Qui, vi presentiamo un protocollo ottimizzato per l'enumerazione e la caratterizzazione di cellule macaco rhesus T CD8 + contro il virus dell'AIDS. Questo articolo è utile non solo al campo della immunologia HIV, ma anche ad altri settori della ricerca biomedica cui sono note le risposte delle cellule T CD8 + influenzare l'esito della malattia.
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Articolo metodologico
L'analisi dei Simian Immunodeficiency Virus specifici CD8 + T-cellule in Rhesus macachi di peptide-MHC-I Tetramero colorazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Istocompatibilità di classe complesso Peptide-major I (pMHC-I) tetrameri sono state uno strumento prezioso per studiare le risposte delle cellule T CD8 +. Poiché questi reagenti si legano direttamente ai recettori delle cellule T sulla superficie delle cellule CD8 + linfociti T, tetrameri fluorocromi marcato pMHC-I consentono il rilevamento accurato di antigene (Ag) + SPECIFICI CD8 T-cellule senza la necessità di re in vitro -stimolazione. Inoltre, se combinato con multicolore citometria a flusso, pMHC-I tetramero colorazione può rivelare aspetti chiave di Ag-specifici CD8 + T-cellule, tra cui fase di differenziazione, la memoria fenotipo, e lo stato di attivazione. Questi tipi di analisi sono stati particolarmente utile nel campo della immunologia HIV dove CD8 + T-cellule possono influenzare la progressione in AIDS. infezione sperimentale di macachi rhesus con virus dell'immunodeficienza delle scimmie (SIV) fornisce uno strumento prezioso per studiare l'immunità cellulare contro il virus dell'AIDS. Come risultato, notevole progress è stato fatto nel definire e caratterizzare le risposte delle cellule T in questo modello animale. Qui vi presentiamo un protocollo ottimizzato per l'enumerazione SIV-specifica CD8 + T-cellule in macachi Rhesus di pMHC-I tetramero colorazione. Il nostro test permette la simultanea quantificazione e la memoria fenotipizzazione di due popolazioni CD8 + pMHC-I tetramero + T-cellule per test, che potrebbe essere utile per il monitoraggio SIV-specifiche risposte delle cellule T CD8 + generati dalla vaccinazione o infezione SIV. Considerando la rilevanza di primati non umani nella ricerca biomedica, questa metodologia è applicabile per studiare le risposte delle cellule T CD8 + in più impostazioni di malattia.
Introduzione
CD8 + T-cellule comprendono una componente fondamentale del sistema immunitario adattativo, come partecipano tumore sorveglianza immunitaria e contribuire alla eradicazione di patogeni intracellulari 1. In termini semplici, CD8 + T-cellule esprimono i recettori delle cellule T (TCR), che riconoscono specificamente di istocompatibilità di classe complessi peptide-major I (pMHC-I) molecole presenti sulla membrana plasmatica delle cellule ospiti. Poiché questi peptidi sono derivati dalla proteolisi di proteine sintetizzate endogeno, pMHC-I superficie cellulare complessi forniscono una finestra nell'ambiente intracellulare. Al mom....
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Protocollo
I campioni periferico cellule mononucleate del sangue (PBMC) utilizzati in questo manoscritto sono stati ottenuti da macachi Rhesus indiani alloggiati presso la Wisconsin Nazionale Primate Research Center. Questi animali sono stati curati secondo la relazione Weatherall sotto un protocollo approvato dalla University of Wisconsin Graduate School cura degli animali e del Comitato Usa 33. Tutte le procedure sugli animali sono stati eseguiti in anestesia e tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo il potenziale sofferenza.
1. Il trattamento PKI
NOTA: Questo è opzionale, ma consigliato per Mamu-B * 017: 01 tetrameri. Vedi i R....
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Risultati
Il protocollo qui descritto è stato utilizzato per determinare l'ampiezza e la memoria fenotipo di vaccino-indotta, Gag CM9-specifiche risposte delle cellule T CD8 + in un Mamu-A1 * 001 + macaco rhesus. Per questa analisi, un APC-coniugato tetramero Mamu-A1 * 001 / Gag CM9 è stato utilizzato in un pannello colorazione citometria a flusso a 8 colori. Figura 1A - F mostra la strategia di gating utilizzato per analizzare i dati, che dovr.......
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Discussione
A pochi passi in questa discussione di merito procedura in quanto sono cruciali per cedere risultati ottimali. Innanzitutto, poiché la qualità dei campioni biologici è un forte predittore del successo di qualsiasi citometria a flusso 38, tutto occorre prestare attenzione a garantire che le cellule sono vitali e in sospensione durante la procedura di colorazione. Questo è particolarmente importante quando si lavora con campioni crioconservati poiché sono più inclini a formazione di grumi e contengono tipicamen.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare David Watkins per supportare gli esperimenti che hanno permesso l'ottimizzazione del presente metodologia. La ricerca riportato nella presente pubblicazione è stato sostenuto in parte da una sovvenzione pilota fornito dal Miami Center for AIDS Research del National Institutes of Health con il numero premio P30AI073961. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Dasatinib | Axon medchem | Axon 1392 | Deve essere risospeso in DMSO e immediatamente memorizzato a -20 ° C |
| RPMI con Glutamax | gibco/ Life Technologies | 61870-036 | Deve essere conservato a 4 gradi; C |
| Gibco FBS inattivato a caldo | / Life Technologies | 10082-147 | Deve essere conservato a 4 gradi C |
| Penicillina-Streptomicina-Amfotericina B | Lonza | 17-745E | Deve essere conservato a 4 gradi C |
| DMSO, Anhydrous | Life Technologies | D12345 | Conservare a temperatura ambiente. |
| polipropilene a fondo tondo da 5 ml | VWR | 60819-728 | |
| Tetrameri pMHC-I coniugati con fluorocromo | NIH Tetramer Core o MBL, Inc. | Deve essere conservato e mantenuto a 4 °C. Centrifugare a 20.000 x g per 15 minuti prima dell'uso. Non congelare. | |
| Corpi monoclonali coniugati con fluorocromo | Varie aziende | Devono essere conservati e mantenuti a 4 °C. Non congelare. | |
| VIVO/MORTO Acqua riparabile Morto Kit per la colorazione delle celle | Life Technologies | l34957 | Deve essere conservato a -20 °C. Risospendere ciascuna aliquota in 50 μ l di DMSO prima dell'uso. |
| Brilliant Stain Buffer | BD Biosciences | 563794 | Deve essere conservato a 4 gradi C |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | VWR | 97064-158 | Conservare a temperatura ambiente |
| Albumina bovina | VWR | 700011-230 | Deve essere conservato a 4 gradi C |
| Sodio azide | VWR | 97064-646 | Conservare a temperatura ambiente. Sostanza tossica. Non mescolare con candeggina. |
| Candeggina | VWR | 89501-620 | Prodotto chimico corrosivo, non può essere miscelato con sodio azide. Maneggiare con cura |
| Paraformaldeide | Microscopia elettronica Sciences | 15714-S | Reagente infiammabile, corrosivo e tossico. Maneggiare con cura |
| Polisorbato 20 (Tween-20) | Alfa Aesar | L15029 | Conservare a temperatura ambiente |
| Soluzione di permeabilizzazione 2 | BD Biosciences | 340973 | Reagente tossico e corrosivo. Maneggiare con cura |
| le provette Sarsdet 1,5 ml tappo a vite | VWR | 72.692.005 | |
| 2,0 ml DNA/RNA Provette a basso legame | Eppendorf | 22431048 | L'uso di microprovette sterili è preferibile |
| Miscelatore a vortice | A discrezione dello scienziato | ||
| Armadio di biosicurezza | A discrezione dello scienziato | ||
| Milli Q Intergral Sistema di purificazione dell'acqua | EMD Millipore | ZRXQ010WW | Biologia molecolare grado acqua da qualsiasi fornitore può essere utilizzato |
| Microcentrifuga | A discrezione dello scienziato | ||
| Centrifuga A discrezione dello scienziato | |||
| 4 ... C frigorifero | A discrezione dello scienziato | ||
| BD LSR II | BD Biosciences | deve contenere laser e filtri compatibili con il pannello di colorazione utilizzato. | |
| per acqua | |||
| VWR SCIENTIFIC INC. | 89068-738 | ||
| L'incubatrice | deve essere in grado di mantenere 37 ° C temperatura interna | ||
| software FACS Diva | BD Biosciences | ||
| Flowjo software versione 9.6 | Flowjo | Utilizzato per analizzare i file FCS generati dal software FACS Diva | |
| Punte |
Riferimenti
- Parham, P. Antigen Recognition by T Lymphocytes. The Immune System, 3rd ed. Foltin, J., Masson, S., Ghezzi, K., Engels, A., Lawrence, E., Jeffcock, E. , Garland Science, Taylor & Francis Group, LLC. New York, NY. 125-154 (2009).
- Doherty, P. C. The tetramer transformation. J Immunol. 187 (1), 5-6 (2011).
- Masopust, D., Vezys, V., Wherry, E. J., Ahmed, R.
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Ristampe e permessi
