Articolo metodologico

Manipolazione di epilettiforme Electrocorticograms (ECoGs) e sonno in ratti e topi con l'agopuntura

DOI:

10.3791/54896

⸱

22 dicembre 2016

 ,  ,  , 
1Department of Sports, Health & Leisure, College of Tourism, Leisure and Sports, Aletheia University, Tainan Campus, 2Department of Neurology, Mackay Memorial Hospital and Mackay Medical College, 3Department of Veterinary Medicine, School of Veterinary Medicine, National Taiwan University, 4Graduate Institute of Brain & Mind Sciences, College of Medicine, National Taiwan University, 5Graduate Institute of Acupuncture Science, College of Chinese Medicine, China Medical University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Questo articolo dimostra le prestazioni dell'agopuntura, dei modelli di epilessia e dell'analisi del sonno nei roditori. Vengono descritte la procedura di agopuntura e l'identificazione dei punti di agopuntura. La pilocarpina o pentilenetetrazolo (PTZ) è usata per indurre l'epilessia. Per l'analisi del sonno vengono utilizzati l'elettrocorticogramma (ECoG), l'elettromiogramma (EMG), la temperatura cerebrale e le registrazioni dell'attività locomotoria.

Abstract

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L'antica letteratura cinese ha documentato che l'agopuntura possiede efficaci effetti terapeutici sull'epilessia e sull'insonnia. Ci sono, tuttavia, poche ricerche per rivelare i possibili meccanismi alla base di questi effetti. Per studiare l'effetto dell'agopuntura sull'epilessia e sul sonno, è necessario affrontare diverse questioni. Il primo è identificare i punti di agopuntura, che corrispondono tra esseri umani, ratti e topi. Inoltre, è necessario determinare la profondità di inserimento dell'ago per agopuntura, il grado di torsione dell'ago nell'agopuntura manuale con ago e i parametri di stimolazione per l'elettroagopuntura (EA). Per valutare gli effetti dell'agopuntura sull'epilessia e sul sonno, è necessario un modello fattibile di epilessia nei roditori. Somministriamo pilocarpina nel nucleo centrale sinistro dell'amigdala (CeA) per simulare l'epilessia focale del lobo temporale (TLE) nei ratti. L'iniezione intraperitoneale (IP) di pilocarpina induce epilessia generalizzata e stato epilettico (SE) nei ratti. Cinque iniezioni IP di pentilenetetrazolo (PTZ) con un intervallo di un giorno tra ciascuna iniezione inducono con successo l'epilessia generalizzata spontanea nei topi. Le registrazioni di elettrocorticogrammi (ECoG), elettromiogrammi (EMG), temperatura cerebrale e attività locomotoria sono utilizzate per l'analisi del sonno nei ratti, mentre ECoG, EMG e attività locomotoria sono impiegate per l'analisi del sonno nei topi. Gli elettrodi ECoG vengono impiantati nelle cortecce occipitali frontale, parietale e controlaterale e un termistore viene impiantato sopra la corteccia cerebrale mediante chirurgia stereotassica. Gli elettrodi EMG vengono impiantati nei muscoli del collo e un rilevatore a infrarossi determina l'attività locomotoria. I criteri per classificare le fasi di vigilanza, tra cui la veglia, il sonno REM (Rapid Eye Movement) e il sonno non-REM (NREM) si basano su informazioni provenienti da ECoG, EMG, temperatura cerebrale e attività locomotoria. I criteri di classificazione dettagliati sono indicati nel testo.

Introduzione

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L'epilessia è un disturbo neurologico comune in cui ricorrenti crisi epilettiche si verificano durante tutto la durata della vita di un paziente. La maggior parte delle recidive epilettiche possono essere ben controllati da farmaci anti-epilettici (DAE). Tuttavia, circa il 30% dei pazienti epilettici sviluppare epilessia refrattaria 1. cause Epilessia disturbi del sonno, che può esacerbare ulteriormente recidiva. L'evidenza dimostra che l'epilessia può o disturbare il sonno di notte o può causare eccessiva sonnolenza diurna 2,3. I nostri studi precedenti indicano inoltre che l'epilessia che si verificano al momento zeitgeber (ZT) 0, vale a dire, l'inizio del periodo di luce nella luce: ciclo di buio, diminuisce il sonno; questo è mediata da ormone di liberazione della corticotropina (CRH), un fattore omeostatico. Epilessia ZT13 (all'inizio del periodo buio) aumenta l'espressione di un altro fattore omeostatico, interleuchina-1 (IL-1), che aumenta il sonno. Sonno ritmi circadiani sono alterati quando si verifica l'epilessia a ZT6, al centro dellaperiodo di luce 4,5. D'altra parte, problemi di sonno aggravano ulteriormente la progressione e la recidiva di epilessia 6. Sulla base delle prove di cui sopra, cerchiamo di rivelare un metodo terapeutico ottimale per controllare contemporaneamente l'epilessia e prevenire interruzioni del sonno nei pazienti con epilessia. Abbiamo precedentemente trovato che elettroagopuntura (EA) con una frequenza di stimolazione 10 Hz, in cui una certa quantità di corrente viene erogata nel acupoint attraverso un ago di acciaio inossidabile, sopprime successo electrocorticogram (ECoG) attività epilettiche e disturbi del sonno epilessia indotta 7 . EA con una frequenza di stimolazione di 100 Hz si deteriora ulteriormente le attività epilettiche e interruzioni del sonno nei ratti 8,9. Questo esperimento di successo dipende da tre fattori: in primo luogo, un modello animale di epilessia fattibile; in secondo luogo, un metodo per la registrazione sonno e analisi roditori; e in terzo luogo, le prestazioni accurata di agopuntura e la precisione del punto terapeutico locations.

L'epilessia è stato classificato in due tipi principali: l'epilessia focale e epilessia generalizzata. Siamo interessati a focale epilessia del lobo temporale (TLE), epilessia generalizzata, stato epilettico (SE), e il ripetersi di epilessia generalizzata spontanea. Pertanto, diverse manipolazioni sono applicati per creare modelli epilettici adatti per i nostri esperimenti. Per stabilire TLE focale, una bassa dose di pilocarpina viene somministrato nel nucleo centrale di sinistra dell'amigdala (CEA). Per verificare questo modello, sei elettrodi ECOG sono impiantati sul frontale (F1 e F2), parietale (P1 e P2), e occipitale (O1 e O2) lobi in entrambe gli emisferi destro e sinistro, e altri due elettrodi di riferimento (R1 & R2) sono disposti sopra il cervelletto in entrambi gli emisferi. Un ulteriore cannula guida microiniezione viene impiantato chirurgicamente nella sinistra CeA (AP, 2,8 mm dal bregma; ML, 4,2 mm; DV, 7.8 mm rispetto al bregma). Le coordinate sono adattati dal Paxinos e Watson ratto atlante 10. Se la focale TLE è indotta con successo, solo la registrazione dall'elettrodo sulla corteccia parietale sinistra (P1), che è vicino al CeA sinistra, dovrebbero acquisire le ECoGs epilettiformi dominanti, senza significativi ECoGs epilettiformi registrati dagli altri elettrodi ECOG. Intraperitoneale (IP) iniezioni di pilocarpina in ratti indurre generalizzata epilessia e SE, ma questo può essere fatale. Cinque iniezioni IP di pentylenetetrazol (PTZ) con un intervallo di un giorno tra ogni iniezione inducono successo epilessia generalizzata spontanea nei topi e anche garantire la sopravvivenza dei topi. Due elettrodi filo ECOG vengono impiantati nelle frontale e parietale nel topo per ricevere i segnali ECOG e per verificare l'epilessia spontaneamente ricorrenti.

La polisonnografia (PSG) è un metodo completo per registrare i cambiamenti fisiologici che si verificano durante il sonno, e può oggettivamente classificare il sonno in diverse fasi del movimento dei non-rapid eye (NREM) e Rmovimento degli occhi APID (REM) del sonno. PSG registra parametri delle funzioni del corpo, tra cui le onde cerebrali (elettroencefalogramma, EEG), i movimenti oculari (elettrooculogramma, EOG), toni muscolo scheletrico (elettromiografia, EMG), del ritmo cardiaco (elettrocardiogramma, ECG) e livelli di ossigeno nel sangue e parametri respiratori. Nei ratti, registriamo ECoGs, EMG, temperatura corticale, e l'attività locomotoria per classificare gli stati di vigilanza in veglia, sonno non-REM, e il sonno REM. analisi del sonno nei topi viene condotta utilizzando ECoGs, EMG, ed i risultati di attività locomotoria. I ratti sono impiantati chirurgicamente con tre vite ECoG elettrodi al frontale, parietale e corteccia cerebellare controlaterale per radiochirurgia stereotassica. determinazione post-acquisizione degli stati di vigilanza (veglia, sonno non-REM e il sonno REM) è condotta secondo i parametri acquisiti dai ECoGs, EMG, temperatura del cervello e l'attività locomotoria. I criteri dettagliati per classificare il comportamento dell'animale in entrambi i ratti e topi sono descritti in tegli protocollo.

Entrambi i ratti e topi devono essere anestetizzati con una bassa dose di Zoletil (25 mg / kg), che è la metà della dose di anestetici normalmente somministrati durante la chirurgia stereotassica, prima di eseguire l'agopuntura manuale o EA. Questo dosaggio permette animali di svegliarsi da 30 a 35 minuti dopo l'iniezione. Sia l'agopuntura manuale o EA viene eseguita all'inizio del periodo buio, con un periodo costante di tempo di 30 minuti, e ogni animale è consecutivamente trattati per due o tre giorni. Stimulating correnti EA vengono consegnati in un particolare punto terapeutico attraverso un ago di acciaio inossidabile che viene inserito nel punto terapeutico. La corrente di stimolo è un treno di impulsi quadrati bifasici, in cui la durata dell'impulso è di 150 ms e l'intensità di stimolazione è di 1 mA. Se un ago a secco è utilizzato per l'agopuntura manuale, l'ago inserito nei punti terapeutici si contrasse 10 volte ogni 5 minuti. La parte difficile di agopuntura manuale o EA è quello di localizzare i punti terapeutici nei roditori. il loczione di punti terapeutici in ratti o topi è simile alla loro localizzazione anatomica negli esseri umani. Ad esempio, gli agopunti bilaterali Fengchi si trovano 3 mm dalla linea mediana posteriore sul collo, tra le due orecchie, che è simile alla sua posizione anatomica nell'uomo 11. Inoltre, le agopunti con bassa impedenza sulla pelle possono essere ulteriormente confermato. Sham manipolazione agopuntura simulata o EA è necessario per agopuntura o esperimenti EA. Agopuntura sham o sham EA devono essere eseguiti in un non-punto terapeutico situato vicino al punto terapeutico, come ad esempio vicino al cavo ascellare 12.

Per indagare con successo gli effetti dell'agopuntura o EA su epilessia e interruzioni del sonno epilessia indotta, i seguenti fattori devono essere a posto: un modello fattibile epilettica animali, la precisa analisi di ECoGs epilettiformi e la ricorrenza di epilessia, un metodo per classificare gli stati di vigilanza , e le prestazioni accurata di agopuntura o EA nei roditori.

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Protocollo

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Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) del National Taiwan University.

1. radiochirurgia stereotassica per impiantare ECoG elettrodi, elettrodi EMG, Cervello termistore, e Guida Iniezione cannula

  1. Per ratti (250-350 g, da 6 a 8 settimane di età ratti Sprague-Dawley)
    1. Anestetizzare i topi mediante iniezione IP con 50 mg / kg Zoletil. Verificare la corretta profondità dell'anestesia osservando una mancanza di risposta dopo la presa della zampa posteriore. Applicare una pomata oculare, accorciare il pelo, e sterilizzare la pelle con una soluzione di iodio-povidone e il 75% di etanolo. Iniettare un antibiotico (penicillina G) per prevenire l'infezione.
    2. Preparare bisturi, forbici, pinze emostatiche, garze, e la macchina cauterizzazione per un intervento chirurgico. Sterilizzare attrezzi chirurgici e garze da una autoclave e la cauterizzazione del 75% di etanolo.
    3. Posizionare una barra orecchio nel condotto uditivo e montare il ratto al Stereotaxis.
    4. utilizzandoun bisturi, fare un approssimativo di 2 cm incisione mediana sul cranio lungo una linea tra due orecchie, spostando caudalmente. Agganciare i lembi cutanei con hemostats per esporre il cranio e rimuovere il tessuto sopra il cranio con un bisturi.
    5. Drill otto fori (F1, F2, P1, P2, O1, O2, R1 e R2), ciascuna circa 0,7 mm di diametro, sul cranio con un utensile rotante. Vite otto elettrodi ECOG sui frontali, parietali e lobi occipitali e il cervelletto in entrambe gli emisferi destro e sinistro. Questi elettrodi sono utilizzati per la rilevazione epilessia focale.
      1. Utilizzare le seguenti coordinate per gli elettrodi di registrazione: frontale (F1 e F2): 2,0 millimetri anteriore al bregma e 2,5 millimetri dalla linea mediana, parietale (P1 e P2): -2.0 mm anteriori al bregma e 3,0 millimetri dalla linea mediana e occipitale (O1 e O2): -5.5 mm anteriore al bregma e 3,0 millimetri dalla linea mediana.
      2. Inserire due elettrodi di riferimento (R1 e R2) sopra il cervelletto (-11.0 mm anteriore al bregma e 4,0 millimetri dalla midliNE).
    6. In gruppi separati di ratti, trapano tre buchi e luogo due elettrodi EEG vite sopra il frontale destro (F2) e lobi parietali (P2) delle cortecce con le stesse coordinate come descritto al punto 1.1.5.1. Inserire un terzo elettrodo EEG sopra il cervelletto sinistra (R1), che serve a terra l'animale e ridurre artefatti del segnale. Questi elettrodi sono utilizzati per confermare l'epilessia generalizzata e analizzare le fasi di vigilanza.
    7. Separare la pelle del collo e dei muscoli e inserire due elettrodi EMG nel muscolo del collo.
    8. Praticare un altro foro sul cranio e inserire una cannula guida microiniezione nella sinistra CeA (AP 2,8 mm dal bregma, ML, 4,2 mm, DV, 7,8 millimetri rispetto al bregma) nei ratti. Le coordinate sono adattati dal Paxinos e Watson ratto atlante 10.
    9. Praticare un foro più grande (con un diametro di 1,6 mm) sul cranio e inserire un calibrato termistore 30 kV sulla superficie della corteccia parietale, che verrà cementato in seguito, per monitor la temperatura corticale in ratti.
    10. Utilizzare garze e cauterizzazione per arrestare l'emorragia quando si verifica.
    11. Disporre i cavi isolati dagli elettrodi ECOG ed elettrodi EMG ad un piedistallo e collegare il termistore alla cavezza. Cemento piedistallo e guidare la cannula al cranio con acrilico dentale.
    12. Trattare l'incisione per via topica con polysporin (bacitracina zinco / polimixina B solfato) per prevenire l'infezione. Dare gli animali sia ibuprofene e la penicillina G in acqua per una settimana dopo l'intervento chirurgico.
  2. Per i topi (20 - 30 g, da 6 a 8 settimane di età topi C57BL / C)
    1. Anestetizzare i topi mediante iniezione IP con 50 mg / kg Zoletil e confermare la corretta profondità dell'anestesia osservando una mancanza di risposta dopo la presa della zampa posteriore. Applicare una pomata oculare. Dopo la rasatura, sterilizzare la pelle con una soluzione di iodio-povidone e il 75% di etanolo. Iniettare un antibiotico (penicillina G) per prevenire l'infezione.
    2. Posizionare una barra orecchio nel condotto uditivo emontare il mouse per il Stereotaxis.
    3. Usando un bisturi, fare un approssimativo 1,5 cm linea mediana un'incisione sul cranio lungo una linea tra le due orecchie, lo spostamento caudale. Agganciare i lembi cutanei con hemostats per esporre il cranio e rimuovere il tessuto sopra il cranio con un bisturi.
    4. Poke due fori sul cranio con le forbici chirurgiche e posizionare due elettrodi filo ECOG sul lobo frontale destro (F2: +2,0 mm per bregma e 1,5 alla linea mediana) e sinistra del lobo parietale (P1: -3.0 mm a Bregma e -2.5 mm alla linea mediana).
    5. Separare la pelle del collo e dei muscoli e inserire due elettrodi EMG nel muscolo del collo.
    6. Collegare i conduttori isolati dagli elettrodi ECOG filo ed elettrodi EMG ai terminali femmina e un connettore 2,54 mm, e quindi il cemento al cranio con acrilico dentale.
    7. Trattare l'incisione per via topica con polysporin (bacitracina zinco / polimixina B solfato) per prevenire l'infezione. Dare gli animali sia ibuprofene e penicillina G in acqua per un week dopo l'intervento chirurgico.
  3. Consentire a tutti gli animali di recuperare per sette giorni prima dell'inizio degli esperimenti.
  4. Casa ratti o topi separatamente, in gabbie individuali di registrazione, nella stanza isolata dove la temperatura è mantenuta a 23 ± 1 ° C e la luce: buio (L: D) ritmo viene controllato in 12: ciclo di 12 h (40 W x 4 tubi di illuminazione). Fornire cibo e acqua ad libitum.
  5. Collegare il ECoG, EMG, e termistore attraverso una cordicella per gli amplificatori una settimana dopo l'intervento chirurgico per iniziare le registrazioni.

2. Istituzione di Focal TLE epilessia, SE, e spontaneamente ricorrente epilessia

  1. per i ratti
    1. Somministrare 0,5 ml di pilocarpina (2,4 mg / ml) nel CeA sinistro attraverso la cannula guida iniezione utilizzando una pompa microiniezione. Il tasso di iniezione deve essere fissato a 0,2 ml / min per indurre focale TLE.
    2. IP iniettare 300 mg / kg di pilocarpina per indurre epi generalizzatalessia con ricorrenti SE.
  2. per i topi
    1. IP amministrare PTZ (0,035 mg / g di peso corporeo del mouse) in un punto particolare ZT ogni altro giorno. Cinque iniezioni consecutive causerà lo sviluppo di epilessia spontaneamente e periodica generalizzata.
  3. Per entrambi i ratti e topi
    1. Amplificare i segnali ECOG da 5.000 e filtrare i passa-banda analogici tra 0,1 e 40 Hz.
    2. Utilizzare un A / D bordo di conversione per convertire i segnali ECoGs analogici in segnali digitali con una frequenza di campionamento di 128 Hz.
    3. Utilizzare un software per il punteggio visivo e analizzare l'inizio e la durata della epilessia. Misurare la scala temporale per rappresentare la durata.
    4. Definire ECoG epilessia dalla comparsa di picchi epilettici con ampiezze maggiori di 2 mV e con durate di più di 30 s 13.

3. Classificazione delle Vigilanza Uniti

  1. per i ratti
    1. Determinare gli stati di vigilanza utilizzando i parametri acquisiti da ECoGs, EMG, temperatura del cervello, e la locomozione all'interno di un 12-s episodio di registrazione. Collegare il ECoG, EMG e termistore attraverso una cordicella per gli amplificatori una settimana dopo l'intervento chirurgico per avviare la registrazione. Punteggio gli stati con un software su misura in base alle misure 3.1.5 - 3.1.7.
    2. Misurare le attività locomotorie utilizzando un rilevatore di movimento a infrarossi, integrare i segnali ogni 1 s, e memorizzare i segnali.
    3. Misurare la temperatura corticale e memorizzare i segnali.
    4. Classificare gli stati di vigilanza in base ai nostri criteri definiti in precedenza 14.
    5. Punteggio veglia base alle seguenti caratteristiche: ECoGs piccola ampiezza con spettri ad alta frequenza, maggiore potenza delta (0,5 - 4.0 Hz), e minore potenza theta (6.0 - 9,0 Hz); attività locomotoria dominante; alta attività EMG; e aumentando gradualmente la temperatura corticale.
    6. Punteggio sonno non-REM utilizzando il followinCaratteristiche g: delta-onda ECoGs dominanti con grandi ampiezze, è diminuito l'attività EMG, ridotta la temperatura corticale, e nessuna attività locomotoria.
    7. Punteggio sonno REM utilizzando le seguenti caratteristiche: ridotta ampiezza ECoGs con la frequenza dominante theta, all'improvviso aumento della temperatura corticale, l'attività EMG minima, e bassa attività locomotoria con contrazioni del corpo.
  2. per i topi
    1. Ripetere la classificazione degli stati di vigilanza nei topi, come condotti nel ratto, salvo non vi è alcuna temperatura corticale registrato dal termistore.

4. Prestazioni di agopuntura manuale e EA in ratti

  1. Il ratto è anestetizzato per il protocollo EA.
  2. Individuare il punto terapeutico per anatomia e confermare bassa impedenza pelle al punto terapeutico. La spia lampeggia quando rileva la bassa impedenza pelle. Nota: agopunti Fengchi si trova a 3 mm dalla linea mediana posteriore esseretra le due orecchie, sul collo.
  3. Inserire aghi in acciaio inox nelle punti terapeutici ad una profondità di 2 mm.
  4. Twitch gli aghi inseriti 10 volte ogni 5 minuti.
  5. Utilizzando uno stimolatore elettrico funzionale, fornire un treno di impulsi bifasici (durata 150 ms ciascuno) con una intensità di 1 mA per i punti terapeutici attraverso l'ago.
  6. Eseguire un agopuntura sham o sham EA come controllo.

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Risultati

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Ci sono diversi modelli di topo e ratto per soddisfare le esigenze dei diversi tipi di epilessia. Per indurre focale TLE, 0,5 ml di pilocarpina (2,4 mg / ml) viene somministrato in CeA sinistra. I ECoGs epilettiformi predominanti sono acquisiti dall'elettrodo ECoG sul lobo parietale dell'emisfero sinistro (Figura 1A: b), e attività epilettiche rare vengono prelevate dal resto degli elettrodi ECOG (Figura 1A: a, c,

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Discussione

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La scelta di un modello animale di epilessia fattibile è essenziale per ogni scopo sperimentale. Uno dei nostri obiettivi è quello di chiarire gli effetti di EA sulla soppressione epilessia. EA è una medicina alternativa che possono presentare effetti terapeutici in epilessia ed è stato documentato nell'antica letteratura cinese. Tuttavia, vi è una mancanza di prove scientifiche per dimostrarlo. Per determinare gli effetti di EA su epilessia, abbiamo principalmente concentrati sugli effetti della EA in lieve epiless...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni del Ministero della Scienza e della Tecnologia (MOST) MOST104-2410-H-002-053 e NSC99-2320-B-002-026-MY3. Questo manoscritto è stato curato e corretto da Brian Chang, che ha esperienza nella revisione di documenti professionali.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Farmaci
ZoletilVirbac50 mg/kg i.p.
pilocarpinaSigma-AldrichP6503300 mg/kg i.p.; 1,2 mg microiniezione
PTZSigma-AldrichP65000,035 mg/polisporina di topo
Pfizer
Surgery
ECoG elettrodoPlastica Unelettrodo a viteE363/20
PiedistalloPlastiche OneMS363
CannulaPlastics OneC315G/spc
TermistoreOmega Engineering44008
Acrilico dentaleTempron
Strumento stereotassicoStoeltingDural arms
Recording equipments
ECoG amplificatoreColbourn InstrumentsV75-01
Scheda A/DNational InstrumentsNI PCI-6033E
Rilevatori di movimento a infrarossiBiobserve GmbH
Dispositivi
Aghi in acciaio inossidabileShanghai Yanglong Medical Articles Co.32 calibro x 1"
Funzioni Stimolatore elettricoI.T.O., GiapponeTrio 300
AcuPenLhasa OMSPointer Excel II
per ratti Software ICELUS G-System AxoScope 10 su misura molecolari<strong>Agopuntura esigenze

Riferimenti

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