La combinazione di Wet and Dry tecniche di laboratorio per guidare la cristallizzazione di grandi dimensioni avvolto a spirale contenenti proteine

Summary

Descriviamo un framework che incorpora un'analisi biochimica e computazionale diretta per guidare la caratterizzazione e la cristallizzazione di grandi domini coiled-coil. Questo framework può essere adattato per le proteine globulari o esteso per incorporare una varietà di tecniche ad alto rendimento.

Abstract

Ottenere cristalli per la determinazione della struttura può essere una proposta difficile e dispendiosa in termini di tempo per qualsiasi proteina. Le proteine e i domini a spirale si trovano in tutta la natura, tuttavia, a causa delle loro proprietà fisiche e della tendenza ad aggregarsi, sono tradizionalmente considerati particolarmente difficili da cristallizzare. Qui, utilizziamo una varietà di tecniche rapide e semplici progettate per identificare una serie di possibili confini di dominio per una data proteina a spirale, e quindi caratterizzare rapidamente il comportamento di queste proteine in soluzione. Con l'aggiunta di un tag fortemente fluorescente (mRuby2), la caratterizzazione delle proteine è semplice e diretta. La proteina bersaglio può essere facilmente visualizzata in condizioni di illuminazione normale e può essere quantificata con l'uso di un imager appropriato. L'obiettivo è identificare rapidamente i candidati che possono essere rimossi dalla pipeline di cristallizzazione perché è improbabile che abbiano successo, concedendo più tempo ai migliori candidati e meno fondi spesi per le proteine che non producono cristalli. Questo processo può essere iterato per incorporare le informazioni ottenute dagli sforzi iniziali di screening, può essere adattato per procedure di espressione e purificazione ad alto rendimento ed è potenziato dallo screening robotico per la cristallizzazione.

Introduction

determinazione della struttura mediante cristallografia a raggi X ha dato un contributo fondamentale a tutti i campi della biologia moderna; fornendo una vista atomico delle macromolecole che sostengono la vita e come interagiscono tra loro in una varietà di contesti; che ci permette di comprendere i meccanismi che causano la malattia e che offrono opportunità di progettare razionalmente farmaci per il trattamento della malattia. Cristallografia è stata a lungo la tecnica sperimentale dominante per determinare la struttura macromolecolare, che rappresentano attualmente il 89,3% della base di dati strutturale (www.rcsb.org). Questa tecnica ha molti vantaggi, compreso il potenziale molto alta risoluzione, la capacità di visualizzare macromolecole con una vasta gamma di dimensioni, di relativamente facile raccolta dei dati, e la possibilità di visualizzare come macromolecola interagisce con solventi e leganti.

Nonostante i numerosi miglioramenti tecnologici nel espressione della proteina ricombinante ^1,2, purification ^3, e della biologia molecolare utilizzato per generare questi sistemi ^4, il vero grande ostacolo nel processo cristallografica rimane la capacità di crescere cristalli di qualità diffrazione. Questo è stato particolarmente vero per le proteine ​​che contengono domini di grandi dimensioni avvolto a spirale. E 'stato stimato che ben il 5% di tutti gli aminoacidi si trovano all'interno di bobine a spirale ^5,6, rendendo questa una caratteristica strutturale molto comune ^7, eppure queste proteine sono spesso più difficili da purificare e cristallizzare di proteine globulari ^8-10 . Questo è ulteriormente aggravato dal fatto che i domini coiled-coil trovano spesso nel contesto di una proteina più grande, quindi prevedere correttamente i confini di questi domini è fondamentale per evitare l'inclusione di sequenza non strutturata o flessibile che spesso è dannosa per la cristallizzazione.

Qui vi presentiamo un quadro concettuale che unisce web-based computazionale analisi con Experimental dati dalla panchina, per aiutare gli utenti di guida attraverso le fasi iniziali del processo cristallografica, tra cui: Come selezionare frammento di proteina (s) per studi strutturali, e come preparare e caratterizzare campioni di proteine ​​prima di tentativi di cristallizzazione. Ci concentriamo la nostra analisi su due proteine ​​contenenti domini di grandi dimensioni avvolto a spirale, Shroom (SHRM) e Rho-chinasi (Rock). Queste proteine sono stati scelti come entrambi contengono domini coiled-coil e sono noti per formare un complesso biologicamente rilevante ^11-16. Shroom e Rho-chinasi (Rock) sono previsti per contenere rispettivamente ~ 200 e 680 residui di avvolto a spirale, molte parti della quale sono state caratterizzate strutturalmente ^17-20. Il metodo qui descritto fornisce un flusso di lavoro per identificare rapidamente frammenti di coiled-coil contenenti proteine ​​che saranno suscettibili per la cristallizzazione, tuttavia, le tecniche descritte possono essere facilmente adattati per la maggior parte della proteina o proteina complessi o modificati per incorporare high-throughput avvicinamenches come disponibili. Infine, questi metodi sono generalmente poco costosi e possono essere eseguite dagli utenti a quasi tutti i livelli di esperienza.

Protocol

NOTA: Un diagramma del quadro concettuale o workflow è descritta nella figura 1 per riferimento. Il protocollo può essere suddiviso in quattro fasi: previsioni basate computazionali o di sequenza, di espressione proteica e purificazione, caratterizzazione biochimica e cristallizzazione. Gli esempi mostrati analizzano domini Shroom SD2 e / o complessi Shroom-rock, ma possono essere utilizzati con qualsiasi proteina.

1. Utilizzare Fondata strumenti basati sul Web per generare previsioni computazionali di dominio confini avvolto a spirale

1. Raccogliere un Set evolutivo vario di sequenza omologhi.
   1. Vai a www.uniprot.org e digitare Shroom nella barra di ricerca in alto.
   2. Selezionare le sequenze di scaricare selezionando la casella accanto al loro numero di registrazione. Sequenze con una stella indicano sequenze recensiti da UniProt e sono generalmente più affidabili. Fare attenzione a garantire che tutte le sequenze sono complete e accurate.
   3. Salvare le s selezionatiequences facendo clic sul pulsante Download.
   4. Allineare la raccolta di sequenze Shroom usando Clustal-Omega ²¹ (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Fare clic sul pulsante "Sfoglia" per selezionare il file con le sequenze Shroom e poi premere Invia.
   5. Dopo l'allineamento è completo, fare clic sul pulsante "Scarica Allineamento file".
   6. Aprire la allineamento di sequenze multiple generate in 1.1.5 usando jalview (File | ingresso di allineamento | Da file). All'interno della nuova finestra di allineamento, il colore per identità (colore | Percentuale di identità).
2. Calcolare le previsioni di struttura secondaria, previsioni di sequenza flessibile o disordinato, e previsto regioni avvolto a spirale all'interno della proteina (s) di interesse.
   1. Vai a http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, per calcolare le previsioni avvolto a spirale. Copiare e incollare la sequenza nella casella Sequence e fare clic su Invia.
      NOTA: Questa analisi può richiedere un paio d'ore di compLete. Dal momento che le sequenze Shroom sono abbastanza grandi, possono avere bisogno di essere diviso in blocchi di meno di 1.000 aminoacidi per rientrare nel vincolo dimensioni del server web le sequenze. Nell'analizzare Shrm2, si raccomanda che gli acidi C-terminale 1,000 aminoacidi sono usati come questa sezione contiene il dominio SHRM SD2 che è noto per contenere regioni coiled-coil. Ripetendo questa analisi con altre proteine, si raccomanda di utilizzare le sequenze di proteine ​​integrali quando possibile. Se questo non è un'opzione, utilizzare il più grande frammento possibile o sezionare la sequenza in base ai dati biochimici e funzionali noti.
   2. Vai a http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, per calcolare le previsioni avvolto a spirale. Copiare e incollare la sequenza nella casella Sequence e fare clic su Invia.
3. Combinare i risultati delle fasi 1.1 a 1.2.2 in un'unica annotazione completa della sequenza Shroom.
   NOTA: E 'altamente incoraggiati a includere anche qualsiasi e tutti i rilevantinformazioni che si può ricavare dalla letteratura o da altre fonti circa la funzione delle proteine ​​o di purificazione in questa fase.
4. Utilizzando questa sequenza annotata completa, prevedere dominio confini (o una serie di possibili confini) per la proteina, cercando di massimizzare conservazione e predetto caratteristiche strutturali minimizzando la quantità di successione disordinata o flessibile. Se noto, la proteina risultante dovrebbe mantenere le proprietà funzionali di interesse.

2. espresso e purificare proteine ​​con i confini del dominio indicata nella sezione 1

NOTA: L'obiettivo di questa sezione è quello di utilizzare una serie di test rapidi e facilmente quantificabili per lo screening confini del dominio ipotetici generati nella sezione 1.

1. Usando tecniche standard di biologia molecolare, generare un plasmide di espressione con la sequenza codificante desiderata nel frame all'interno della sua ₁₀ -mRuby2-XH2 plasmide (vedere Figura 3 per la mappa vettoriale unND ulteriori dettagli).
2. I livelli di espressione di test per ogni plasmide di espressione usando BL21 (DE3) E. coli o di altro idoneo ceppo di espressione nei mezzi di autoinduzione ¹ a temperatura ambiente per 18-24 ore.
   1. Trasforma plasmidi di espressione, nonché un controllo plasmide vuoto in BL21 (DE3) seguendo le istruzioni fornite con le cellule o utilizzando robusto protocollo di trasformazione, come quella qui (https://www.addgene.org/plasmid-protocols/bacterial -trasformazione/).
   2. Dal piatto appena trasformato, scegliere una singola colonia e far crescere una cultura di avviamento 5 ml a 37 ° C durante la notte in lisogenia Broth (LB) media con 34 ug / ml kanamicina.
   3. Il giorno seguente, pellet la cultura e lavare il pellet con LB. fresco
   4. Aggiungere la coltura starter a 50 ml di mezzi di autoinduzione con 34 ug / ml kanamicina. Lasciare che la cultura di crescere alla saturazione sia a temperatura ambiente o 37 ° C. Tipicamente, crescere per ~ 18-24 ore.
   5. cell pellets e congelare i pellet cellulari risultanti a -80 ° C indefinitamente prima purificazione.
   6. Confronto estratti di cellule intere da ogni ceppo espressione e il controllo vettore vuoto mediante SDS-PAGE per determinare il ceppo che produce più efficiente della proteina di fusione desiderata. Per il suo ₁₀ proteine di fusione -mRuby2-Shroom SD2, eseguire 10% gel SDS-PAGE a 180 V per ~ 50 minuti o fino a quando il fronte del colorante raggiunge il fondo del gel ^22.
   7. Gel Stain con Coomassie Blu per visualizzare le proteine cellulari totali all'interno di ogni ceppo ^23.
3. Eseguire una fase iniziale cromatografia di affinità su ogni ceppo che ha espresso con successo proteina mRuby2-fusion. Tipicamente, eseguire i passaggi di purificazione 2.3.2-2.3.7 a temperatura ambiente, a meno che la proteina beneficerà mutate condizioni quali la depurazione a 4 ° C.
   1. pellet cellulari Scongelare dal punto 2.2.5.
   2. Risospendere ogni pellet di cellule in 1,5 ml di tampone di lisi (10% glicerolo, 500 mM NaCl, 40mM imidazolo, 20 mM Tris pH8.0, 1 mM beta-mercaptoetanolo). Integrare il tampone di lisi con inibitori della proteasi a seconda dei casi.
   3. Aggiungere 30 ml di 10 mg / ml di lisozima e incubare a temperatura ambiente per 20 min. Sonicare seguendo le istruzioni per lo strumento in uso.
   4. Trasferire in una provetta da 1,5 ml e centrifugare in una tabella centrifuga per 30 minuti a 14.000 xg per pellet materiale insolubile o cellule non lisate. Salvare sia il surnatante e pellet per la successiva analisi mediante SDS-PAGE.
   5. Eseguire la purificazione di nichel affinità, incubando la frazione solubile con 100 ml di perline Ni-NTA. Incubare le perline con lisato solubile per 5-10 minuti, invertendo più volte per mescolare perline.
   6. Centrifugare a 800 xg per 30 secondi in una centrifuga da tavolo per sedimentare le perline. Seguire questa lavando il pellet 3-5 volte con tampone di lisi per pulire contaminanti non specifici.
   7. Elute Rubino proteina di fusione dalle perline con tampone di lisi integrata con 1M imidazolo.
   8. Utilizzare SDS-PAGE per confrontare il comportamento dei Suoi-mRuby2-Shroom proteine ​​nella purificazione "veloce e sporco" di cui sopra.

3. Caratterizzare proteine ​​di esempio per identificare quelli con proprietà vantaggiose

1. Utilizzare un set spettrofotometro a 280 nm per misurare la concentrazione della proteina di fusione rubino, e quindi valutare l'omogeneità del campione caricando 1-5 mg di proteina di fusione su un gel nativo PAGE ^24. Eseguire il gel PAGE nativa 10% a 4 ° C per 140 min a 175 V.
   1. La pagina in immagine nativo utilizzando un imager dotato di visualizzare la fluorescenza, osservando dove la fusione mRuby-tag migra in questo saggio.
      NOTA: Fare attenzione a rispettare proteina di fusione che è bloccato nel pozzo come questa proteina è probabile aggregato. Se un imager a fluorescenza non è disponibile, si può spesso visualizzare e campioni di immagini concentrato di Rubino tagged proteine ​​sotto una luce nera o con una scatola di luce UV.
2. Eseguire proteolisi limitata per identificare domini stabilmente piegato. Incubare 95 ml di Ruby-SHRM SD2 fusione a ~ 1 mg / ml con 5 ml di 0,025% Subtilisina A.
   1. Campione la reazione in momenti di 0, 0,5, 2, 5, 15, 60, e 120 min, rimuovendo 10 microlitri dalla reazione per ciascun punto di tempo e visualizzando l'andamento della reazione tramite SDS-PAGE su gel di acrilammide 15% .
   2. Macchia con Coomassie blu come al punto 2.2.7 e valutare se una specie resistenti della proteasi possono essere identificati.
3. Integrare dati da l'efficienza di purificazione, il comportamento in PAGE nativo, e proteolisi limitata sulle parzialmente purificate proteine ​​di fusione mRuby2-Shroom in una valutazione globale del comportamento complessivo di queste proteine ​​in soluzione.
   1. (Facoltativo) Se un test funzionale adatto è disponibile, verificare la presenza di attività a questo punto.

4. Produrre cristalli di alta qualità del coiled-coil SD2Dominio da Shroom

NOTA: tutte le iniziative in paragrafo 4.1 vengono eseguite a temperatura ambiente a meno che la proteina potrebbe beneficiare di purificazione ad una temperatura diversa, di solito 4 ° C.

1. Utilizzando i 50 ml crescite come una stima approssimativa di espressione e di potenziale di purificazione, eseguire le espressioni su larga scala di mRuby2-Shroom SD2 con l'obiettivo di raggiungere 5-20 mg di campione completamente purificato. Tipicamente 2 L della cultura fornisce un adeguato materiale di partenza. Dopo che le cellule di crescita pellet per centrifugazione a 8.000 xg per 10 min.
   1. Risospendere il pellet dalla crescita 2 L in tampone di lisi come prima, utilizzando ~ 2 ml di lisi per grammo di pellet congelato se si utilizza il lisozima per lisi. In alternativa, risospendere in ~ 8 ml / g di pellet se si utilizza un omogeneizzatore o di stampa francese. Pellet detriti cellulari mediante centrifugazione a 30.000 xg per 30 min.
   2. Batch impegna la frazione solubile da 4.1.1 utilizzando 10 ml di resina Ni-NTA. Versare in colonna gravità del casoe permettono proteine ​​non legate a sgocciolare.
   3. Lavare resina 3-5 volte con 40 ml di tampone di lisi, seguita da un lavaggio con tampone di lisi integrato a 1 M NaCl.
   4. resina lavata con 40 ml di tampone di lisi supplementato con 80 mM imidazolo.
   5. Eluire la proteina di fusione Ruby-Shroom con 40 ml di tampone di lisi integrate per 1 M imidazolo. frazionare manualmente la proteina eluita in 4-10 ml frazioni.
   6. Confermare frazioni contenenti Ruby-Shroom proteina di fusione con il 10% SDS-PAGE.
   7. Dializzare frazioni appropriate (in genere frazioni 2-4) in 8% glicerolo, 250 mM NaCl, 15 mM imidazolo, 20 mM Tris pH8.0, 1 mm β-ME, utilizzando 6-8 kDa MWCO tubi di dialisi. Aggiungere 1 mg di TEV proteasi per ogni 25-50 mg di proteina di fusione. Dializzare notte a temperatura ambiente con lenta agitazione.
   8. Ripetere la purificazione nichel affinità passi 4.1.2. a 4.1.6. Il dominio Shroom SD2 dovrebbe ora rimanere nella frazione non legata mentre il suo ₁₀ -mRuby2 rimarrà legato ala resina e si trovano nelle frazioni di eluizione. Confermare con il 12% di colorazione SDS-PAGE con Coomassie blu.
   9. Dializzare frazioni contenenti dominio Shroom SD2 in 8% glicerolo, 100 mM NaCl, 20 mM Tris pH 8,0, 5 mM tampone beta-mercaptoetanolo durante la notte.
   10. Eseguire anionico cromatografia a scambio ²⁵ tramite un FPLC, ed eluendo con un gradiente di NaCl dal 0.1-1.0 M NaCl. Analizzare le frazioni con il 12% SDS-PAGE.
   11. Utilizzando un concentratore di spin (MWCO di 10 kDa o maggiore a seconda della proteina studiata), concentrato frazioni di picco a ~ 0 mg / ml, e quindi eseguire cromatografia ad esclusione sterica ^26, analizzando frazioni di picco con il 12% SDS-PAGE.
   12. Pool frazioni di picco e Dializzare in 20 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 2% glicerolo, 1 mM β-ME, e si concentrano a 10 mg / ml prima cristallizzazione.
       Opzionale: Durante questa fase, rimuovere 5 campioni microlitri a concentrazioni di 1, 2, 5 e 10 mg / ml nel corso della concentrazione del campione.Eseguire un nativo di caricamento delle pagine 2-5 ml di ogni campione a guardare il comportamento del campione durante questa fase.
2. Schermo una piccola serie di 12 condizioni per identificare una concentrazione proteica ottimale per prove di cristallizzazione. La composizione di queste condizioni è descritto nella Figura 7.
   1. Utilizzando 24-well seduta vassoi cristallizzazione goccia, eseguire prove di cristallizzazione utilizzando il metodo di diffusione del vapore, pipettaggio 500 ml di ciascuna delle 12 condizioni in pozzetti separati seguiti da gocce che inizialmente contenenti 1 ml di soluzione ben e 1 ml di campione proteico sui vetrini . Vedere ²⁷ per ulteriori informazioni su questa tecnica.
   2. Chiudere immediatamente il vassoio con nastro adesivo trasparente e spostare il vassoio per un ambiente a temperatura controllata adatto che è privo di vibrazioni. La temperatura utilizzata può variare, ma 4 ° C, 16 ° C e 20 ° C sono abbastanza comuni.
   3. Esaminare le gocce nei vassoi per il prossimo 3 dAYS utilizzando un microscopio fino a ingrandimento 100X. Alla fine del periodo di 3 giorni, segnare ogni goccia come contenete senza precipitazione (chiaro), precipitazione luce, precipitazioni pesanti (marrone), o cristalli. Una concentrazione proteica adatto dovrebbe contenere non più di 6 precipitazioni pesanti.
   4. Utilizzando la concentrazione proteina identificata in 4.2, programmare una vasta gamma di schermi cristallizzazione disponibili in commercio. L'uso di una manipolazione o cristallizzazione robot liquido accelera notevolmente questo processo riducendo al minimo errore nelle gocce. Esso richiede molto meno proteine ​​pure, permettendo all'utente di schermo più condizioni con un singolo campione.
   5. Migliorare le condizioni iniziali individuati dagli schermi ampi variando sistematicamente ciascuna delle variabili all'interno della goccia di cristallizzazione con 24 pozzetti vassoi di screening come prima.

Results

Un diagramma raffigurante il workflow utilizzato in questo sistema è mostrato in figura 1 e comprende tre fasi principali. analisi computazionale della sequenza è utilizzato per sviluppare ipotesi circa i confini dominio della proteina coiled-coil di interesse. Un esempio di analisi annotata del dominio Shrm2 SD2 è mostrato in Figura 2. In questo schema, l'obiettivo era quello di individuare possibili confini del dominio per un dominio conservato presso ...

Discussion

Il protocollo qui descritto è stato progettato per aiutare l'utente a identificare i confini del dominio all'interno di grandi proteine ​​avvolto a spirale per facilitare la loro cristallizzazione. Il protocollo si basa su una incorporazione olistica di una varietà di dati da predizioni computazionali ed altre fonti per generare una serie di potenziali dominio confini. Seguono una serie di esperimenti biochimici che sono veloce e poco costoso, e che sono utilizzati per raffinare ulteriormente queste ipotesi iniz...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BL21(DE3) Rosetta	Emd Millipore	70954-3
BL21(DE3) Star	ThermoFisher Scientific	C601003
BL21(DE3) Codon Plus	Agilent Technologies	230245
Spettro del lisozima	Chemical Mfg Corp	L3008-5GM
Ni-NTA resina	Life Technologies	25216
SubtilisinA	Spectrum Chemical Mfg Corp	S1211-10ML
24 pozzetti Cryschem Plate	Hampton research	HR3-160
INTELLI-PLATE   96:	Art Robbins Instruments	102-0001-03
PEG 3350	Hampton research	HR2-591
PEG 8000	Hampton research	HR2-515
PEG 400	Hampton research	HR2-603
PEG 4000	Hampton research	HR2-605
pcDNA3.1-Clover-mRuby2	Addgene	49089
Sistema di autoinduzione espresso notturno 1	Emd Millipore	71300
Brodo di lisogenesi in polvere	ThermoFisher Scientific	12795027