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Articolo metodologico

Anticancro Efficacia della terapia fotodinamica con cancro del polmone con targeting nanoparticelle

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DOI:

10.3791/54865

⸱

1 dicembre 2016

 ,  , 
1Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Seoul National University Bundang Hospital, 2College of Pharmacy, Kangwon National University, 3Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Seoul National University College of Medicine

In questo articolo

Sommario

La terapia fotodinamica (PDT) è una scelta alternativa per il trattamento del cancro al polmone. Per aumentare l'effetto terapeutico della PDT, sono state sviluppate nanoparticelle mirate al cancro del polmone combinate con la chemioterapia. Sono state valutate l'efficacia antitumorale della PDT sia in vitro che in vivo con nanoparticelle preparate.

Abstract

La terapia fotodinamica (PDT) è un metodo non invasivo e non chirurgico che rappresenta un'interessante scelta alternativa per il trattamento del cancro del polmone. I fotosensibilizzatori si accumulano selettivamente nel tessuto tumorale e portano alla morte delle cellule tumorali in presenza di ossigeno e della corretta lunghezza d'onda della luce.

Per aumentare l'effetto terapeutico della PDT, abbiamo sviluppato nanoparticelle mirate al cancro del polmone caricate con fotosensibilizzatore e antitumorale. Sono stati applicati sia il targeting passivo basato sull'effetto di permeabilità e ritenzione (EPR) potenziato che il targeting attivo basato sull'interazione acido ialuronico-CD44. Il CD44 è un noto recettore dell'acido ialuronico che viene spesso introdotto come biomarcatore del carcinoma polmonare non a piccole cellule.

Inoltre, nel presente studio viene adottata una combinazione di PDT e chemioterapia. Questo concetto di combinazione può aumentare gli effetti terapeutici antitumorali e ridurre le reazioni avverse.

Abbiamo scelto l'ipocrellina B (HB) come nuovo fotosensibilizzante in questo studio. È stato riportato che l'HB provoca una maggiore efficacia antitumorale della PDT rispetto ai derivati dell'ematoporfirina1. Il paclitaxel è stato selezionato come farmaco antitumorale poiché ha dimostrato di essere un potenziale trattamento per il cancro del polmone2.

Le efficacia antitumorali della soluzione fotosensibilizzante (HB), delle nanoparticelle di acido ialuronico-ceramide incapsulate con fotosensibilizzatore (HB-NP) e delle nanoparticelle di acido ialuronico-ceramide incapsulate con fotosensibilizzatore e agente antitumorale (paclitaxel) (HB-P-NP) dopo PDT sono state confrontate sia in vitro che in vivo. Sono state valutate la fototossicità in vitro nelle cellule A549 (adenocarcinoma polmonare umano) e l'efficacia antitumorale in vivo nei topi portatori di tumore A549.

Il gruppo di trattamento HB-P-NP ha mostrato l'effetto antitumorale più efficace dopo la PDT. In conclusione, le HB-P-NP preparate nel presente studio rappresentano un potenziale e nuovo sistema di rilascio di fotosensibilizzatori nel trattamento del carcinoma polmonare con PDT.

Introduzione

La terapia fotodinamica (PDT) è composta da tre fattori principali: fotosensibilizzatori, luce e ossigeno. La PDT è segnalata come un trattamento promettente per vari tipi di cancro3. Quando i fotosensibilizzatori vengono somministrati al paziente oncologico, si accumulano selettivamente nei tessuti tumorali. Quando viene applicata la corretta lunghezza d'onda della luce, l'ossigeno singoletto altamente reattivo e altri radicali liberi portano al danno delle cellule tumorali4.

Il cancro ai polmoni è stato introdotto come una delle prime applicazioni per la PDT nei primi anni '805. La PDT offre diversi vantaggi nel trattamento del cancro del polmone. Poiché la PDT è un trattamento non invasivo e non chirurgico, è una scelta alternativa interessante per i pazienti in cui la resezione chirurgica è inappropriata.

Ci sono state molte sfide per migliorare l'efficacia dei fotosensibilizzatori nel campo del cancro. L'aumento dell'accumulo di fotosensibilizzanti nei siti tumorali e la diminuzione dell'accumulo nei tessuti normali sono gli obiettivi identici per gli studi mirati al cancro. Una varietà di sistemi di somministrazione di farmaci mirati, come polimeri, liposomi e nanoparticelle sono adottati come vettori fotosensibilizzanti6-8. Nei nostri studi precedenti, le nanoparticelle hanno aumentato efficacemente le capacità di targeting del cancro dei fotosensibilizzatori9,10. Le nanoparticelle sono vettori ideali per il cancro poiché possiedono capacità di targeting sia passive che attive. I vasi tumorali che perdono offrono ai portatori di dimensioni nanometriche l'opportunità di accumularsi facilmente nei tumori, che è ben noto come effetto di permeabilità e ritenzione (EPR) potenziato11,12. L'interazione tra le nanoparticelle e i recettori specifici sulle cellule tumorali consente il targeting attivo del cancro. In questo studio, abbiamo preparato nanoparticelle a base di acido ialuronico per interagire con CD44, il principale recettore dell'acido ialuronico che è sovraespresso sulle cellule tumorali del polmone13.

Per massimizzare l'efficacia antitumorale, nel presente studio viene adottata una combinazione di PDT e chemioterapia. Questo concetto di combinazione può consentire un aumento dell'effetto terapeutico. Inoltre, dosi ridotte sia del fotosensibilizzante che del farmaco antitumorale possono ridurre gli effetti avversi. Abbiamo selezionato l'ipocrellina B (HB) come nuovo fotosensibilizzante nel presente studio. L'HB è isolato dal fungo medicinale cinese Hypocrella bambuase. Shang et al. hanno riportato che la PDT basata su HB possiede una maggiore efficacia antitumorale rispetto alla PDT1 basata su derivati dell'ematoporfirina. Il paclitaxel è stato selezionato come farmaco antitumorale poiché ha dimostrato di essere un potenziale trattamento per vari tipi di cancro, tra cui il cancro ai polmoni2.

Qui, abbiamo confrontato l'efficacia antitumorale della soluzione fotosensibilizzante (ipocrellina B, HB), delle nanoparticelle di acido ialuronico-ceramide incapsulate con fotosensibilizzatore (HB-NP) e delle nanoparticelle di acido ialuronico-ceramide incapsulate con fotosensibilizzatore e agente antitumorale (paclitaxel) (HB-P-NP) dopo PDT. Sono state valutate la fototossicità in vitro nelle cellule A549 (adenocarcinoma polmonare umano) e l'efficacia antitumorale in vivo nei topi portatori di tumore A549.

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Protocollo

NOTA: Tutti i protocolli di studio sugli animali sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali di Seoul National University Hospital Bundang (BA1308-134 / 072-01).

1. Sintesi di acido ialuronico-Ceramide (HACE)

  1. Solubilizzare 12.21 mmoli di acido ialuronico (HA) oligomero e 9.77 mmoli di tetra- idrossido n -butylammonium (TBA) in 60 ml di acqua bidistillata (DDW). Agitare per 30 min.
  2. Per sintetizzare il linker DS-Y30 sciogliere 8.59 mmoli di DS-Y30 ceramide e 9.45 mmoli di trietilammina in 25 ml di tetraidrofurano (THF). Mescolare con 8.59 mmol di cloruro di 4-chloromethylbenzoyl in THF. Mescolare per 6 ore a 60 ° C.
  3. Sciogliere il sintetizzato 8.10 mmoli di HA-TBA e 0,41 mmoli di DS-Y30 linker in una miscela di THF e acetonitrile (4: 1, v / v). Mescolare per 5 ore a 40 ° C.
  4. Rimuovere impurità filtrando con un agente di filtro, ed eliminare il solvente organico mediante evaporazione sotto vuoto. Purificare il prodotto utilizzando una membrana di dialisi (peso molecolare cut-off: 3,5 kDa) e liofilizzato.

2. Preparazione delle nanoparticelle

  1. Sciogliere 1 mg di HB e 1 mg di paclitaxel in 0,5 ml di dimetilsolfossido (DMSO) e miscelare con 0,5 ml di DDW da vortex-miscelazione per 5 min. Poi, solubilizzazione HACE nella mischia dal vortice di miscelazione per un ulteriore 5 min.
  2. Per eliminare il solvente, il calore a 70 ° C per 4 ore sotto leggera corrente di azoto.
  3. Risospendere il film composto da HACE, HB, e paclitaxel con 1 ml di DDW. Filtrare con un filtro a siringa (0,45 micron dimensione dei pori) per rimuovere farmaci incapsulati.

3. In Vitro Fototossicità

  1. L'assorbimento di nanoparticelle in linee cellulari di cancro al polmone
    1. Preparare RPMI-1640 (v / v) di siero fetale bovino medio contenente 10% e 1% (w / v) di penicillina-streptomicina.
    2. Cellule Seed A549 in piastre di coltura cellulare di 24 pozzetti ad una densità di 1 × 10 5 cellule / pozzetto (triplicato per ognigruppo). Incubare per 24 ore a 37 ° C in un umidificata 5% aria atmosfera di CO 2 e il 95%.
    3. Dopo l'adesione cellulare, rimuovere il terreno e lavare le cellule aggiungendo 1 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
    4. Sciogliere le nanoparticelle in PBS ad una concentrazione finale di 2 micron / ml HB. Poi, incubare le cellule con 1 ml di PBS, NP vuoti, HB-NP, o HB-P-NP in ciascun pozzetto per 4 ore al buio.
    5. Rimuovere tutta la soluzione e lavare le cellule aggiungendo 1 ml di PBS freddo. Ripetere la fase di lavaggio, ancora una volta. Aggiungere mezzo di coltura fresco.
  2. saggio vitalità cellulare
    1. Posizionare la piastra di coltura cellulare sotto la fibra PDT (con 1 cm di distanza dalla fibra PDT al pozzo). Indossare occhiali di protezione laser e illuminare le cellule con un laser PDT (630 nm, 400 mW / cm 2) al buio per diversi periodi di tempo: 0, 5, 10, 20, 30, e 40 sec (0, 2, 4 , 8, 12, e 16 J / cm 2). Poi, incubare le cellule per 24 ore al buio.
    2. Aspirare il medio e lavare le cellule con l'aggiunta di 1 ml di PBS freddo. Ripetere la fase di lavaggio, ancora una volta.
    3. Aggiungere 10 ml di soluzione di misura citotossicità in ciascun pozzetto. Incubare al buio per 2 ore.
    4. Misurare l'assorbanza a 450 nm usando un lettore di micropiastre.
  3. analisi microscopica
    1. Posizionare la piastra di coltura cellulare sotto la fibra PDT (con 1 cm di distanza dalla fibra PDT al pozzo). Indossare occhiali di protezione laser e illuminare le cellule con un laser PDT (630 nm, 400 mW / cm 2) al buio per 0, 20, o 40 sec (0, 8, o 16 J / cm 2). Poi, incubare le cellule per 24 ore al buio.
    2. Aspirare il medio e lavare le cellule con l'aggiunta di 1 ml di PBS freddo. Ripetere la fase di lavaggio, ancora una volta.
    3. Aggiungere 50 ml di annessina V-FITC e 50 ml di 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, 1,5 mg / ml). Agitare delicatamente la piastra e incubare per 15 min a temperatura ambiente al buio.
      NOTA: Utilizzare annessina V-FITC dal kit microscopio a fluorescenza.
    4. Lavare le cellule con l'aggiunta di 1 ml di PBS freddo. Ripetere la fase di lavaggio, ancora una volta. Mantenere le cellule in PBS fresco. Identificare le cellule apoptotiche mediante microscopia ottica a ingrandimento 100X.
  4. ordinamento fluorescenza delle cellule attivate (FACS) Analisi
    1. Posizionare la piastra di coltura cellulare sotto la fibra PDT (con 1 cm di distanza dalla fibra PDT al pozzo). Indossare occhiali di protezione laser e illuminare le cellule con un laser PDT (630 nm, 400 mW / cm 2) per 0, 20, o 40 sec (0, 8, o 16 J / cm 2). Poi, incubare le cellule per 24 ore al buio.
    2. Aspirare il medio e lavare le cellule con l'aggiunta di 1 ml di PBS freddo. Ripetere la fase di lavaggio, ancora una volta.
    3. Risospendere le cellule in 1 ml di 1 × tampone di legame (diluire 1 parte di tampone legante 10x; 0,1 M Hepes / NaOH (pH 7,4), 1,4 M NaCl, e 25 mM CaCl 2 a 9 parti di acqua distillata) e trasferimento 100 microlitri della soluzione campione 5 mltubo di cultura.
    4. Aggiungere 5 ml di annessina V-FITC e 5 ml di ioduro di propidio (PI). Agitare delicatamente la provetta e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente (RT) al buio. Aggiungere 400 ml di 1 × tampone vincolante.
      NOTA: Utilizzare annessina V-FITC e PI dal kit microscopio a fluorescenza.
    5. Identificare le cellule apoptotiche utilizzando FACS 14. Le linee laser di eccitazione di PI e annessina V-FITC sono 488 nm e 635 nm, rispettivamente. Misurare l'emissione di fluorescenza di PI e annessina V-FITC a 610 ± 20 nm e 660 ± 20 nm, rispettivamente. Raccogliere le cellule acquisite sul citometro di flusso per 10.000 eventi.

4. In vivo l'efficacia antitumorale nei topi portatori di tumore

  1. Lung modello murino di cancro indotto
    1. Preparare 1 × 10 6 cellule A549 in 0,1 ml di mezzo RPMI-1640; tenerlo in ghiaccio.
    2. Anestetizzare i topi con una iniezione ip di xilazina e una miscela di tiletamina e zolazepam (1: 2, 1 ml /kg). Verificare il corretto anestesia pizzicando delicatamente una piccola piega della pelle del mouse. Utilizzare veterinario pomata per gli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
      NOTA: Se si osserva alcun movimento, l'animale è sufficientemente anestetizzati per avviare gli esperimenti.
    3. Iniettare le cellule per via sottocutanea nei fianchi sinistra del BALB / C maschile topi nudi (6 - 7 settimane di vita, 20 - 22 g).
    4. Mantenere osservando il mouse fino a quando iniziano a muoversi intorno alla gabbia.
      NOTA: Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino a quando non ha pienamente recuperato. Mantenere i topi in condizioni specifiche esenti da organismi patogeni (SPF).
    5. Misurare la dimensione del tumore con pinze ogni giorno. Calcolare il volume del tumore (mm 3) come (lunghezza x larghezza 2) / 2. Quando la dimensione del tumore raggiunge circa 200 mm 3 di volume, iniziare l'esperimento.
  2. studio di efficacia antitumorale
    1. Casualmente dividere i topi in 4 gruppi (n = 10 per ciascun gruppo).
    2. Anestetizzare i topi con una iniezione ip di xilazina e una miscela di tiletamina e zolazepam (1: 2, 1 ml / kg). Verificare il corretto anestesia pizzicando delicatamente una piccola piega della pelle del mouse. Utilizzare veterinario pomata per gli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
      NOTA: Se si osserva alcun movimento, l'animale è sufficientemente anestetizzati per avviare gli esperimenti.
    3. Sciogliere le nanoparticelle in PBS ad una concentrazione finale di 2 mg / ml HB. Iniettare PBS, libero HB, HB-NP, o HB-P-NP attraverso la vena della coda (2 mg / kg come HB) due volte nei giorni 0 e 7.
    4. Mantenere osservando il mouse fino a quando iniziano a muoversi intorno alla gabbia.
      NOTA: Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino al completorecuperato. Mantenere le gabbie buio e in condizioni SPF specifiche.
    5. 24 ore dopo ciascuna iniezione, anestetizzare i topi con una iniezione ip di xilazina e una miscela di tiletamina e zolazepam (1: 2, 1 ml / kg). Verificare il corretto anestesia pizzicando delicatamente una piccola piega della pelle del mouse. Utilizzare veterinario pomata per gli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
      NOTA: Se si osserva alcun movimento, l'animale è sufficientemente anestetizzati per avviare gli esperimenti.
    6. Posizionare il sito del tumore sotto della fibra PDT (di 1 cm di distanza dalla fibra PDT al tumore). Indossare occhiali di sicurezza laser, spegnere l'interruttore, e illuminare il tumore con un laser PDT (630 nm, 400 mW / cm 2) per 500 sec (200 J / cm 2) due volte nei giorni 1 e 8.
    7. Mantenere osservando il mouse fino a quando iniziano a muoversi intorno alla gabbia. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Non restituire un animale che ha oggetto d'importanti lavorie un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino alla completa guarigione.
    8. Mantenere le gabbie in condizioni SPF. Mantenere le gabbie al buio per 24 ore dopo il trattamento laser.
    9. Visivamente controllare il volume del tumore ed i cambiamenti al sito del tumore ogni giorno. Misurare la dimensione del tumore con pinze, e calcolare il volume (lunghezza x larghezza 2) / 2 (mm 3). Scattare foto dei siti tumorali ogni giorno per verificare la presenza di alterazioni della superficie del tumore dopo PDT.
    10. Il giorno 16, sacrificare cinque topi per gruppo da anestesia terminali che utilizzano isoflurano.
    11. Con pinze e forbici, tagliare la pelle esterna ed esporre i tumori 15. li raccolto con cura. Fissarli in formalina al 10%, incorporarli in paraffina, e li macchiare con ematossilina e eosina (H & E) per l'analisi istologica 16.
    12. Dopo 45 giorni di monitoraggio, sacrificare i topi rimanenti anestesia terminali che utilizzano isoflurano.

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Risultati

Abbiamo preparato sia HB-NP e HB-P-NP con le tecniche di cui sopra. I diametri medi di HB-NP e HB-P-NP erano 220,9 ± 3,2 nm e 211.9 ± 1.6 nm, rispettivamente.

La vitalità cellulare delle cellule A549 dopo 4 ore di incubazione con PBS, NP vuoti, HB-NP e HB-P-NP seguito da irradiazione di luce (0 a 16 J / cm 2) è mostrato in Figura 1. Senza luce, la gruppo di trattamento HB-NP non ha mostrato citotoss...

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Discussione

La fase più critica in questo studio sta selezionando le condizioni appropriate laser: lunghezza d'onda, il potere, e il tempo di irradiazione. La corretta lunghezza d'onda della luce adatta per il fotosensibilizzatore specifico è necessario per la PDT. Abbiamo utilizzato un laser a 630 nm, che era appropriato per hypocrellin B. La potenza di uscita è stato un altro fattore importante, che è stato fissato a 400 mW / cm 2 sulla base di molti studi pilota. Potenze di uscita superiore a 400 mW / cm ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo studio è stato sostenuto dalla concessione n. 14-2014-017 dal Fondo di ricerca SNUBH.

Gli autori sono in debito con J. Patrick Barron, professore emerito, Tokyo Medical University e Professore, Seoul National University Hospital Bundang per il suo pro bono la modifica di questo manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
acido ialuronico oligoBioland Co., Ltd._
DS-Y30 (ceramide 3B; principalmente N-oleoil-fitosfingosina)Doosan Biotech Co., Ltd._
acido adipico diidrazideSigma AldrichA0638
N-(3-dimetilamminopropil)-N′ -etilcarbodiimmideSigma Aldrich39391
4-(clorometil)benzoile cloruroSigma Aldrich270784
Tween 80Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.T0546
filtro per siringaSartorius Stedim Biotech GmbH1776215 mm, RC, PP, 0,45 µ m
trietilamminaSigma AldrichT0886
Mini-GeBAflex tubiGene Bio-Application Ltd.D070-12-100
PaclitaxelTaihua Corporations_
RPMI-1640Gibco Life Technologies, Inc.11875
Penicillina– streptomicinaGibco Life Technologies, Inc.15070
Siero fetale bovinoGibco Life Technologies, Inc.
Celite (Filtrante)Sigma Aldrich6858Vedere il passaggio 1.4
16140071

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