studio sono descritti nella Tabella 1. Soluzioni, media e tamponi utilizzati in questo studio sono descritti nella tabella 2. La clonazione di geni proteasoma subunità archeali e la generazione di plasmidi di espressione sono descritte altrove 18,20. In breve, i plasmidi per coexpression ricombinante di subunità impiegano una strategia operone bicistronico che aiuta a ottenere livelli di espressione comparabili di singole subunità 18,20. I parametri di espressione elencati di seguito sono stat....
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Assemblaggio proteasoma (Figura 1) inizia quando subunità alfa si combinano per anelli di forma 9. Ciò può essere illustrato quando alfa subunità dalla archaeon Methanococcus maripaludis S2 sono espressi in E. coli come C-terminale hexahistidine tag (His-tag) derivati (Tabella 1). Quando la α-la proteina ricombinante è stata purificata dall'ICAR e analizzata mediante nondenaturing PAGE, due bande sono state osservate (Figura 2A, corsia 1.......
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Dimostriamo il vantaggio di un approccio combinato di analizzare il montaggio proteasoma da nondenaturing pagina utilizzando proteasomi archeali ricombinanti. Il metodo usuale 9,11 di coexpression batterica subunità del proteasoma permette una rapida analisi, ma non può rivelare intermedi chiave di montaggio. Vi proponiamo la combinazione coexpression con lisato di miscelazione per sviluppare un quadro più ampio di eventi di assemblaggio.
Il vantaggio di questo approccio combinato.......
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una ricerca di sostegno i fondi delle sovvenzioni (RSFG) da Indiana University-Purdue University, Indianapolis, e in parte da un premio dalla American Heart Association 14GRNT20390154, di ARK
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione di acrilammide (40%) | Biorad | 1610104 L'acrilammide | non polimerizzata è una neurotossina. Indossare indumenti protettivi adeguati |
| Filtri centrifughi Amicon ultra 0,5 mL | EMDMillipore | UFC501024 | |
| Persolfato di ammonio | Sigma | A3678 | |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| Kit di analisi BCA | Pierce | 23225 | |
| Soluzione di bisacrilammide (2%) | Biorad | 1610142 | |
| Blu | di bromofenoloSigma | B8026 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| Ditiotreitolo (DTT) | Thermo Fisher | BP172 | |
| E. coli BL21 cellule competenti | EMD Millipore | 69450 | |
| GelCode Blue | Thermo Fisher | 24592 | Reagente colorante di coomassie colloidale per gel |
| Gel doc EZ system | Biorad | 1708270 | Biorad |
| 1653320 | Plastica a forma di cuneo utilizzata per separare le piastre di gel; utile per la diffusione di liquidi. | ||
| Bacchetta di vetro | Thermo Fisher | 11-380B | |
| Glycerol | Sigma | 49767 | |
| Glycine | Thermo Fisher | BP3865 | |
| Siringa Hamilton | Thermo Fisher | 14-813-38 | Siringa in vetro per caricamento gel |
| HEPES | US Biologicals | H2010 | |
| HMW Kit di calibrazione nativa | GE Healthcare | 170445-01 | Standard proteici ad alto peso molecolare |
| Hoefer SG30 | Thermo Fisher | 03-500-277 | Creatore di gradiente |
| Imidazole | US Biologicals 280671 | ||
| IPTG | US Biologicals | I8500 | Per l'induzione dell'espressione proteica |
| Isopropanolo | Thermo Fisher | BP26181 | |
| Kanamicina solfato | US Biologicals | K0010 | |
| Lisozima | Sigma | L6876 | |
| MgCl2 | Fluka analytical | 630680 | |
| Mini Protean Tetra Cell | Biorad | 1658002EDU | Apparecchio per elettroforesi su gel |
| NaCl | Thermo Fisher | S640-3 | |
| NaOH | Thermo Fisher | S318-1 | |
| Pefabloc SC | Roche | 11429876001 | Inibitore della proteasi |
| pET42 | EMD Millipore | 70562 | Plasmide |
| di espressione Precisione più tutto lo standard | blu Biorad | 1610373 | Standard di proteine molecolari per SDS-PAGE |
| Kit di mutagenesi a cambio rapido | Tecnologie Agilent | 200521 | |
| Sodio Dodecil Solfato (SDS) | Thermo Fisher | BP166 | |
| Suc-LLVY-AMC | Enzo lifesciences | BML P802-0005 | Substrato fluorogenico |
| Talon Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | Immobilized Cobalt Affinity Resin |
| TEMED | Sigma | T7024 | |
| Tris | US Biologicals | T8600 | |
| Triton-X100 | Sigma | 93426 | |
| Tryptone | Bacto BD | ||
| vassoio per campioni UV | Biorad | 1708271 | Per l'imaging UV di gel |
| Estratto di lievito | Bacto BD | 212720 |
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