Descriviamo qui un protocollo ottimizzato di saggi fluorescenti elettroforetiche Mobility Shift (Femsa) utilizzando purificati SOX-2 proteine insieme con colorante fluorescente marcato sonde di DNA a infrarossi come un caso di studio per affrontare un'importante questione biologica.
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Articolo metodologico
Un protocollo ottimizzato per elettroforetica Mobility Shift Assay Utilizzando oligonucleotidi infrarosso colorante fluorescente etichettati
In questo articolo
Sommario
Abstract
Elettroforetiche saggi Mobility Shift (EMSA) sono uno strumento fondamentale per caratterizzare le interazioni tra proteine e le loro sequenze di DNA bersaglio. La radioattività è stato il metodo predominante di etichettatura DNA in EMSAs. Tuttavia, recenti progressi nella coloranti fluorescenti e metodi di scansione hanno spinto l'uso di marcatura fluorescente di DNA come alternativa alla radioattività per i vantaggi di maneggevolezza, risparmiando tempo, riducendo i costi e migliorare la sicurezza. Abbiamo recentemente utilizzato EMSA fluorescente (Femsa) per affrontare con successo un importante questione biologica. La nostra analisi FEMSA fornisce una visione meccanicistica in l'effetto di una mutazione missenso, G73E, nel HMG fattore di trascrizione altamente conservata SOX-2 on olfattiva diversificazione tipo neurone. Abbiamo scoperto che mutante SOX-2 proteina G73E altera il DNA specifica attività di legame, causando in tal modo olfattiva trasformazione neurone identità. Qui, vi presentiamo un ottimizzato e conveniente step-by-step di protocolloper Femsa utilizzando fluorescenti infrarossi oligonucleotidi dye-marcato contenenti le LIM-4 / SOX-2 siti di destinazione adiacenti e purificati SOX-2 proteine (WT e mutanti SOX-2 proteine G73E) come un esempio biologico.
Introduzione
EMSAs sono utilizzati per analizzare interazioni tra DNA e proteine utilizzando nativo SDS-PAGE (PAGINA) per risolvere una miscela di una proteina di interesse e una sonda di DNA marcata contenente potenziali siti bersaglio della proteina 1. Una sonda DNA legato con proteine migrerà più lento rispetto a una sonda di DNA libero, ed è quindi ritardato nella sua migrazione attraverso una matrice di poliacrilammide. Radiomarcatura di DNA da 32 P è stato il metodo predominante per il rilevamento in EMSAs. Anche se l'applicazione di radiomarcatura in ricerca biochimica è stato vantaggioso, i metodi di etichettatura DNA alternativa con sensibilit....
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Protocollo
NOTA: EMSAs utilizzando sonde di DNA fluorescente o altre forme di DNA marcato condividono gli stessi protocolli per la preparazione di proteine o estratto cellulare, la proteina-DNA reazione di legame, e la preparazione del gel PAGE e in esecuzione (Figura 1A). Le principali differenze sono procedure DNA di etichettatura, fasi di lavorazione gel post-visione e metodi di rilevamento.
1. Gel di Preparazione
- Preparare 5% gel di poliacrilammide nativo contenente 0,5x TBE (45 mM Tris-borato, 1 mM EDTA) e il 2,5% glicerolo, utilizzando un mini sistema di gel di proteine (8,3 cm di larghezza x 7.3 cm di spessore di lunghezza x 0,75 mm)....
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Risultati
Arancio G loading dye (6x: 0,12 g arancione G in 100 ml 30% glicerolo) possono essere aggiunti alla reazione di legame prima del caricamento per visualizzare il progresso della elettroforesi. Altri coloranti di carico tra cui blu bromofenolo saranno rilevati durante la scansione e quindi interferire con l'analisi delle immagini (Figura 1B).
In alcuni casi di EMSAs, soprattutto se si utilizza la preparazion.......
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Discussione
fEMSAs sono uno strumento efficace per studiare le interazioni proteina-DNA, e sono una alternativa alla marcatura radioattiva del DNA. Coloranti fluorescenti come coloranti infrarossi sono disponibili in commercio, e forniscono un metodo più sicuro e più ecologico rispetto all'etichettatura DNA radioattivo. EMSAs utilizzando fluorescenti infrarossi oligonucleotidi dye-marcato non richiedono fasi di lavorazione gel postrun, e quindi risparmiare tempo e costi rispetto ad altre tecniche di marcatura del DNA. Il tempo .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da una Alfred P. Sloan Research Fellowship (a C.-F.C.) e da una sovvenzione NIH R01 (5R01GM098026-05 a C.-F.C.). Ringraziamo David Crowe per l'accesso all'avanzato sistema di imaging a infrarossi.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione di acrilammide/bis al 30%, 37,5:1 | Bio-Rad | 1610158 | l'acrilammide è dannosa e tossica. |
| 6x-HIS Epitope Tag Antibody (HIS. H8) | ThermoFisher | MA1-21315 | |
| Anti-Flag M2 anticorpo | Sigma-Aldrich | F3165-.2MG | |
| Albumina sierica bovina (BSA) grado di biologia molecolare | New England Biolabs | B9000S | |
| 5'IRDye700-labeled DNA Oligos | Integrated DNA Technologies | Custom DNA oligo | Questi sono indicati come "5'Dye-labeled o infrarossi fluorescente colorante marcato DNA oligos" nel manoscritto. L'azienda sintetizzerà su misura 5' oligonucleotidi di DNA marcati con IRDye. Richiede almeno 100 μ Sintesi in scala M e purificazione HPLC. |
| Frammento di Klenow (3'-->5' exo-) | New England Biolabs | M0212S | |
| LightShif Poly (dI-dC) | ThermoFisher | 20148E | |
| Mini-PROTEAN Cella di elettroforesi verticale | Bio-Rad | 1658000FC | Nel manoscritto ci si riferisce a questo come a un "mini sistema di gel proteico". Qualsiasi sistema elettroforetico può essere utilizzato purché si tratti di lastre di vetro trasparente di dimensioni inferiori a 25 cm x 25 cm. |
| Sistema di imaging a infrarossi Odyssey CLx | LI-COR Biotecnologia | Sistema di imaging a infrarossi Odyssey CLx | Nel manoscritto viene definito "sistema avanzato di imaging a infrarossi". |
| Sistema di imaging Odyssey Fc | LI-COR Biotechnology | Odyssey Fc | Nel manoscritto viene definito "sistema di imaging fluorescente nel vicino infrarosso principalmente per Western blot". |
| Software Image Studio (versione 4.0) | LI-COR Biotecnologia | Software Image Studio | Questo è indicato come un 'particolare software di imaging' nel manoscritto. |
| Arancio G | Sigma-Aldrich | O3756-25G | |
| 6x Colorante | 0,25% Arancio G; 30% Glicerolo | ||
| 0,5x TBE | 45 mM Tris-Borato; 1 mM EDTA | ||
| 1x TE | 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA | ||
| 1x STE | 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA | ||
| 5x Tampone | legante50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM di NaCl; 200 mM KCl; 5 mM di MgCl2; 5 mM EDTA, pH 8,0; 5 mM DTT; 250 μ g/mL BSA |
Riferimenti
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
- Ludwig, L. B., Hughes, B. J., Schwartz, S. A.
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Ristampe e permessi
