Un modo semplice per misurare alterazioni in ricompensa il comportamento di ricerca Utilizzando Drosophila melanogaster

Sommario

Descriviamo un protocollo per indurre gratificante e nonrewarding esperienze nei moscerini della frutta (Drosophila melanogaster) utilizzando il consumo di etanolo volontaria come misura per le modifiche negli stati di ricompensa.

Abstract

Descriviamo un protocollo per misurare l'etanolo autosomministrazione nei moscerini della frutta (Drosophila melanogaster) come proxy per i cambiamenti negli stati di ricompensa. Dimostriamo un modo semplice per sfruttare il sistema di ricompensa volo, modificare le esperienze legate alla ricompensa naturale, e utilizzare consumo di etanolo volontaria come misura per le modifiche negli stati di ricompensa. L'approccio è uno strumento rilevante per studiare i neuroni e geni che svolgono un ruolo nella esperienza cambia-mediata di stato interno. Il protocollo si compone di due parti distinte: esporre le mosche di esperienze gratificanti e nonrewarding, e analizzando il consumo di etanolo volontariato come una misura della motivazione per ottenere un premio di droga. Le due parti possono essere usati indipendentemente per indurre la modulazione di esperienza come primo passo per ulteriori analisi a valle o come dosaggio alimentazione due scelta indipendenti, rispettivamente. Il protocollo non richiede una configurazione complessa e quindi può essere applicato in qualsiasi laboratory con strumenti di base della cultura mosca.

Introduzione

Modifica del comportamento in risposta alle esperienze permette animali di regolare il loro comportamento ai cambiamenti nel loro ambiente ^1. Durante questo processo, gli animali integrano il loro stato fisiologico interno con mutevoli condizioni dell'ambiente esterno e successivamente scegliere un'azione piuttosto che un altro per aumentare le loro possibilità di sopravvivenza e la riproduzione. Sistemi di ricompensa si sono evoluti per motivare i comportamenti che sono necessari per la sopravvivenza di individui e di specie rafforzando i comportamenti che aumentano la sopravvivenza immediata, come mangiare o bere, o quelli che garantiscono la sopravvivenza a lungo termine, come ad esempio il comportamento sessuale o la cura per la prole ^2. Composti artificiali, come l'abuso di droghe interessano anche sistemi di ricompensa per vie neurali cooptazione che mediano ricompense naturali ^2.

Nel corso degli ultimi due decenni, la mosca della frutta Drosophila melanogaster è stato stabilito come un modello promettente per lo studio della Moleclare e dei meccanismi neuronali che stanno plasmando gli effetti di etanolo sul comportamento ^3,4.

In precedenza, abbiamo identificato un sottogruppo di neuroni peptidergiche nei moscerini (recettore NPF / NPF (R) neuroni) che premia naturali coppia, come esperienza sessuale, alla motivazione di ottenere ricompense droga ^5. espressione NPF è sensibile ad entrambe le esperienze sessuali e alle ricompense di droga, come l'etanolo intossicazione. I cambiamenti nei livelli di espressione NPF vengono convertiti in etanolo alterazioni autosomministrazione ^5, dove l'alta NPF riduce e bassa NPF aumenta la preferenza a consumare etanolo. L'attivazione dei neuroni NPF è gratificante per le mosche, in quanto mostrano una forte preferenza per un odore in coppia con l'attivazione, che si riflette anche dalla riduzione del consumo di etanolo. Ancora più importante, l'attivazione dei neuroni NPF interferisce con la capacità di mosche formare un'associazione positiva tra etanolo intossicazione e un cue odore. Il nesso causale tra la NPF / Rsistema, la memoria di ricompensa, e il consumo di etanolo suggerisce che si può usare l'etanolo autosomministrazione come misura per le modifiche negli stati ricompensa ^5.

In questa pubblicazione abbiamo dimostrato un approccio integrato per attingere il sistema di ricompensa naturale mosca e modifiche del test negli stati di ricompensa. L'approccio è costituito da due parti separate, un protocollo di formazione per la manipolazione di esperienze naturali ricompensa legati, seguita da una a due scelta saggio alimentatore capillare (CAFE) per valutare l'etanolo autosomministrazione come una stima per i cambiamenti negli stati di ricompensa. Il saggio CAFE è analogo ai saggi scelta due bottiglie utilizzate in studi su roditori drug autosomministrazione ed è stato dimostrato per riflettere alcune proprietà di comportamento dipendenza simile mosche ^6.

Protocollo

Nota: panoramica generale del disegno sperimentale: Il disegno sperimentale prevede un protocollo adattato per la soppressione corteggiamento ^7-9 in cui le mosche di sesso maschile sono esposti a esperienze gratificanti e nonrewarding in 3 allenamenti consecutivi nel corso di 4 d. Al termine della fase di esperienza, le mosche sono testati in un saggio di consumo di etanolo volontaria due scelta per 3 - 4 d. Il protocollo include qui diverse fasi preparatorie, alcune delle quali possono essere fatte in anticipo per essere utilizzato in più di un esperimento, mentre altri dovrebbero avvenire tempestivamente prima dell'inizio dell'esperimento (Tabella 1).

1. Operazioni preliminari

1. Preparazione del sistema di alimentazione capillare
   1. Scaldare un ago G 27 e usarlo per forare piccoli fori lungo un flacone (Figura 1).
   2. Tagliare la spina fiala a metà (trasversale) con una lama di rasoio. Mark quattro punti sulla superficie del tappo, creando un square forma per posizionare i titolari capillari in. Utilizzare un ago 18 G per fare 4 fori attraverso il tappo (figura 1b).
   3. Utilizzare una lama di rasoio per tagliare micropipette in modo che possano tenere saldamente 5 capillari di vetro microlitri, che servono come adattatori.
   4. Inserire 4 adattatori capillari nelle spine preparati.
   5. Segnare la posizione dei 2 etanolo e due capillari nonethanol contenenti sulla spina.
      Nota: Si consiglia di mantenere le posizioni dei 2 tipi di capillari coerente in tutte le fiale. Prestare attenzione alle dimensioni dei fori, come grandi fori permettono la fuoriuscita di mosche delle fiale. Inoltre, si raccomanda di utilizzare il lato più liscio della spina (generalmente opposto al lato cut) come il lato rivolto verso il basso quando inserito nel flacone, come tagliando la spina crea alcuni piccoli, fibre sciolte che le mosche possono impigliarsi in .
   6. Preparare un gran numero di fiale e adattatori da utilizzare per il sistema di alimentazione capillare (CAFE)esperimenti descritti al punto 2.3.
2. Preparazione fiale alimentari piccolo vetro
   1. Un giorno prima di raccogliere le mosche (passo 1,4), organizzare 200 fiale di vetro su rack provetta. Melt mosca cibo (secondo la ricetta melassa farina di mais, vedere la tabella dei Materiali) utilizzando un forno a microonde. Versare 2 mL di cibo volare in flaconi di vetro (cercare di non spalmare il cibo sulle pareti della fiala). Lasciare indurire cibo, e coprire le fiale di involucro di plastica.
      NOTA: Le fiale di vetro contenenti il ​​cibo può essere conservato a 4 ° C per diverse settimane.
   2. Il giorno della raccolta volare, prendere le fiale dal frigorifero e lasciare che raggiungano RT prima di utilizzarli a casa mosche.
      NOTA: Se fiale alimentari sono diverse settimane di vita, assicurarsi che il cibo è ancora integro e non distaccata dalla fiala, in linea possono essere intrappolati nelle fessure tra il cibo e il vetro.
3. Fare soluzione di riserva di cibo per il saggio alimentatore capillare
   1. per prepare soluzione madre alimentare (5% di saccarosio e il 5% di estratto di lievito), sciogliere 5,88 g di estratto di lievito e 5,88 g di saccarosio in 100 ml di acqua distillata.
      NOTA: La soluzione madre è molto incline alla contaminazione. Pertanto, si raccomanda di autoclave esso (121 ° C, 30 min, e senza un ciclo di asciugatura) e aliquote in 850 microlitri aliquote lavorativi per essere conservato a 4 ° C fino all'utilizzo. La concentrazione degli ingredienti nella soluzione madre è 5.88% e raggiungerà la concentrazione finale del 5% dopo l'aggiunta del 15% di etanolo o acqua (150 ml in 850 ml di soluzione di cibo premade) appena prima del suo uso in fase 2.3.
4. Raccolta mosche sperimentali
   1. Raccogliere 200 mosche maschio naïve utilizzando un pad di CO _2.
      Nota: Utilizzare qualsiasi ceppo di laboratorio rilevanti per la questione sperimentale. 250 mosche possono essere facilmente raccolti da cinque bottiglie di mosche in loro fase eclosion scelta. Quando si raccolgono le mosche, prestare attenzione a colmosche gliere che hanno recentemente eclosed (mosche vergini di aspetto: mosche luminosi con una macchia meconio sul loro addome). mosche sperimentali devono essere tenuti singolarmente in flaconcini di vetro di piccole dimensioni contenenti cibo e di età compresa tra 3 - 4 d vecchia prima di essere utilizzato nell'esperimento.
   2. Utilizzare le spine morbide per chiudere le fiale.
      NOTA: Gli stessi tappi morbidi sarà molto utile per la fase di addestramento quando si utilizza la bocca di aspirazione per inserire le donne dentro e fuori delle fiale durante la fase di esperienza.
5. Raccolta mosche allenatore
   NOTA: Tutte le mosche raccolti devono essere conservati in un / incubatore scuro 12 h / 12 h di luce a 25 ° C e 70% di umidità relativa (RH). Il ciclo di 12 h / 12 h luce / buio può essere cambiato in un comodo orario di partenza.
   1. Virgin mosche allenatore femminili
      1. Raccogliere 500 vergine formatore femminile vola da uno stock WT o di un magazzino virginator per l'uso come le femmine ricettive vergini. Mantenere le mosche di sesso femminile in gruppi di 25 per cibo normale-dimensioni fiala, e tuttili ome età per 3 - 4 d vecchio prima di utilizzarli per l'esperimento.
   2. Accoppiati mosche allenatore femminili
      1. Raccogliere 300 mosche femmine vergini provenienti da uno stock WT o un virginator magazzino di sottoporsi accoppiamento prima della fase di formazione (punto 1.6.1).
         NOTA: le mosche femminili sono allevati in gruppi di 10 femmine per cibo normale-dimensioni flaconcino e di età compresa tra 3 - 4 d vecchia prima di essere utilizzato nell'esperimento.
   3. mosche maschile utilizzato per generare accoppiate mosche allenatore femminili
      1. Raccogliere 150 mosche maschio (non necessariamente vergine).
         NOTA: Le mosche sono tenuti in gruppi di 15 maschi per regolare dimensioni fiala cibo e di età compresa tra 3 - 4 d vecchia prima di essere accoppiato con la femmina vergine vola per creare le femmine accoppiate allenatore.
6. Generazione di mosche femmina allenatore accoppiate
   1. Per generare femmine fecondate vola a essere utilizzati come addestratori, gruppi coppia di 10 femmine vergini vola con 15 maschi vola lanciando un flaconcino contenente maschile in una femmina-contavorazio fiala 16 - 18 h prima della fase di formazione (punto 2.1) ^10.
      NOTA: Questo dovrebbe normalmente avvenire la sera prima della sessione di allenamento. Il 1.5: 1 rapporto tra maschile vola a mosche di sesso femminile assicura che tutte le femmine saranno accoppiati.
   2. Il giorno dell'esperimento, separare le femmine fecondate dai maschi aspirando i maschi dalla fiala usando un aspiratore bocca. Eseguire questo diritto prima dell'inizio di ogni giornata di formazione.

2. Fasi sperimentali

1. Impostazione della fase di esperienza
   1. Avviare l'esperimento il più vicino possibile l'inizio della fase leggera nell'incubatrice. Posizionare le femmine allenatore (sia vergini e accoppiati) nella camera di comportamento.
      NOTA: Si consiglia di eseguire l'esperimento in una camera di comportamento, o qualsiasi ambiente appartato che è tranquillo e impostare a 25 ° C e 60-65% di umidità relativa. Mantenere umidità superiore al 50% è molto importante, poiché corteggiamento e l'accoppiamentos dipendono sensing feromone, che è noto per essere sensibile all'umidità.
2. Esponendo le mosche di sesso maschile per esperienze gratificanti e nonrewarding
   1. Disporre le fiale di vetro contenenti i singoli mosche maschio su rack microcentrifuga, posizionando i flaconi lungo i margini del rack.
      NOTA: Questa disposizione consente allo sperimentatore di osservare facilmente le coppie di mosche che subiscono copulazione senza prendere le fiale fuori dal rack.
   2. Preparare (come descritto al punto 2.2.1) 2 gruppi di 100 fiale di vetro contenenti singolo maschio vola su rack separati per maschi sottoposti a esperienze gratificanti di accoppiamento e nonrewarding (cioè respinti e accoppiati).
   3. Aspirare femmine allenatore e aggiungerli ad ogni flacone contenente le mosche di sesso maschile. Impostare il timer per 1 ora. A partire con il gruppo respinto, aggiungere una femmina accoppiato ad ogni flacone. Poi, passare ai maschi ad essere accoppiati e aggiungere una femmina vergine ad ogni flacone.
   4. Guardare da vicino gli incontri di accoppiamentoper assicurarsi che i maschi interagiscono con femmine vergini accoppiano con successo entro la prima ora e che i maschi interagiscono con le femmine precedentemente accoppiate non si accoppiano. Per monitorare la coorte respinto nel corso di 1 h, impostare un secondo timer per 15 minuti e guardare maschi ogni 15 min.
   5. Scaricare i maschi della coorte respinto che è riuscito ad accoppiarsi e maschi dalla coorte accoppiato che non finiscono di accoppiamento entro la fine della prima sessione di allenamento.
   6. Termina il primo allenamento aspirando i formatori femminili precedentemente accoppiati in un normale flacone cibo volare, e tenerli per la prossima sessione di condizionamento. Seguire questo passaggio aspirando delicatamente le femmine del gruppo maschile accoppiato.
   7. Lasciate che le mosche riposare per 1 ora.
   8. Ripetere i punti 2.2.3 - 2.2.7 due volte.
   9. Ripetere la sessione di allenamento in fasi 2.2.3 - 2.2.8 ogni giorno per più di 3 d.
3. Consumo di registrazione (CAFE)
   1. Alla fine dell'ultimo conditioning sessione (quarto giorno), aspirare singoli maschi e raggrupparli in fiale di alimentazione capillare. Utilizzare una spina morbido per coprire la fiala alimentatore capillare durante l'inserimento le mosche, e sostituirlo rapidamente con la spina di alimentazione capillare ready-made, dopo tutte le mosche sono stati inseriti. Gruppo 6 - 8 linea di ciascuno dei gruppi sperimentali in una fiala, creando non meno di 8 fiale per condizione.
   2. Bagnare i tappi aggiungendo delicatamente 5 mL di acqua all'inizio del tappo. Prestare attenzione durante l'aggiunta di acqua per evitare perdite nelle fiale. Aggiungere la stessa quantità di acqua per ogni flacone.
      NOTA: Questo passo è fatto per ridurre l'evaporazione dai capillari. Pertanto, si ripete ogni giorno per il resto dell'esperimento. A seconda della umidità relativa, i giorni successivi possono richiedere meno acqua da aggiungere alle spine.
   3. Preparare due soluzioni separati dell'alimento aggiungendo etanolo o acqua per le aliquote di cibo e per creare una concentrazione finale del 15%.
   4. Per riempire il capillariete con le due soluzioni alimentari, creano 5 microlitri cibo liquido cade su una pellicola di laboratorio e permettono la soluzione per riempire il capillare fino a raggiungere il contrassegno 5 microlitri. Assicurarsi di utilizzare il chiaro fine del capillare, che è vicino alla linea di segno nero 5 ml.
      NOTA: per riempire diversi capillari contemporaneamente, è possibile collegare 6 - 8 adattatori capillari e li usa come inserto per tenere i capillari.
   5. Toccare i capillari delicatamente sulla striscia di paraffina per posizionare la soluzione cibo esattamente in corrispondenza del segno nero. Sigillare i capillari immergendo la fine di ciascun capillare in piccole gocce di olio minerale. Questo passaggio minimizza potenziale evaporazione della soluzione cibo.
   6. Inserire due capillari contenente etanolo e due capillari nonethanol contenente attraverso i 4 adattatori / porta nella spina finché i lati esposti dei capillari malapena peek dall'interno della fiala (1 mm o meno dalla superficie spina).
      NOTA:Mantenendo l'apertura dei capillari vicino alla spina bagnato riduce l'evaporazione e consente un facile accesso al cibo, in linea normalmente siedono sui tappi e scendere sul capillare esposto ad alimentare.
   7. In aggiunta a fiale contenenti mosche sperimentali, preparare una fiala finto, senza mosche. Questo controllo serve per valutare l'evaporazione naturale.
      NOTA: Cercare di mantenere relativamente uguale posizionamento dell'apertura capillare rispetto ai tappi, le differenze possono portare a evaporazione variabile e fuorvianti dati di consumo. Mantenere un'adeguata umidità durante l'esperimento e posizionare le aperture capillari più vicino possibile alla spina bagnato, come bassa umidità e grande distanza dalla spina bagnato può sia risultato dell'evaporazione incontrollata.
   8. Registrare la posizione relativa del liquido in ciascuna delle capillari rispetto alla linea segno nero in mm utilizzando un righello, e scrivere questi valori.
      NOTA: Se la soluzione è posizionata esattamente al l neraine, il valore dovrebbe essere uguale a zero, e se è superiore o inferiore, dovrebbe essere valori positivi o negativi, rispettivamente. I livelli iniziali di liquido impostare i punti di riferimento per i valori di consumo finale O / N.
   9. Impostare le fiale indietro nell'incubatrice per 24 h. Sostituire i capillari alla volta costante durante l'intero esperimento.
   10. Rimuovere i capillari delicatamente dalle fiale e misurare i livelli di liquido rispetto alla linea di marcatura nera.
   11. Controllare attentamente il livello del liquido nel flaconcino finto.
       NOTA: Se i livelli sceso superiore a 2 mm, indica che l'evaporazione è elevata ei livelli di consumo non sono affidabili.
   12. Inumidire i tappi delicatamente con 2 ml di acqua e inserire una nuova serie di capillari, come indicato nei passaggi 2.3.3 - 2.3.10. Impostare le fiale indietro nell'incubatrice per 24 h.
4. Determinazione preferenza
   1. Calcolare il consumo totale di ciascun capillare sottraendo il livello finale dal ilivello nitial al punto di partenza.
   2. Combinare i valori delle due capillari con lo stesso cibo (cioè nonethanol capillari separatamente dai capillari contenente etanolo).
   3. Calcolare preferenza etanolo sottraendo la quantità consumata dai capillari non-etanolo dalla quantità consumata dai capillari contenente etanolo e dividere il valore i valori totali di consumo da tutti i capillari della stessa fiala.
   4. La media dei indici di preferenza di tutti i flaconi dello stesso gruppo sperimentale.
      
      NOTA: Nonethanol 1 (NE1), Nonethanol 2 (NE2), Etanolo 1 (E1), Etanolo 2 (E2), nonethanol totale (NE totale) = NE1 + NE2, etanolo totale (Total E) = E1 + E2, somma totale consumo (somma) = totale NE + Total e, ed etanolo preferenza Index (PI)

Risultati

FPreviously, Devineni et al. hanno dimostrato che quando i moscerini della frutta sono dati la scelta di consumare cibo contenente etanolo, mostrano una forte preferenza per il cibo contenente etanolo sopra nonethanol contenente cibo ^6. Indicato qui ci sono alcuni risultati rappresentativi si ottengono quando saggiare la preferenza etanolo innata di mosche maschio ingenua che non ha subito il protocollo di allenamento.

Discussione

Qui, illustriamo i dettagli di un approccio integrato per misurare le alterazioni nel comportamento di ricerca della ricompensa, sulla base di precedenti lavori descritti da Devineni et al.⁶ e Shohat-Ophir et al⁵. La prima sezione del protocollo utilizza diversi tipi di interazioni sessuali come input dell'esperienza, mentre la seconda sezione utilizza un test di alimentazione a due scelte per valutare l'effetto dell'esperienza sulla preferenza di consumare etanolo.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Polistirene 25 x 95 mm	Fiale FlyStuff	32-109
Flaconi in plastica stretta FlyStuff		42-102
Ago sterile monouso 18 G e 27 G	può essere acquistato da qualsiasi azienda		1,20 X 38 mm (18 G x 1 1/2"), 0,40 X 13 mm (27 G x 1/2")
10 x 75 mm Tubi di coltura monouso in vetro borosilicato kimble	chase	73500-1075
pipette calibrate 5 μ L	VWR	53432-706	codice colore bianco per contenere 5 μ L
Olio minerale	Sigma-Aldrich	M5904
saccarosio, grado di biologia molecolare	CALBIOCHEM	573113
estratto di lievito in polvere per microbiologia	può essere acquistato da qualsiasi azienda
Etanolo	Sigma-Aldrich	32221
pipetta standard Puntali (micro-pipette)	ThermScientific	T114R-Q	volume: 0,1 - 20 μ L (ultramicro)
IDENTI-PLUGS (tappi per tubi in schiuma)	Jaece	L800-A	per aperture da 6 a 13 mm
IDENTI-PLUGS (tappi per tubi in schiuma)	Jaece	L800-D	35 a 45 mm
virginator fly stock	bloomington drosophila stock center	#24638
Fiale strette, confezione vassoio (PS)	Genesee Scientific Corporation	# 32-109BR
Drosophila Media Ricette e metodi	Bloomington Drosophila Stock Center	http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.htm
acido propionico	Sigma-Aldrich	P5561
acido fosforico	Sigma-Aldrich
Methl 4-idrossibenzoato	Sigma-Aldrich	H3647
Agar Agar	può essere acquistato da qualsiasi azienda
mais	può essere acquistato da qualsiasi azienda
Melassa della nonna	B& G Foods, Inc	non indicato che
lievito secco istantaneo	può essere acquistato da qualsiasi azienda