Un protocollo ottimizzato per elettroforetica Mobility Shift Assay Utilizzando oligonucleotidi infrarosso colorante fluorescente etichettati

Summary

Descriviamo qui un protocollo ottimizzato di saggi fluorescenti elettroforetiche Mobility Shift (Femsa) utilizzando purificati SOX-2 proteine ​​insieme con colorante fluorescente marcato sonde di DNA a infrarossi come un caso di studio per affrontare un'importante questione biologica.

Abstract

Elettroforetiche saggi Mobility Shift (EMSA) sono uno strumento fondamentale per caratterizzare le interazioni tra proteine ​​e le loro sequenze di DNA bersaglio. La radioattività è stato il metodo predominante di etichettatura DNA in EMSAs. Tuttavia, recenti progressi nella coloranti fluorescenti e metodi di scansione hanno spinto l'uso di marcatura fluorescente di DNA come alternativa alla radioattività per i vantaggi di maneggevolezza, risparmiando tempo, riducendo i costi e migliorare la sicurezza. Abbiamo recentemente utilizzato EMSA fluorescente (Femsa) per affrontare con successo un importante questione biologica. La nostra analisi FEMSA fornisce una visione meccanicistica in l'effetto di una mutazione missenso, G73E, nel HMG fattore di trascrizione altamente conservata SOX-2 on olfattiva diversificazione tipo neurone. Abbiamo scoperto che mutante SOX-2 proteina ^G73E altera il DNA specifica attività di legame, causando in tal modo olfattiva trasformazione neurone identità. Qui, vi presentiamo un ottimizzato e conveniente step-by-step di protocolloper Femsa utilizzando fluorescenti infrarossi oligonucleotidi dye-marcato contenenti le LIM-4 / SOX-2 siti di destinazione adiacenti e purificati SOX-2 proteine (WT e mutanti SOX-2 proteine ^G73E) come un esempio biologico.

Introduction

EMSAs sono utilizzati per analizzare interazioni tra DNA e proteine utilizzando nativo SDS-PAGE (PAGINA) per risolvere una miscela di una proteina di interesse e una sonda di DNA marcata contenente potenziali siti bersaglio della proteina ^1. Una sonda DNA legato con proteine ​​migrerà più lento rispetto a una sonda di DNA libero, ed è quindi ritardato nella sua migrazione attraverso una matrice di poliacrilammide. Radiomarcatura di DNA da ³² P è stato il metodo predominante per il rilevamento in EMSAs. Anche se l'applicazione di radiomarcatura in ricerca biochimica è stato vantaggioso, i metodi di etichettatura DNA alternativa con sensibilit....

Protocol

NOTA: EMSAs utilizzando sonde di DNA fluorescente o altre forme di DNA marcato condividono gli stessi protocolli per la preparazione di proteine o estratto cellulare, la proteina-DNA reazione di legame, e la preparazione del gel PAGE e in esecuzione (Figura 1A). Le principali differenze sono procedure DNA di etichettatura, fasi di lavorazione gel post-visione e metodi di rilevamento.

1. Gel di Preparazione

1. Preparare 5% gel di poliacrilammide nativo contenente 0,5x TBE (45 mM Tris-borato, 1 mM EDTA) e il 2,5% glicerolo, utilizzando un mini sistema di gel di proteine ​​(8,3 cm di larghezza x 7.3 cm di spessore di lunghezza x 0,75 mm)....

Results

Arancio G loading dye (6x: 0,12 g arancione G in 100 ml 30% glicerolo) possono essere aggiunti alla reazione di legame prima del caricamento per visualizzare il progresso della elettroforesi. Altri coloranti di carico tra cui blu bromofenolo saranno rilevati durante la scansione e quindi interferire con l'analisi delle immagini (Figura 1B).

In alcuni casi di EMSAs, soprattutto se si utilizza la preparazione es.......

Discussion

fEMSAs sono uno strumento efficace per studiare le interazioni proteina-DNA, e sono una alternativa alla marcatura radioattiva del DNA. Coloranti fluorescenti come coloranti infrarossi sono disponibili in commercio, e forniscono un metodo più sicuro e più ecologico rispetto all'etichettatura DNA radioattivo. EMSAs utilizzando fluorescenti infrarossi oligonucleotidi dye-marcato non richiedono fasi di lavorazione gel postrun, e quindi risparmiare tempo e costi rispetto ad altre tecniche di marcatura del DNA. Il tempo .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Soluzione di acrilammide/bis al 30%, 37,5:1	Bio-Rad	1610158	l'acrilammide è dannosa e tossica.
6x-HIS Epitope Tag Antibody (HIS. H8)	ThermoFisher	MA1-21315
Anti-Flag M2 anticorpo	Sigma-Aldrich	F3165-.2MG
Albumina sierica bovina (BSA) grado di biologia molecolare	New England Biolabs	B9000S
5'IRDye700-labeled DNA Oligos	Integrated DNA Technologies	Custom DNA oligo	Questi sono indicati come "5'Dye-labeled o infrarossi fluorescente colorante marcato DNA oligos" nel manoscritto. L'azienda sintetizzerà su misura 5' oligonucleotidi di DNA marcati con IRDye. Richiede almeno 100  μ Sintesi in scala M e purificazione HPLC.
Frammento di Klenow (3'-->5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
LightShif Poly (dI-dC)	ThermoFisher	20148E
Mini-PROTEAN  Cella di elettroforesi verticale	Bio-Rad	1658000FC	Nel manoscritto ci si riferisce a questo come a un "mini sistema di gel proteico". Qualsiasi sistema elettroforetico può essere utilizzato purché si tratti di lastre di vetro trasparente di dimensioni inferiori a 25 cm x 25 cm.
Sistema di imaging a infrarossi Odyssey CLx	LI-COR Biotecnologia	Sistema di imaging a infrarossi Odyssey CLx	Nel manoscritto viene definito "sistema avanzato di imaging a infrarossi".
Sistema di imaging Odyssey Fc	LI-COR Biotechnology	Odyssey Fc	Nel manoscritto viene definito "sistema di imaging fluorescente nel vicino infrarosso principalmente per Western blot".
Software Image Studio (versione 4.0)	LI-COR Biotecnologia	Software Image Studio	Questo è indicato come un 'particolare software di imaging' nel manoscritto.
Arancio G	Sigma-Aldrich	O3756-25G
6x Colorante			0,25% Arancio G; 30% Glicerolo
0,5x TBE			45 mM Tris-Borato; 1 mM EDTA
1x TE			10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA
1x STE			100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA
5x Tampone			legante50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM di NaCl; 200 mM KCl; 5 mM di MgCl2; 5 mM EDTA, pH 8,0; 5 mM DTT; 250 μ g/mL BSA