Stabilire sistemi di coltura per l'espansione delle cellule staminali neurali adulte (aNSC) consente l'esame e l'applicazione di aNSC per la terapia. La zona sottocallosa (SCZ) è stata recentemente riconosciuta come una nuova regione che forma neuroblasti nei topi adulti. Qui vengono descritti i metodi per l'isolamento, l'espansione e la differenziazione delle SCZ-aNSC.
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Articolo metodologico
Isolamento e la coltura di adulti neurali cellule staminali dal Subcallosal Zona mouse
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule staminali neurali adulte (aNSC) possono essere utilizzate per la rigenerazione del tessuto cerebrale danneggiato. Le NSC hanno il potenziale per la differenziazione e la proliferazione in tre tipi di cellule: neuroni, astrociti e oligodendrociti. L'identificazione delle regioni derivate da aNSC e la caratterizzazione delle proprietà delle aNSC sono fondamentali per il potenziale utilizzo delle aNSC e per chiarire il loro ruolo nella rigenerazione neurale. Recentemente è stato riportato che la zona sottocallosa (SCZ), situata tra la sostanza bianca e l'ippocampo, contiene aNSC e dà continuamente origine a neuroblasti. Una bassa percentuale di aNSCs provenienti dalla SCZ si differenzia in neuroni; La maggior parte delle cellule sono differenziate in cellule gliali, come gli oligodendrociti e gli astrociti. Si suggerisce che queste cellule abbiano un potenziale terapeutico per la lesione corticale traumatica. Questo protocollo descrive in dettaglio il processo per generare SCZ-aNSC da un cervello di topo adulto. Una matrice cerebrale con intervalli di 1 mm viene utilizzata per ottenere le fette coronali contenenti SCZ e per sezionare con precisione la SCZ dall'intero cervello. Le sezioni SCZ sono inizialmente sottoposte a una coltura della neurosfera. Un sistema di coltura ben sviluppato consente la verifica delle loro caratteristiche e può aumentare la ricerca sulle NSC. Un sistema di coltura della neurosfera fornisce uno strumento utile per determinare la proliferazione e raccogliere le NSC autentiche. Una coltura monostrato è anche un sistema in vitro per saggiare la proliferazione e la differenziazione. Significativamente, questo sistema di coltura fornisce un ambiente più omogeneo per le NSC rispetto al sistema di coltura della neurosfera. Pertanto, utilizzando una regione discreta del cervello, questi sistemi di coltura saranno utili per ampliare le nostre conoscenze sulle aNSC e le loro applicazioni per usi terapeutici.
Introduzione
NSC hanno caratteristiche di auto-rinnovamento e differenziazione di più lignaggi. Per confermare queste proprietà, è stato ampiamente utilizzato un sistema di coltura della neurosfera. Il sistema di coltura della neurosfera è stato sviluppato nei primi anni '90 ed è servito come sistema di coltura di cellule staminali standard1. A seconda della potenza di auto-rinnovamento, le NSC proliferano continuamente e generano una massa cellulare in una coltura in sospensione. Si ritiene che il numero di cellule e le dimensioni della neurosfera siano strettamente associati alle proprietà di proliferazione delle NSC. Le colture monostrato sono anche ampiamente utiliz....
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Protocollo
1. Preparazione dei Materiali e terreno di coltura
- Per la dissezione e la dissociazione del SCZ, avvolgere la matrice del cervello, lama a doppio taglio di rasoio, e pinze con un foglio di alluminio, e poi sterilizzare in autoclave.
- Preparare 50 ml di tampone PBS freddo per lavare l'intero cervello di topo.
- Impostare un microscopio dissezione e preparare gli strumenti chirurgici necessari per la dissezione del cervello (forbici e pinze in autoclave) e l'isolamento del (ml siringa da 1, 30 ago G, matrice del cervello, e una pinza sottile) SCZ.
- Preparazione di N2 Media:
- Preparare F-12 / DMEM (+ L-Glutamin, + bic....
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Risultati
Definizione del sistema di coltura per aNSCs dalla regione neurogena ignoto è essenziale per la comprensione di queste cellule e di sviluppare il loro potenziale utilizzo nella riparazione del cervello 12. È noto che le NSC a diversi stadi di sviluppo o in regioni diverse si comportano in modo diverso 3,4. Recentemente, è stato riportato che le cellule SCZ derivate presentano potenziali differenziali di differenziazione neuronale in vivo e in vitro.......
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Discussione
Questo documento descrive un protocollo dettagliato per generare NSCs dal SCZ topo adulto e mantenerli per varie applicazioni. Ci sono tre passi fondamentali per determinare lo vitro sistema di cultura necessaria per purificare ed espandere SCZ-NSC. In primo luogo, è importante assicurare che la regione SCZ è proprio sezionato da altri potenziali regioni neurogena (Figura 1B). Sezioni spesse e precisi contenenti le regioni SCZ sono stati ottenuti con una matrice cerebrale intervallo di.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Programma di Ricerca sul Cervello attraverso la National Research Foundation (NRF), finanziato dal Ministero coreano della Scienza, delle TIC e della Pianificazione Futura (Sovvenzioni NRF-2015M3C7A1028790); e da una sovvenzione del Korea Health Technology R&D Project attraverso il Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finanziato dal Ministero della Salute e del Welfare, Repubblica di Corea (HI14C3347).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Componenti medi | |||
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033+ | L-glutammina, +Bicarbonato di sodio |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| Integratore N2 | Gibco | 17502-048 | |
| Integratore B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Fattore di crescita | |||
| bFGF | R& D | 233-FB | |
| EGF | Gibco | PHG0313 | |
| Buffer | |||
| PBS (10x) | BIOSOLUTION | BP007a | 1x diluizione |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | |
| Dissociattion buffer | |||
| Dispase II | Roche | 04-942-078-001 | |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| Accutase | ICT | AT-104 | |
| Tool | |||
| Fine pincipe | WPI | 555229F | |
| Forbici | Storz | E3321-C | |
| Matrice cerebrale (1 mm) | RWD | 68707 | |
| Rasoio a doppio taglio | DORCO | ST-300 | |
| Ago da 30 G | SUNGSHIM | N1300 | |
| Materiali | |||
| Tubi da 15 ml | SPL | 50015 | |
| Tubi da 50 ml | SPL | 50050 | |
| Piastra da 35 mm | SPL | 10035 | Piastra Petri |
| Piastra da 100 mm | SPL | 10090 | Piastra di Petri |
| Vetrino di copertura (18 mm) | Deckglaser | 111580 | |
| Piastra a 12 pozzetti | SPL | 32012 | non rivestimento |
| Piastra a 6 pozzetti | SPL | 32006 | non |
| < rivestimentoforte>Materiali di rivestimento | |||
| PLO | Sigma | P4957 | 0,01% |
| Laminin | Gibco | 23017-015 | 10 mg/ml |
| Anticorpi primari | |||
| Nestin | Millipore | MAB353 | topo (1:1.000) |
| EGFR | Abcam | ab2430 | coniglio (1:1.000) |
| DCX | Santa Cruz | SC8066 | capra (1:500) |
| Tuj1 | Sigma | T2200 | coniglio (1:2.000) |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | ratto (1:1.000) |
| O4 | Millipore | MAB345 | mouse (1:500) |
| BrdU | Abcam | ab6326 | Rat (1:500) |
| Secondary antibodies | |||
| anti-mouse 488 | Invitrogen | A21202 | 1:500 |
| anti-mouse cy3 | Jackson | 715-165-151 | |
| anti-mouse 647 | Jackson | 715-606-150 | |
| anti-coniglio 488 | Alexa | A21206 | |
| anti-coniglio cy3 | Jackson | 711-165-152 | |
| anti-coniglio 647 | Jackson | 711-605-152 | |
| anti-capra 488 | Alexa | A11055 | |
| anti-capra cy3 | Jackson | 705-165-147 | |
| anti-capra 647 | Invitrogen | A21447 | |
| anti-ratto 488 | Invitrogen | A21208 | |
| anti-ratto cy3 | Jackson | 712-166-150 | |
| anti-ratto 647 | Jackson | 712-605-153 | |
| Materiali immunocoloranti | |||
| BSA | Millipore | 82-100-6 | 3% BSA con 0,1% Triton X-100 in PBS |
| Triton X-100 | usb | 22686 | |
| 4% PFA | Biosesang | P2031 | |
| Hoechest33342 | Life Technology | H3570 | Colorante per la colorazione dei nuclei |
Riferimenti
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Developmental biology. 175, 1-3 (1996).
- Babu, H., Cheung, G., Kettenmann, H., Palmer, T. D., Kempermann, G.
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Ristampe e permessi
