Qui, presentiamo un protocollo per introdurre sonde chimiche sito-specifiche in un frammento di anticorpo incorporando geneticamente un amminoacido contenente azide, e successivamente accoppiando l'azide con una sonda chimica mediante cicloaddizione azide-alchino promossa dal ceppo (SPAAC).
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Articolo metodologico
Efficiente e anticorpi etichettatura per cicloaddizione azide-alchino Strain-promosso site-specific
In questo articolo
Sommario
Abstract
Ci sono attualmente molti strumenti chimici a disposizione per introdurre sonde chimiche in proteine per studiare la loro struttura e funzione. Un metodo utile è la coniugazione di proteine geneticamente introducendo un amminoacido non naturale contenente un gruppo funzionale bioorthogonal. Questo rapporto descrive un protocollo dettagliato per site-specific anticorpi coniugazione. Il protocollo comprende dettagli sperimentali per la costituzione genetica di un aminoacido azide contenenti, e la reazione di coniugazione per cicloaddizione azide-alchino strain-promosso (SPAAC). Questa reazione strain-promosso procede per semplice miscelazione delle molecole reagenti a pH fisiologico e temperatura, e non richiede reagenti aggiuntivi come rame (I) ioni e leganti rame-chelanti. Pertanto, questo metodo sarebbe utile per la coniugazione di proteine generale e sviluppo di anticorpi coniugati farmaco (ADC).
Introduzione
Dal momento che la costituzione genetica di p -methoxyphenylalanine in Escherichia coli è stato segnalato, 1 più di 100 amminoacidi non naturali (UAAs) sono stati inseriti con successo in varie proteine. 1-3 Tra questi UAAs, gli aminoacidi contenenti gruppi funzionali bioorthogonal sono stati ampiamente studiati e rappresentano la percentuale più elevata. I gruppi funzionali bioorthogonal utilizzati nei UAAs includono chetone, 4 azide, 5 alchino, 6 cyclooctyne, 7 tetrazina, 8 α, β-insaturo ammide, 9 norbonene, 10 transcyclooctene, 11 e bicic....
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Protocollo
1. Costruzione plasmide
- Costruire un plasmide di espressione (pBAD-HerFab-L177TAG) che esprimesse il gene bersaglio degli anticorpi (pBAD-HerFab-WT) con il suo 6 -tag, e sostituire il codone per la leucina-177 con il codone ambra (TAG) 27, utilizzando convenzionale tecnica di mutagenesi sito-diretta.
Vedere la Tabella dei Materiali. - Costruire un altro plasmide di espressione (pEVOL-AFRS) contenente i geni per il tRNA evoluta Tyr e-tRNA sintetasi coppia (AARS). Utilizzare il vettore plasmide appositamente progettato, pEVOL, per un efficiente incorporazione di UAAs. Le dettagliate protocolli ....
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Risultati
In questo studio, un frammento di anticorpo era sito-specifico coniugato con un fluorocromo incorporando un aminoacido azide contenente nel frammento e reagire il frammento di anticorpo mutante con un cyclooctyne teso (Figura 1). HerFab è stato selezionato come il frammento di anticorpo di destinazione in cui AF è stato accolto come un aminoacido azide contenenti. Per scegliere il residuo in HerFab per la sostituzione con AF, la struttura cristallina ai raggi X del HerFa.......
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Discussione
L'incorporazione genetica di aminoacidi non naturali in proteine ha diversi vantaggi rispetto ad altri metodi utilizzati per la modifica della proteina. 1-3 Uno dei vantaggi importanti è la sua applicabilità generale a qualsiasi tipo di proteina. In linea di principio, non vi è alcuna limitazione nella scelta di una proteina bersaglio e un sito target della proteina. Tuttavia, la sostituzione di un residuo strutturalmente o funzionalmente importante con SAU può comportare alterando la struttura e la fun.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1. Costruzione del plasmide | |||
| plasmidi | opzionalmente contiene il codone di stop ambrato (TAG) in una posizione desiderata. Ko, W. et al. Marcatura efficiente e sito-specifica degli anticorpi mediante cicloaddizione azide-alchino promossa dal ceppo. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015) | ||
| plasmide pEvol-AFRS | Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., e Schultz, P. G. Un sistema potenziato per la mutagenesi innaturale degli aminoacidi in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/jmb.2009.10.030, (2010) | ||
| DH10B | Invitrogen | C6400-03 | Expression Host |
| Plasmid Mini-prep kit | Nucleogen | 5112 | 200/pack |
| Agarosio | Introne biotecnologia | 32034 | 500 g |
| Bromuro di etidio | Alfa Aesar | L07482 | 1 g |
| LB Brodo | BD Difco | 244620 | 500 g |
| 2. Preparazione della coltura | |||
| 2.1 Elettroporazione | |||
| Micro pulsatore | BIO-RAD | 165-2100 | |
| Cuvetta per micro pulsatore | BIO-RAD | 165-2089 | 0.1 cm interasse tra gli elettrodi, confezione da 50 |
| Ampicillina Sodium | Wako | 018-10372 | 25 g |
| Cloramfenicolo | Alfa Aesar | B20841 | 25 g |
| Agar | SAMCHUN | 214230 | 500 g |
| SOC medium | Sigma | S1797 | 100 mL |
| 3. Espressione e purificazione di HerFab-L177AF | |||
| 3.1 Espressione di Herfab-L177AF | |||
| p-azido-L-fenilalanina (AF) | Bachem | F-3075.0001 | 1 g |
| L(+)-arabinosio, 99% | Acros | 104981000 | 100 g |
| Acido cloridrico, 35~37% | SAMCHUN | H0256 | 500 mL |
| 3.2 Lisi cellulare | |||
| Tris(idrossimetil)amminometano, 99% | SAMCHUN | T1351 | 500 g |
| EDTA sale disodico diidrato, 99,5% | SAMCHUN | E0064 | 1 kg |
| Saccarosio | Sigma | S9378 | 500 g |
| Lisozima | Siyaku | 126-0671 | 1 g |
| 3.3 Cromatografia di affinità Ni-NTA | |||
| Ni-NTA | QIAGEN | 30210 | 25 mL |
| Colonna in polipropilene | QIAGEN | 34924 | 50/confezione, capacità 1 mL |
| Imidazolo, 99% | SAMCHUN | I0578 | 1 kg |
| Fosfato di sodio monobasico, 98% | SAMCHUN | S0919 | 1 kg |
| Cloruro di sodio, 99% | SAMCHUN | S2907 | 1 kg |
| 4. Coniugazione di HerFab-L177AF purificato con sonde alchine utilizzando la cicloaddizione azide-alchino promossa dal ceppo (SPAAC) | |||
| Cy5.5-ADIBO | FutureChem | FC-6119 | 1 mg |
| 5. Purificazione dei filtri centrifughi HerFab | |||
| Amicon Ultra da 0,5 mL | MILLIPORE | UFC500396 | 96/confezione, 500 μ L capacity |
| 6. Analisi SDS-PAGE di HerFab marcato e scansione su gel fluorescente | |||
| 1,4-Ditio-DL-treitolo, DTT, 99,5% | Sigma | 10708984001 | 10 g |
| NuPAGE LDS Sample Buffer, 4x | Thermofisher | NP0007 | 10 mL |
| MES tampone di corsa | Thermofisher | NP0002 | 500 mL |
| Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gel | Thermofisher | NO0321 | 12 pozzetti |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Wako | 031-17922 | 25 g |
| Typhoon 9210 imager a modalità variabile | Amersham Biosciences |
Riferimenti
- Wang, L., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Angew. Chem. Int. Ed. 44 (1), 34-66 (2004).
- Wu, X., Schultz, P. G. Synthesis at the interface of chemistry and biology. J. Am. Chem. Soc. 131 (35), 12497-12515 (2009).
- Liu, C. C., Schultz, P. G.
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Ristampe e permessi
