Prossimale Cadaveric Femore preparazione per l'analisi agli elementi finiti Resistenza alla frattura Prove e quantitativa CT-based

Sommario

Vi presentiamo un protocollo robusto su come preservare con cura e preparare femori da cadavere per la prova di frattura e di imaging quantitativa tomografia computerizzata. Il metodo fornisce un controllo preciso sulla condizioni di ingresso al fine di determinare le relazioni tra densità minerale ossea, resistenza alla frattura, e definendo finita la geometria e le proprietà elemento del modello.

Abstract

test frattura Cadaveric è abitualmente utilizzato per comprendere i fattori che influenzano la forza del femore prossimale. Poiché ex vivo tessuti biologici sono inclini a perdere le loro proprietà meccaniche nel tempo, preparazione dei campioni per le prove sperimentali deve essere eseguita con attenzione per ottenere risultati affidabili che rappresentano le condizioni in vivo. Per questo motivo, abbiamo progettato un protocollo e un insieme di apparecchi per preparare i campioni femorali tale che le loro proprietà meccaniche sperimentato modifiche minime. I femori sono stati tenuti in uno stato congelato tranne durante le fasi di preparazione e prove meccaniche. Le misure cliniche pertinenti del totale dell'anca e del femore densità collo minerale ossea (BMD) sono stati ottenuti con un densitometro clinica dual assorbimetria a raggi X (DXA), e la geometria e la distribuzione di minerale osseo 3D sono stati ottenuti utilizzando CT con un corpo di calibrazione per stime quantitative in base ai valori in scala di grigi. Eventuali malattie delle ossa, fratture, O la presenza di impianti o manufatti che incidono sulla struttura ossea, è stata esclusa con scansioni radiografiche. Per la preparazione, tutti ossa sono state accuratamente puliti dei tessuti molli eccesso, e sono stati tagliati e vaso con l'angolo di rotazione interna di interesse. Un dispositivo di taglio consentito l'estremità distale dell'osso da tagliare lasciando femore prossimale ad una lunghezza desiderata. Per consentire il posizionamento del collo femorale ad angoli prescritti durante tardi TAC e prove meccaniche, gli alberi femorali prossimali erano in vasi in polimetilmetacrilato (PMMA) utilizzando un dispositivo progettato specificamente per gli orientamenti desiderati. I dati raccolti dai nostri esperimenti sono stati poi utilizzati per la validazione di tomografia computerizzata quantitativa (QCT) a base di analisi agli elementi finiti (FEA), come descritto in un protocollo diverso. In questo manoscritto, vi presentiamo il protocollo per la preparazione dell'osso preciso per prove meccaniche e successiva modellazione QCT / FEA. Il protocollo attuale è stato applicato con successo per preparare circa 200 cadfemori Averic per un periodo di tempo di 6 anni.

Introduzione

Determinare la vera resistenza alla frattura femorale prossimale da cadavere con test meccanici è un metodo distruttivo che richiede un approccio rigoroso ai test per misurazioni accurate. In particolare, sono necessari metodi di preparazione ossea adeguati per mantenere l'integrità quasi in vivo delle ossa prima del test di frattura meccanica¹. Ciò si ottiene grazie a una corretta conservazione dell'osso e alla riduzione al minimo della manipolazione a temperatura ambiente. Questi dati di test sono ampiamente utilizzati per convalidare modelli QCT/FEA di frattura femorale che hanno il potenziale per essere utilizzati clinicamente per comprendere il rischio di frattura, specialmente nei pazienti osteoporotici. Sfortunatamente, non esiste attualmente una procedura standard per preparare campioni di femore prossimale per i test meccanici. Una buona procedura di prova dovrebbe garantire la ripetibilità e la riproducibilità del processo di preparazione. Pertanto, i dispositivi necessari per la preparazione dei campioni devono essere progettati e fabbricati con cura per ridurre al minimo la probabilità di vari errori di test. Dobbiamo anche ridurre al minimo il tempo di preparazione per il quale il tessuto osseo è a temperatura ambiente e quindi in pericolo di degradazione con cambiamenti irreversibili nelle proprietà meccaniche.

A tal fine, abbiamo sviluppato una procedura che preserva il tessuto osseo attraverso più fasi di preparazione. Questo è importante per garantire un tempo di esposizione minimo a temperatura ambiente, riducendo al minimo il numero di cicli di congelamento/scongelamento che possono influire sulle proprietà fisiche dei tessuti². L'intera procedura è lunga e non banale in quanto i passaggi si sono svolti nell'arco di più settimane e hanno richiesto una pianificazione per le procedure di scansione e la disponibilità del personale. Le fasi includevano lo scongelamento dei campioni ossei, lo screening dei campioni mediante scansione DXA per ottenere i valori di densità minerale ossea (BMD), i raggi X per escludere eventuali campioni malati e infine la scansione TC per stimare la distribuzione dei minerali ossei e la geometria femorale. Tutti i campioni sono stati preparati per il test rimuovendo i tessuti molli estranei dalla superficie ossea, tagliando il femore alla lunghezza richiesta per il test e invasando il femore nell'orientamento desiderato per simulare una caduta laterale sull'anca durante i test successivi. È essenziale mantenere il periodo di tempo per tutte queste operazioni il più breve possibile. Un protocollo robusto è quindi obbligatorio per una preparazione coerente dei campioni, la conservazione dei tessuti tra le fasi e per ridurre il tempo di preparazione complessivo.

Lo scopo di questo articolo è presentare in dettaglio le procedure coinvolte nella preparazione di campioni femorali per i successivi test meccanici in varie condizioni. La conservazione del tessuto osseo è fondamentale in questo processo e l'abbiamo ottenuta mantenendo i campioni congelati tra un passaggio e l'altro e tenendoli sempre avvolti con cura in asciugamani saturi di soluzione salina, tranne durante la scansione e il test meccanico delle ossa. I femori sono stati anche tenuti avvolti in asciugamani bagnati e salini durante le fasi di polimerizzazione del PMMA per prevenire la secchezza del tessuto osseo.

Protocollo

NOTA: Tutti gli studi presentati in questo protocollo sono stati approvati dal Institutional Review Board (IRB) presso la Mayo Clinic. Le ossa sono stati ottenuti in un periodo di 6 anni da varie organizzazioni. Tutti i campioni sono stati raccolti entro 72 ore dalla morte, avvolti in asciugamani saline saturi, e conservati a -20 ° C fino a quando la preparazione.

1. misurazione della densità minerale ossea DXA Utilizzando

1. Rimuovere campioni conservati a -20 ° C freezer scongelare a temperatura ambiente per circa 24 ore; i campioni non devono essere rimossi dalla confezione originale se la maggior parte dei tessuti molli è stato rimosso.
2. Utilizzare due 5 lb sacchi di riso per tenere conto di tessuti molli. Coprire i due sacchi di riso sul tavolo DXA con sacchetti di plastica per evitare la contaminazione. I sacchetti di riso simuleranno tessuti molli circostanti (in vivo) durante la scansione, come illustrato in Figura 1.
3. Proteggere la superficie dello scanner DXA con carta di plastica allineati e inserire 2 ri plastica avvoltosacchetti ce sul tavolo scanner (Figura 1A).
4. Lay 2 femori (destra e sinistra) sopra i sacchetti di riso tale che l'estremità prossimale (inclusa la testa femorale) è centrata su borse e il lato posteriore è basso (Figura 1B). Questo imita un paziente sdraiato sulla schiena.
5. Coperchio anteriore / fine del femore prossimale esposta con l'aggiunta di due borse 5 libbre di riso (Figura 1C).
6. Posizionare la macchina testa sopra femore prossimale e scansione femore secondo la procedura istituzionale standard per la misurazione BMD paziente (Figura 1C). Seguire le specifiche istruzioni del produttore DXA.
   1. Dall'interfaccia software della macchina DXA effettuare una normale scansione femore. Selezionare l'esame del femore, posizionare il braccio DXA sulla parte superiore del femore da cadavere premendo sulla freccia a sinistra oa destra di conseguenza sul braccio DXA, e avviare l'esame facendo clic sul pulsante "start". Eseguire l'analisi BMD cliccando su "Analizza".
      NONE: La risultante T-score automatica dalla scansione classifica l'osso come normale, osteopenia o osteoporosi (Figura 1D). Seguire le specifiche istruzioni del produttore DXA.

2. Pulizia, taglio e foratura distale estremità dell'osso

1. Pulire più prossimali 300 mm del femore rimuovendo accuratamente qualsiasi tessuto molle rimanente dall'osso. questo passaggio è necessario per consentire PMMA per contattare il tessuto osseo durante il processo di impregnazione in preparazione per prove meccaniche. Le ossa non devono essere scongelati a temperatura ambiente per questo processo.
2. Sanificare l'area di lavoro con il 70% di alcol isopropilico e coprire il tavolo con tamponi di carta assorbente con film plastico su un lato (Figura 2A). Impostare l'intero femore sulla tavola (Figura 2B) per l'intero processo a partire con la pulizia di taglio (Figura 2A a 2H). Indossare dispositivi di protezione individuale (DPI) compresi i guantie la protezione degli occhi.
3. Raschiare l'eccesso periostio e tagliare via tessuto in eccesso con un raschietto e bisturi (Figura 2C, 2H).
4. Inserire l'osso nel dispositivo di taglio su misura, come mostrato in figura 2D con la testa del femore contro la piastra acrilica dell'apparecchio.
5. Allineare e tenere premuto il diafisi contro i due perni sul dispositivo di taglio (Figura 2D).
6. Fissare l'osso al supporto serrando la piastra asolata sulla diafisi; se l'osso non si trova piatto sul dispositivo, appendere distale fine off piano del tavolo e anche zip opzionalmente legare il collo del femore come necessario per tenere il campione in posizione (Figura 2D).
7. Tagliare l'albero distale del femore con la taglierina cast (Figura 2E) tramite la piastra scanalata come guida; tenere l'osso con un secco panno / asciugamano per una migliore aderenza.
8. Rimuovere l'osso dal dispositivo; normale lunghezza delle ossa dopo il taglio è 255 mm (Figura2F).
9. Pulire la cavità midollare osseo utilizzando una curetta circa 25 mm di profondità. Quindi, inserire una garza per asciugare la superficie interna. Rimuovere la garza appena prima dell'immissione estremità distale del femore nello stampo. Grip l'osso con un asciugamano asciutto / straccio e praticare un foro 10 millimetri attraverso l'estremità distale a circa 25 mm dalla estremità prossimale tagliare del campione. Nota: Questo per consentire il PMMA di penetrare nel canale e fissare l'osso saldamente.

3. Potting the Bone

1. Progettazione e contenitore invasatura fabbricare. I contenitori di impregnazione sono fatte di lastre acriliche 5 mm di spessore e hanno le seguenti dimensioni esterne: 50 mm per 50 mm sezione quadrata e 100 mm di altezza (Figura 3a).
2. Etichetta contenitore invasatura con l'identificazione delle ossa appropriata (Figura 3A e 3B - vedere l'etichetta sulla scatola acrilico).
3. Regolare l'apparecchio embedding per il corretto orientamento (gamba sinistrao gamba destra; ad esempio, 15 ° o 30 ° di rotazione interna).
4. Collocare contenitore potting in base incorporamento fixture, posto osso nel contenitore isolante (Figura 3B) e allineare il collo con puntatore in fixture (Figura 3C) per regolare l'angolo di rotazione interna dell'osso al valore desiderato.
5. Misurare 60 g di PMMA in polvere e mescolare con 30 g di resina liquida sotto cappa d'aspirazione fino a quando la polvere si è sciolta. La miscela deve essere versabile. Utilizzare un bicchiere di carta usa e getta per questo processo.
6. Versare il composto in un contenitore di impregnazione con l'osso sotto una cappa aspirante (Figura 3D), permettono di curare per circa 10 - 15 minuti fino a quando PMMA è chiaro e duro. Questo dovrebbe riempire solo ~ 1/2 del contenitore invasatura con PMMA. Spostare con attenzione l'osso in asciugamani saline saturi per prevenire la secchezza dei tessuti a causa di generazione di calore durante la polimerizzazione PMMA (Figura 3E).
7. Controllare periodicamente il femore per assicurarsi che rimane allineato alcontenitore durante la polimerizzazione.
8. Rimuovere femore da apparecchio invasatura e avvolgere con una soluzione salina imbevuto tovagliolo di carta (Figura 3E).
9. Preparare 90 g di PMMA sotto una cappa aspirante come spiegato al punto 3.5 e riempire completamente il contenitore invasatura. Curare il PMMA per circa 10 - 15 minuti finché non diventa dura.
10. Dopo la resina è indurita, strettamente avvolgere / Avvolgere ossea nelle saline imbevuto asciugamani di carta, coprire con i campioni borsa e conservare in plastica a -20 ° C in freezer.

4. Imaging l'osso con raggi X

(ATTENZIONE! Operare con la cura adeguata per le radiazioni dei raggi X durante l'utilizzo della macchina)

1. Se si utilizza pellicole per raggi X, ruotare sviluppatore X-ray su almeno 20 min (per fabbricante istruzioni) prima della scansione ruotando la manopola in senso orario (nella camera sviluppatore).
2. Assicurarsi che non vi è pellicola non esposta nella cassetta prima radiografia; cassetta deve essere aperta solo in una stanza buia.
3. Accendere la macchina asbloccare ed estendere la testa della macchina.
4. Collocare un carrello sotto il percorso del fascio e posizionare una cassetta sul carrello sotto la trave (Figura 4A).
5. Posizionare e posizionare il femore sulla cassetta (Figura 4B); due orientamenti saranno catturati: vista mediale-laterale e vista anteriore-posteriore. Etichettare le immagini dei campioni di conseguenza.
6. Dopo la prima esposizione, scambiare le posizioni di piombo e delle ossa.
7. Ricoprire la parte già esposto con piombo e esporre l'osso nel secondo orientamento sul lato non esposto. Questo consente all'utente di utilizzare una pellicola a raggi X per un singolo osso in due orientamenti (Figura 4C-D).
8. Cambiare la cassetta e ruotare ciascun femore nella seconda dell'orientamento.
9. Nel caso di un singolo femore, coprire la metà della cassetta con una copertura di piombo per evitare l'esposizione iniziale dell'intero film a raggi-X.
10. Spostare dietro il muro portatili di piombo rivestito per la protezione personale e utilizzare il grilletto per esporrele ossa.
11. Al termine, ritorno testa a raggi X per bloccare e la posizione negozio, girare la chiave su OFF macchina a raggi X e rimuovere esposto pellicola a raggi X.
12. Sviluppare il film per ottenere immagini a raggi X (Figura 4E) utilizzando uno sviluppatore pellicola regolare. Accendere la luce bianca nella stanza e individuare lo sviluppatore film. Accendere la luce rossa e spegnere la luce bianca prima di aprire la cassetta e procedere con il processo di pellicola in via di sviluppo. Aprire la cassetta e mettere il film attraverso lo sviluppatore. Accendere la luce bianca e spegnere la luce rossa una volta che è stato sviluppato il film.

5. CT scansione delle Ossa

1. Rimuovere le ossa dal freezer circa 24 ore prima della scansione. Le ossa devono essere completamente scongelati prima della scansione.
2. Assicurarsi che le ossa sono avvolti in sacchetti di plastica per la scansione per ridurre al minimo clean-up alla fine.
3. Posizionare e fissare il femore e il corpo di calibrazione nel dispositivo TC (Figura 5A-B). il fixture tiene il corpo di calibrazione (Figura 5C) e vale anche il femore in un orientamento (Figura 5D-E) identica con l'orientamento desiderato per la successiva prove meccaniche. Questa registrazione trasversale è necessario per utilizzare i dati di scansione CT (Figura 5F) nel processo di modellazione QCT / FEA (descritto in un protocollo diverso).
   NOTA: Il dispositivo è stato progettato in modo tale che esso espone il femore per la scansione TC senza ostruire il femore prossimale (testa del femore, del collo, grande trocantere, e l'albero prossimale).
4. Assicurarsi che il dispositivo con il femore nello scanner CT sia correttamente allineata con il laser del sistema come guide (Figura 5D-E). Controllare nuovamente l'allineamento del dispositivo con la lunga laser asse CT (premendo il laser pulsante on / off). Il fantasma non ha bisogno di essere allineato con il laser in quanto è fissato nel dispositivo. Zero la posizione tavolo dal pannello di controllo della macchina premendo il butto a zeron (→ 0 ←) sul pannello di controllo.
5. A seguito di una procedura operativa standard CT, far funzionare la macchina CT a 120 kVp, 216 mAs, 1 s tempo di rotazione, e il passo del 1 utilizzando la modalità alta risoluzione ultra (Zuhr). Questo dà un spessore di strato di 0,4 mm, e una dimensione di pixel di 0,30 - 0,45 millimetri a seconda delle dimensioni del campo di vista (FOV).
6. Vedi CT-scan dei dati prima di prove meccaniche al fine di garantire che le immagini di interesse vengono catturati e salvati. Ricongelare l'osso a -20 ° C fino al giorno dell'esperimento.

Risultati

I femori da cadavere sono stati spediti congelati e mantenuti a -20 ° C fino a quando la preparazione è iniziata. Scansione BMD è stata effettuata utilizzando uno scanner DXA per misurare totale dell'anca e del collo BMD, così come T-score per ogni campione (Figura 1). Un T-score è il numero di deviazioni standard della BMD misurata rispetto ai valori medi per i soggetti giovani sani. Essa può variare da -2.5 o inferiore per le ossa osteoporotiche, tra -1 e -2.5 per ossa...

Discussione

Abbiamo presentato un robusto protocollo di preparazione dell'osso per garantire la sperimentazione e QCT / FEA meccanica modellazione di forza del femore in una caduta laterale della configurazione dell'anca. Questo metodo è diventato il nostro protocollo standard in-house. Nel corso di 6 anni, con personale che variano, a circa 200 femori sono stati preparati con successo seguendo questo protocollo. I risultati del protocollo include classificazione condizioni ossea con DXA, escludendo le malattie metastatiche...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Contenitore di incapsulamento CT e dispositivo di scansione	Prodotto internamente	N/A Scanner	progettato e prodotto su misura
Scanner Siemens		Somatom Definition (Siemens, Malvern, PA)	Apparecchiature di scansione CT
CT Quantitativo Phantom	Midways Inc, San Francisco, CA	Calibrazione CT modello 3 Phantom Utilizzato	per ottenere i valori BMD dalle unità Hounsfield nell'immagine CT
Scanner per assorbimetria a raggi X a doppia energia	General Electric	N/A	GE Scanner iDXA lunare per la salute delle ossa o qualsiasi scanner BMD simile
Resina orhodontica igienica (PMMA)	Patterson Dental Supply	H02252	Sostanza controllata e può essere acquistata con l'approvazione appropriata
Congelatore	Kenmore	N/A	Questo è un -20 ° C stoccaggio per ossa
scanner a raggi X	General Electric	46-270615P1	Apparecchiatura di imaging a raggi X.
Pellicole a raggi X	Kodak	N/A	Utilizzato per visualizzare immagini a raggi
X Sviluppatore a raggi X	Kodak X-Omatic	M35A X-OMAT	Utilizzato per lo sviluppo di immagini a raggi X
Cassetta a raggi X	Kodak X-Omatic	N/A	Utilizzato per contenere pellicole a raggi X
Sacchi di riso da 5 libbre	Grande valore	N/A	Utilizzato per imitare i tessuti molli durante il processo di scansione DXA
Soluzione fisiologica salina (0,9% di cloruro di sodio)	Baxter	NDC 0338-0048-04	Utilizzato per mantenere idratati i campioni
Bisturi e raschietti	Bard-Parker	N/A	Utilizzato per pulire l'osso dai tessuti molli
Fresa per colata	Stryker	810-BD001	Utilizzato per tagliare l'albero femorale
Trapano	Bosch	N/A	Utilizzato per forare l'albero femorale
Cappa aspirante	Hamilton	70532	Utilizzato per la ventilazione quando si utilizza la produzione di PMMA

CT