Descriviamo un framework che incorpora un'analisi biochimica e computazionale diretta per guidare la caratterizzazione e la cristallizzazione di grandi domini coiled-coil. Questo framework può essere adattato per le proteine globulari o esteso per incorporare una varietà di tecniche ad alto rendimento.
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Articolo metodologico
La combinazione di Wet and Dry tecniche di laboratorio per guidare la cristallizzazione di grandi dimensioni avvolto a spirale contenenti proteine
In questo articolo
Sommario
Abstract
Ottenere cristalli per la determinazione della struttura può essere una proposta difficile e dispendiosa in termini di tempo per qualsiasi proteina. Le proteine e i domini a spirale si trovano in tutta la natura, tuttavia, a causa delle loro proprietà fisiche e della tendenza ad aggregarsi, sono tradizionalmente considerati particolarmente difficili da cristallizzare. Qui, utilizziamo una varietà di tecniche rapide e semplici progettate per identificare una serie di possibili confini di dominio per una data proteina a spirale, e quindi caratterizzare rapidamente il comportamento di queste proteine in soluzione. Con l'aggiunta di un tag fortemente fluorescente (mRuby2), la caratterizzazione delle proteine è semplice e diretta. La proteina bersaglio può essere facilmente visualizzata in condizioni di illuminazione normale e può essere quantificata con l'uso di un imager appropriato. L'obiettivo è identificare rapidamente i candidati che possono essere rimossi dalla pipeline di cristallizzazione perché è improbabile che abbiano successo, concedendo più tempo ai migliori candidati e meno fondi spesi per le proteine che non producono cristalli. Questo processo può essere iterato per incorporare le informazioni ottenute dagli sforzi iniziali di screening, può essere adattato per procedure di espressione e purificazione ad alto rendimento ed è potenziato dallo screening robotico per la cristallizzazione.
Introduzione
determinazione della struttura mediante cristallografia a raggi X ha dato un contributo fondamentale a tutti i campi della biologia moderna; fornendo una vista atomico delle macromolecole che sostengono la vita e come interagiscono tra loro in una varietà di contesti; che ci permette di comprendere i meccanismi che causano la malattia e che offrono opportunità di progettare razionalmente farmaci per il trattamento della malattia. Cristallografia è stata a lungo la tecnica sperimentale dominante per determinare la struttura macromolecolare, che rappresentano attualmente il 89,3% della base di dati strutturale (www.rcsb.org). Questa tecnica ha molti vantaggi, compreso ....
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Protocollo
NOTA: Un diagramma del quadro concettuale o workflow è descritta nella figura 1 per riferimento. Il protocollo può essere suddiviso in quattro fasi: previsioni basate computazionali o di sequenza, di espressione proteica e purificazione, caratterizzazione biochimica e cristallizzazione. Gli esempi mostrati analizzano domini Shroom SD2 e / o complessi Shroom-rock, ma possono essere utilizzati con qualsiasi proteina.
1. Utilizzare Fondata strumenti basati sul Web per generare previsioni computazionali di dominio confini avvolto a spirale
- Raccogliere un Set evolutivo vario di sequenza omologhi.
- Vai a www.....
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Risultati
Un diagramma raffigurante il workflow utilizzato in questo sistema è mostrato in figura 1 e comprende tre fasi principali. analisi computazionale della sequenza è utilizzato per sviluppare ipotesi circa i confini dominio della proteina coiled-coil di interesse. Un esempio di analisi annotata del dominio Shrm2 SD2 è mostrato in Figura 2. In questo schema, l'obiettivo era quello di individuare possibili confini del dominio per un dominio conservato presso .......
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Discussione
Il protocollo qui descritto è stato progettato per aiutare l'utente a identificare i confini del dominio all'interno di grandi proteine avvolto a spirale per facilitare la loro cristallizzazione. Il protocollo si basa su una incorporazione olistica di una varietà di dati da predizioni computazionali ed altre fonti per generare una serie di potenziali dominio confini. Seguono una serie di esperimenti biochimici che sono veloce e poco costoso, e che sono utilizzati per raffinare ulteriormente queste ipotesi iniz.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione NIH R01 GM097204 (APV e JDH). Il finanziamento per JHM è stato fornito da una borsa di studio estiva per la ricerca universitaria HHMI.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| BL21(DE3) Rosetta | Emd Millipore | 70954-3 | |
| BL21(DE3) Star | ThermoFisher Scientific | C601003 | |
| BL21(DE3) Codon Plus | Agilent Technologies | 230245 | |
| Spettro del lisozima | Chemical Mfg Corp | L3008-5GM | |
| Ni-NTA resina | Life Technologies | 25216 | |
| SubtilisinA | Spectrum Chemical Mfg Corp | S1211-10ML | |
| 24 pozzetti Cryschem Plate | Hampton research | HR3-160 | |
| INTELLI-PLATE 96: | Art Robbins Instruments | 102-0001-03 | |
| PEG 3350 | Hampton research | HR2-591 | |
| PEG 8000 | Hampton research | HR2-515 | |
| PEG 400 | Hampton research | HR2-603 | |
| PEG 4000 | Hampton research | HR2-605 | |
| pcDNA3.1-Clover-mRuby2 | Addgene | 49089 | |
| Sistema di autoinduzione espresso notturno 1 | Emd Millipore | 71300 | |
| Brodo di lisogenesi in polvere | ThermoFisher Scientific | 12795027 |
Riferimenti
- Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).
- Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expressio....
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Ristampe e permessi
