Articolo metodologico

L'analisi dei Simian Immunodeficiency Virus specifici CD8 + T-cellule in Rhesus macachi di peptide-MHC-I Tetramero colorazione

DOI:

10.3791/54881

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23 dicembre 2016

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1Department of Pathology, University of Miami

In questo articolo

Sommario

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Qui, vi presentiamo un protocollo ottimizzato per l'enumerazione e la caratterizzazione di cellule macaco rhesus T CD8 + contro il virus dell'AIDS. Questo articolo è utile non solo al campo della immunologia HIV, ma anche ad altri settori della ricerca biomedica cui sono note le risposte delle cellule T CD8 + influenzare l'esito della malattia.

Abstract

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Istocompatibilità di classe complesso Peptide-major I (pMHC-I) tetrameri sono state uno strumento prezioso per studiare le risposte delle cellule T CD8 +. Poiché questi reagenti si legano direttamente ai recettori delle cellule T sulla superficie delle cellule CD8 + linfociti T, tetrameri fluorocromi marcato pMHC-I consentono il rilevamento accurato di antigene (Ag) + SPECIFICI CD8 T-cellule senza la necessità di re in vitro -stimolazione. Inoltre, se combinato con multicolore citometria a flusso, pMHC-I tetramero colorazione può rivelare aspetti chiave di Ag-specifici CD8 + T-cellule, tra cui fase di differenziazione, la memoria fenotipo, e lo stato di attivazione. Questi tipi di analisi sono stati particolarmente utile nel campo della immunologia HIV dove CD8 + T-cellule possono influenzare la progressione in AIDS. infezione sperimentale di macachi rhesus con virus dell'immunodeficienza delle scimmie (SIV) fornisce uno strumento prezioso per studiare l'immunità cellulare contro il virus dell'AIDS. Come risultato, notevole progress è stato fatto nel definire e caratterizzare le risposte delle cellule T in questo modello animale. Qui vi presentiamo un protocollo ottimizzato per l'enumerazione SIV-specifica CD8 + T-cellule in macachi Rhesus di pMHC-I tetramero colorazione. Il nostro test permette la simultanea quantificazione e la memoria fenotipizzazione di due popolazioni CD8 + pMHC-I tetramero + T-cellule per test, che potrebbe essere utile per il monitoraggio SIV-specifiche risposte delle cellule T CD8 + generati dalla vaccinazione o infezione SIV. Considerando la rilevanza di primati non umani nella ricerca biomedica, questa metodologia è applicabile per studiare le risposte delle cellule T CD8 + in più impostazioni di malattia.

Introduzione

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CD8 + T-cellule comprendono una componente fondamentale del sistema immunitario adattativo, come partecipano tumore sorveglianza immunitaria e contribuire alla eradicazione di patogeni intracellulari 1. In termini semplici, CD8 + T-cellule esprimono i recettori delle cellule T (TCR), che riconoscono specificamente di istocompatibilità di classe complessi peptide-major I (pMHC-I) molecole presenti sulla membrana plasmatica delle cellule ospiti. Poiché questi peptidi sono derivati ​​dalla proteolisi di proteine ​​sintetizzate endogeno, pMHC-I superficie cellulare complessi forniscono una finestra nell'ambiente intracellulare. Al mom....

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Protocollo

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I campioni periferico cellule mononucleate del sangue (PBMC) utilizzati in questo manoscritto sono stati ottenuti da macachi Rhesus indiani alloggiati presso la Wisconsin Nazionale Primate Research Center. Questi animali sono stati curati secondo la relazione Weatherall sotto un protocollo approvato dalla University of Wisconsin Graduate School cura degli animali e del Comitato Usa 33. Tutte le procedure sugli animali sono stati eseguiti in anestesia e tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo il potenziale sofferenza.

1. Il trattamento PKI

NOTA: Questo è opzionale, ma consigliato per Mamu-B * 017: 01 tetrameri. Vedi i R....

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Risultati

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Il protocollo qui descritto è stato utilizzato per determinare l'ampiezza e la memoria fenotipo di vaccino-indotta, Gag CM9-specifiche risposte delle cellule T CD8 + in un Mamu-A1 * 001 + macaco rhesus. Per questa analisi, un APC-coniugato tetramero Mamu-A1 * 001 / Gag CM9 è stato utilizzato in un pannello colorazione citometria a flusso a 8 colori. Figura 1A - F mostra la strategia di gating utilizzato per analizzare i dati, che dovr.......

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Discussione

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A pochi passi in questa discussione di merito procedura in quanto sono cruciali per cedere risultati ottimali. Innanzitutto, poiché la qualità dei campioni biologici è un forte predittore del successo di qualsiasi citometria a flusso 38, tutto occorre prestare attenzione a garantire che le cellule sono vitali e in sospensione durante la procedura di colorazione. Questo è particolarmente importante quando si lavora con campioni crioconservati poiché sono più inclini a formazione di grumi e contengono tipicamen.......

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Vorremmo ringraziare David Watkins per supportare gli esperimenti che hanno permesso l'ottimizzazione del presente metodologia. La ricerca riportato nella presente pubblicazione è stato sostenuto in parte da una sovvenzione pilota fornito dal Miami Center for AIDS Research del National Institutes of Health con il numero premio P30AI073961. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DasatinibAxon medchemAxon  1392Deve essere risospeso in DMSO e immediatamente memorizzato a -20 ° C
RPMI con Glutamaxgibco/ Life Technologies61870-036Deve essere conservato a 4 gradi; C 
Gibco FBS inattivato a caldo/ Life Technologies10082-147Deve essere conservato a 4 gradi C 
Penicillina-Streptomicina-Amfotericina BLonza17-745EDeve essere conservato a 4 gradi C 
DMSO, AnhydrousLife TechnologiesD12345Conservare a temperatura ambiente.
polipropilene a fondo tondo da 5 mlVWR60819-728
Tetrameri pMHC-I coniugati con fluorocromoNIH Tetramer Core o MBL, Inc.Deve essere conservato e mantenuto a 4 °C. Centrifugare a 20.000 x g per 15 minuti prima dell'uso. Non congelare.
Corpi monoclonali coniugati con fluorocromoVarie aziendeDevono essere conservati e mantenuti a 4 °C. Non congelare.
VIVO/MORTO  Acqua riparabile Morto  Kit per la colorazione delle celleLife Technologiesl34957Deve essere conservato a -20 °C. Risospendere ciascuna aliquota in 50 μ l di DMSO prima dell'uso.
Brilliant Stain BufferBD Biosciences563794Deve essere conservato a 4 gradi C 
Soluzione salina tamponata con fosfatoVWR97064-158Conservare a temperatura ambiente
Albumina bovinaVWR700011-230Deve essere conservato a 4 gradi C 
Sodio azideVWR97064-646Conservare a temperatura ambiente. Sostanza tossica. Non mescolare con candeggina.
CandegginaVWR89501-620Prodotto chimico corrosivo, non può essere miscelato con sodio azide. Maneggiare con cura
ParaformaldeideMicroscopia elettronica Sciences15714-SReagente infiammabile, corrosivo e tossico. Maneggiare con cura
Polisorbato 20 (Tween-20)Alfa AesarL15029Conservare a temperatura ambiente
Soluzione di permeabilizzazione 2 BD Biosciences340973Reagente tossico e corrosivo. Maneggiare con cura
le provette Sarsdet 1,5 ml tappo a viteVWR72.692.005
2,0 ml DNA/RNA Provette a basso legameEppendorf22431048L'uso di microprovette sterili è preferibile 
Miscelatore a vorticeA discrezione dello scienziato
Armadio di biosicurezza A discrezione dello scienziato
Milli Q Intergral Sistema di purificazione dell'acquaEMD MilliporeZRXQ010WWBiologia molecolare grado acqua da qualsiasi fornitore può essere utilizzato
MicrocentrifugaA discrezione dello scienziato
Centrifuga A discrezione dello scienziato
4 ... C  frigoriferoA discrezione dello scienziato
BD LSR IIBD Biosciencesdeve contenere laser e filtri compatibili con il pannello di colorazione utilizzato.
per acqua
VWR SCIENTIFIC INC.89068-738
L'incubatricedeve essere in grado di mantenere 37 ° C  temperatura interna
software FACS DivaBD Biosciences
Flowjo software versione 9.6FlowjoUtilizzato per analizzare i file FCS generati dal software FACS Diva
Punte
Provette in , il citometro a flussoFoglio di alluminio deionizzata Micropippette

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Parham, P. Antigen Recognition by T Lymphocytes. The Immune System, 3rd ed. Foltin, J., Masson, S., Ghezzi, K., Engels, A., Lawrence, E., Jeffcock, E. , Garland Science, Taylor & Francis Group, LLC. New York, NY. 125-154 (2009).
  2. Doherty, P. C. The tetramer transformation. J Immunol. 187 (1), 5-6 (2011).
  3. Masopust, D., Vezys, V., Wherry, E. J., Ahmed, R.

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Cellule T CD8 specifiche per SIVAnalisi tramite citometria a flussoModello di macaco rhesusRilevazione di cellule T antigene specificheFenotipizzazione della memoriaColorazione intracellulareIsolamento di PBMCTitolazione dei tetrameriLegame con MHC di classe I

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