L'ossido nitrico (NO) è un'importante molecola di segnalazione nell'omeostasi vascolare. La produzione di NO in vivo è troppo bassa per la misurazione diretta. La chemiluminescenza fornisce informazioni utili sul ciclo dell'NO attraverso la misurazione dei suoi precursori e prodotti di ossidazione, nitriti e nitrati. Viene spiegata la determinazione di nitriti/nitrati nei tessuti e nei fluidi corporei.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Misurazione nitriti e nitrati, metaboliti in ossido nitrico Pathway, nei materiali biologici utilizzando il metodo chemiluminescenza
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'ossido nitrico (NO) è una delle principali molecole regolatore dell'omeostasi vascolare e anche un neurotrasmettitore. Enzimatica prodotta NO viene ossidato in nitriti e nitrati dalle interazioni con diverse proteine ossi-eme e altri percorsi ancora poco conosciuti. Il processo inverso, la riduzione dei nitriti e nitrati in NO era stato scoperto nei mammiferi negli ultimi dieci anni ed è guadagnando attenzione come uno dei possibili percorsi per sia prevenire o alleviare una vasta gamma di malattie cardiovascolari, malattie metaboliche e muscolari che si pensa essere associato con diminuzione dei livelli di NO. È quindi importante valutare la quantità di NO e suoi metaboliti in differenti compartimenti corporei - sangue, fluidi corporei e vari tessuti. Sangue, grazie alla sua facile accessibilità, è il vano preferito utilizzato per la stima dei metaboliti. A causa della sua breve vita (pochi millisecondi) e bassa concentrazione di sub-nanomolari, misurazioni affidabili dirette di sangue NO <em> in vivo presentano grandi difficoltà tecniche. Così NO disponibilità è solitamente stimato in base alla quantità dei suoi prodotti di ossidazione, nitriti e nitrati. Questi due metaboliti vengono sempre misurati separatamente. Ci sono diversi metodi ben stabiliti per determinare le loro concentrazioni nei fluidi e nei tessuti biologici. Qui vi presentiamo un protocollo per il metodo chemiluminescenza (CL), in base alla rilevazione spettrofotometrica di NO dopo nitriti o nitrati riduzione di (III) soluzioni di cloruro rispettivamente tri-ioduro o vanadio,. La sensibilità per nitriti e nitrati rilevamento è in gamma bassa nanomolari, che stabilisce CL come il metodo più sensibile attualmente disponibile per determinare le variazioni di NO vie metaboliche. Vi spieghiamo in dettaglio come preparare campioni di fluidi e tessuti biologici al fine di preservare quantità originali di nitriti e nitrati presenti al momento della raccolta e su come determinare le loro rispettive quantità nei campioni. Limitazioni della tecnica CL sono anche explained.
Introduzione
Nitrito, e ad un nitrato meno estendere, i livelli nel sangue riflettono stato generale del corpo NO metabolismo. concentrazione dei nitriti nel sangue e la maggior parte degli organi e tessuti sono solo in alta nanomolari o gamma micromolare basso, il nitrato di solito è presente in quantità molto più elevate - nella gamma micromolare. I cambiamenti nei livelli di nitriti a causa di progressione della malattia o cambiamenti nelle abitudini alimentari sono piuttosto piccole e possono essere misurati solo con un metodo molto sensibile. A causa delle loro molto diversi livelli e diversi processi metabolici, la determinazione separata dei livelli di nitriti e nitrati è ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutti i protocolli, tra cui l'uso di animali sono stati approvati per l'uso da NIDDK cura degli animali e del Comitato uso e sangue umano è stato ottenuto da banca del sangue NIH da donatori sani.
Preparazione 1. Esempio
- Preparazione della soluzione di nitrito di conservazione
- Preparare una soluzione contenente 890 mM ferrocianuro di potassio (K 3 Fe (CN) 6) e 118 mM NEM (N-etilmaleimide) in acqua distillata. Sciogliere bene fino a quando è chiaro di colore giallo, senza cristalli presenti. Aggiungere NP-40 (ottil phenoxylpolyethoxylethanol) in un rapporto 1: 9 (v / v, NP-....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
La figura 2 mostra i risultati rappresentativi raccolti da standard e cinque campioni diversi. Come mostrato in questa figura, tensione aumenta fotomoltiplicatore immediatamente dopo nitrito contenenti soluzione (standard o campioni) viene iniettato riducendo soluzione (iniezioni volte sono indicati da frecce rosse sotto la curva) e ritorna al valore basale volta tutte nitriti presenti nella iniettato soluzione è stata ridotta. È anche chiaro da questa figura che sono ne.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
I passaggi critici all'interno del protocollo
Aliquote di tutte le soluzioni (tra cui l'acqua) usate per preparare, diluire o altrimenti trattare campioni originali devono essere salvati e controllati per possibili nitriti o (più spesso) contaminazione da nitrati. Abbiamo trovato che la maggior contaminazione proviene da acqua e molti prodotti chimici usati per il trattamento di campioni (ferricianuro in particolare) contengono anche significativa quantità di contaminazione da nitrati i.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Dr. Alan Schechter è elencato come co-inventore diversi brevetti rilasciati il National Institutes of Health per l'uso di sali nitriti per il trattamento delle malattie cardiovascolari. Egli riceve royalties basate su NIH concessione di licenze di questi brevetti per lo sviluppo clinico, ma nessun altro compenso.
Ringraziamenti
Gli autori vogliono riconoscere i contributi critici di Dr A. Dejam e MM Pelletier a sviluppare l'uso di soluzione di nitrito di preservare per le misure di nitriti nel sangue.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| ferricianuro di potassio; K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| NEM; N-etilmaleimmide | Sigma | 4260 | |
| NP-40; 4-Nonilfenil-polietilenglicole | Sigma | 74385 | |
| sulfanilamide; AS | Sigma | S9251 | |
| HCl | Sigma | H1758 | |
| acido acetico, glaciale | Sigma | A9967 | |
| acido ascorbico | Sigma | A7506 | |
| ioduro di potassio; KI | Sigma | 60399 | |
| iodio; I2 | Sigma | 207772 | tossico e sensibile alla luce |
| ; NaNO2 | Sigma | 563218 | |
| cloruro di vanadio(III); VCl3 | Sigma | 208272 | sensibile alla luce, tossico |
| GentleMac | Miltenyi | ||
| Sievers NOA 280i | GE | ||
| CLD 88Y | Ecofisica |
Riferimenti
- Piknova, B., Schechter, A. N. Measurement of Nitrite in Blood Samples Using the Ferricyanide-Based Hemoglobin Oxidation Assay. Methods Mol Biol. 704, 39-56 (2011).
- Nagababu, E., Rifkind, J. M. Measure....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
