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Articolo metodologico

Utilizzando impalcatura liposomi per ricostituire interazioni proteina-proteina lipidi-prossimale In Vitro

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DOI:

10.3791/54971

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11 gennaio 2017

 , 
1Department of Pharmacology, Center for Mitochondrial Diseases, The Cleveland Center for Membrane and Structural Biology, Case Western Reserve University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

Questo articolo descrive un metodo per valutare le interazioni e gli assemblaggi di proteine integrali di membrana in vitro con vari fattori partner in un ambiente lipidico-prossimale.

Abstract

Studi di proteine integrali di membrana in vitro sono spesso complicata dalla presenza di un dominio transmembrana idrofobico. A complicare ulteriormente questi studi, reintegrazione delle proteine ​​di membrana detergente-solubilizzato in liposomi è un processo stocastico in cui topologia di proteine ​​è impossibile da far rispettare. Questo articolo offre un metodo alternativo per queste tecniche impegnative che utilizza un ponteggio a base di liposomi. Protein solubilità è esaltata dalla delezione del dominio transmembrana, e questi amminoacidi sono sostituiti con un residuo tethering, ad esempio un His-tag. Questo tether interagisce con un gruppo di ancoraggio (Ni 2+ coordinato da acido nitrilotriacetico (NTA (Ni 2+)) per His-tag proteine), che impone una topologia proteine uniforme sulla superficie del liposoma. Un esempio è presentato in cui l'interazione tra proteine ​​Dynamin legati 1 (DRP1) con una proteina integrale di membrana, mitocondriale fissione Factor (QFP), era investigated utilizzando questo metodo impalcatura liposomi. In questo lavoro, abbiamo dimostrato la capacità di QFP di reclutare in modo efficiente DRP1 solubile alla superficie dei liposomi, che ha stimolato la sua attività GTPasi. Inoltre, DRP1 era in grado di tubulate il modello di lipidi MFF-decorato in presenza di lipidi specifici. Questo esempio dimostra l'efficacia di liposomi impalcature utilizzando saggi strutturali e funzionali e mette in evidenza il ruolo del QFP nella regolazione dell'attività DRP1.

Introduzione

Studiare le interazioni proteina-proteina di membrana-prossimale è uno sforzo impegnativo a causa della difficoltà di ricapitolare l'ambiente nativo delle proteine integrali di membrana coinvolte 1. Ciò è dovuto alla necessità di detersivo solubilizzazione e l'orientamento incoerente delle proteine ​​in proteoliposomi. Per evitare questi problemi, abbiamo utilizzato una strategia quale i domini solubili di proteine integrali di membrana sono espressi come proteine di fusione His-tag, e questi frammenti solubili sono ancorati liposomi ponteggio tramite interazioni con NTA (Ni 2+) headgroups al lipide superficie. L'utilizzo di questi ponteggi, interazioni proteina-lipidi prossimale possono essere indagati in un intervallo di lipidi e proteine ​​composizioni.

Abbiamo effettivamente applicato questo metodo per studiare le interazioni critiche proteina-proteina che regolano il montaggio del complesso fissione mitocondriale ed esaminare le interazioni lipidi che modulano questo process 2. Durante la fissione mitocondriale, una conservata proteina rimodellamento della membrana, chiamata Dynamin-related protein 1 (DRP1) 3, viene reclutato per la superficie del mitocondriale esterna della membrana (OMM) in risposta a segnali cellulari che regolano l'omeostasi energetica, segnale apoptotico, e molti altri processi mitocondriali integrali. Questo grande, GTPase citosolica viene reclutato alla superficie dei mitocondri attraverso le interazioni con proteine OMM integrali 4 - 8. Il ruolo di una tale proteina, mitocondriale fissione Factor (QFP), è stato difficile chiarire causa di una debole interazione evidente con DRP1 in vitro. Tuttavia, studi genetici hanno chiaramente dimostrato che QFP è essenziale per il successo 7,8 fissione mitocondriale. Il metodo descritto in questo manoscritto è stato in grado di superare le carenze precedenti introducendo le interazioni lipidi simultanee che promuovono le interazioni DRP1-QFP. Nel complesso, questo nuovo metodo di analisi REVEAportato interazioni fondamentali che guidano il montaggio del complesso fissione mitocondriale e ha fornito una nuova fase per gli studi strutturali e funzionali in corso di questa macchina molecolare essenziale.

Fino ad oggi, l'esame delle interazioni tra DRP1 e QFP sono state complicate dalla flessibilità intrinseca del QFP 9, l'eterogeneità dei polimeri DRP1 2,10, e la difficoltà di purificazione e di ricostituzione full-length QFP con un dominio transmembrana intatto 11. Abbiamo affrontato queste sfide utilizzando liposomi NTA (Ni 2+) ponteggio per ricostituire His-tag QFP manca il suo dominio transmembrana (MffΔTM-His 6). Questa strategia è stata vantaggioso perché MffΔTM era estremamente solubile quando sovra-espresso in E. coli, e questa proteina isolata è stato facilmente ricostituiti in liposomi patibolo. Quando legato a questi modelli di lipidi, MFF ha assunto un identico, rivolto verso l'esterno orientamento sulla superficie della membrana.Oltre a questi vantaggi, lipidi mitocondriali, come cardiolipina, sono stati aggiunti per stabilizzare QFP piegatura e di associazione con la membrana 11. Cardiolipin interagisce anche con il dominio variabile della DRP1 2,12 che può stabilizzare questa regione disordinato e facilitare il montaggio della macchina fissione.

Questo metodo robusto è ampiamente applicabile per gli studi futuri che cercano di valutare le interazioni delle proteine ​​di membrana-prossimale. Attraverso l'uso di ulteriori interazioni tethering / affinità, la sofisticazione di questi studi ricostituzione membrana può essere migliorato per imitare ulteriori complessità trovato alla superficie delle membrane all'interno delle cellule. Allo stesso tempo, composizioni lipidiche possono essere modificati per imitare più accuratamente gli ambienti nativi di questi complessi macromolecolari. In sintesi, questo metodo fornisce un mezzo per esaminare i relativi contributi di proteine ​​e lipidi nel plasmare morfologie membrana a durante proc cellulare criticaesses.

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Protocollo

1. Ponteggio liposomi Preparazione

NOTA: Idealmente, esperimenti iniziali dovrebbe usare un'impalcatura relativamente semplice e informe (composto da DOPC (1,2-dioleoyl- SN -glycero-3-phosphocholine o PC) e DGS-NTA (Ni 2+) (1,2-dioleoyl - sn -glycero-3 - [(N - (5-ammino-1-carbossipentil) acido imminodiacetico) succinil]. (nickel sale)) Edificio fuori di questi esperimenti, carica lipidi, flessibilità e curvatura può essere introdotto come singoli fattori con il potenziale per alterare le interazioni membrana-prossimale. Queste modifiche possono essere realizzati aggiungendo quantità definite di specifici componenti lipidici, inclusi fosfatidilserina o cardiolipina (CL), fosfatidiletanolammina (DOPE o PE), o galactosyl ceramide (β).

  1. Combinare lipidi disciolti in cloroformio in una provetta di vetro pulito. Evaporare il solvente con azoto secco, mentre la rotazione del tubo per formare un sottile film lipidico. Rimuovere solvente residuo con una centrifugal evaporatore per 1 ora a 37 ° C.
    NOTA: Varie formulazioni di liposomi vengono utilizzati nei protocolli di seguito descritto: liposomi ponteggi (3,3 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 96,7 mol% DOPC), liposomi ponteggi con cardiolipina (3,3 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 10 mol% cardiolipina / 86,7 mol% DOPC), liposomi ponteggio flessibili con cardiolipina (3.3 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 10% mol cardiolipina / 35 mol% DOPE / 51,7 mol% DOPC), e impalcatura arricchito liposomi (10 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 15% mol cardiolipina / 35 mol% DOPE / 40 mol% DOPC).
  2. Aggiungere tampone A (25 mM HEPES (4- (2-idrossietil) -1-acido piperazineethanesulfonic), 150 mM KCl, pH regolato a 7,5 con KOH) preriscaldato a 37 ° C in modo che la concentrazione di lipidi finale 1 - 2 mM. Incubare 30 minuti a 37 ° C con vortex occasionale per risospendere completamente la miscela lipidica (Figura 1a).
  3. Trasferire in una provetta di plastica, porre il tubo in azoto liquido fino a completo congelamento (roughly 30 s), e posto in un bagno d'acqua C 37 ° fino a quando completamente scongelati (circa 1 - 2 min). Ripetere per un totale di 4 cicli di gelo-disgelo (Figura 1B).
  4. Preparare un estrusore lipidico immergendo 4 supporti del filtro e un filtro di policarbonato in tampone e assemblare l'estrusore secondo le istruzioni del produttore. Estrudere la soluzione lipidica attraverso il filtro 21 volte. Utilizzare dolce, pressione costante per garantire una distribuzione di dimensione omogenea (Figura 1c).
    NOTA: Per tutti gli esperimenti descritti in questo protocollo, un filtro 1,0 micron in policarbonato è stato utilizzato per l'estrusione. Interazione DRP1 con lipidi anionici può essere osservata con una varietà di diametri di liposomi che variano da 50 nm a 400 nm 12 o superiore 13. Quindi, la dimensione del filtro di 1 micron è stato scelto per essere ideale sia GTPasi attività e per la microscopia elettronica. Se altri diametri di liposomi sono desiderati, preparazione dei giganti vescicole unilamellari 14,15 (GUVs) o piccolo unilamellar vescicole 16 (SUV) può essere utilizzato. Diffusione della luce dinamica può essere utilizzato per valutare l'eterogeneità liposomi dimensioni 13.
  5. Conservare liposomi estrusi a 4 ° C e scartare dopo 3-5 d.

2. L'utilizzo di ponteggi liposomi per la Proteina Analisi Binding

  1. Preparazione del campione
    1. Incubare His-tag MffΔTM (5 micron finale) con liposomi ponteggi (40 mol% PC / 35 mol% PE / 15 mol% CL / 10 mol% DGS-NTA (Ni 2+); 50 um finale) per almeno 15 min a RT in tampone a + BME (25 mM HEPES, 150 mM KCl, 10 mM β-mercaptoetanolo (BME), pH regolato a 7,5 con KOH). Per un controllo QFP-libera, incubare liposomi con il suo tag-proteina di controllo (come la GFP) per legare e scudo esposto NTA (Ni 2+).
      NOTA: MffΔTM è stato espresso e purificato come descritto in un precedente studio 2. GFP è stato purificato in modo analogo, ma il passo di scambio ionico è stato omesso. BME è stato richiesto per questi experiments perché DRP1 è sensibile all'ossidazione, che possono modificare le sue proprietà di attività e di assemblaggio.
    2. Aggiungere DRP1 (2 mM finale) e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
      NOTA: DRP1 è stato espresso e purificato come descritto in un precedente studio 2. Dopo incubazione con DRP1, l'effetto vincolante per deformazione della membrana nucleotide può essere studiata incubando un'altra ora con 2 mM MgCl 2 e sia 1 mM GTP, 1 mM GMP-PCP, o tampone A + BME.
  2. Negativo Stain microscopia elettronica a trasmissione (EM) Analisi
    1. Transfer 5 microlitri di campione ad un foglio di pellicola di laboratorio, e stabilire una griglia Cu / Rh carbonio rivestito sul campione. Incubare la griglia 1 min sul campione, cancellare via il liquido in eccesso su carta da filtro, e trasferire ad un calo del 2% acetato di uranile. Incubare 1 min, tamponare l'eccesso macchia sulla carta da filtro, e trasferire a una casella della griglia. Conservare sotto vuoto O / N per garantire la piena essiccazione.
    2. campioni di immagine utilizzando un microsc elettronico a trasmissioneope a 18.500 - 30,000X ingrandimento per osservare i cambiamenti ultrastrutturali di proteine e di liposomi morfologie 17.
      Nota: le modifiche ultrastrutturali possono essere quantificati utilizzando immagine software di analisi, come ad esempio ImageJ 13 (http://imagej.nih.gov/ij/). decorazione di proteine ​​può essere misurata se confrontato con i modelli di lipidi nudi. Inoltre, i diametri dei segmenti tubolari possono essere misurati dalla porzione più esterna dei complessi 13. Un'analisi più dettagliata può essere effettuata utilizzando crio-microscopia elettronica 17. Questo metodo può essere usato per immagini complessi proteina-lipidi nativi in ​​solvente senza l'uso di coloranti metalli pesanti che rivestono il campione. In questo modo, le caratteristiche strutturali dettagliate non apparenti macchia negativo, inclusi i cambiamenti nella morfologia dei lipidi di fondo, possono essere esaminate e quantificati.

3. L'uso del ponteggio liposomi per enzimatica Assay

Nota: A colorisaggio GTPase metrica 18 è stato utilizzato per misurare la liberazione di fosfato tramite GTP idrolisi. Saggi GTPasi alternativi sono disponibili 19 e possono essere implementati in base alle esigenze.

  1. Incubare His-tag MffΔTM (QFP), Fis1ΔTM (Fis1), o GFP (5 micron finale per tutti) con liposomi ponteggio (150 micron finali) per 15 minuti a temperatura ambiente in tampone A + BME (volume = 30 ml). Aggiungere DRP1 (500 nM finale) e incubare un ulteriore 15 minuti a temperatura ambiente (volume = 80 ml).
    NOTA: Fis1 è stato purificato in modo analogo a MFF 2, ma la fase di cromatografia a scambio ionico è stato omesso. Lo scopo della sua tag-GFP è quello di proteggere il NTA (Ni 2+) headgroups e prevenire le interazioni di carica non specifiche con altre proteine. Se nessun effetto si osserva in assenza di GFP, allora questo controllo può non essere necessaria. Alternativi proteine ​​bloccaggio (di dimensioni paragonabili alla proteina di interesse) possono essere usati pure, ma GFP permette la visualizzazione diretta delle interazioni con scafpiegare liposomi.
  2. Tubi Trasferire un termociclatore impostato a 37 ° C, e avviare le reazioni di aggiunta di GTP e MgCl 2 (1 mM e 2 mM finale, rispettivamente; volume = 120 ml).
  3. A intervalli di tempo desiderati (cioè T = 5, 10, 20, 40, 60 min), trasferire 20 microlitri di reazione nei pozzetti della micropiastra contenente 5 ml di 0,5 M EDTA per chelare Mg 2+ e fermare la reazione.
  4. Preparare una serie di standard di fosfato diluendo KH 2 PO 4 in tampone A + BME per calibrare i risultati. Un utile set di standard è 100, 80, 60, 40, 20, 10, 5 e 0 pM. Aggiungere 20 ml di ciascuno per pozzetti contenenti 5 ml di 0,5 M EDTA.
  5. Aggiungere 150 ml di malachite verde reagente (1 mm di malachite verde carbinolo, 10 mM ammonio molibdato tetraidrato, e 1 N HCl) in ogni pozzetto, e leggere OD 650 5 min dopo l'aggiunta.
    NOTA: GTP è acido labile e si idrolizzano in presenza di reagente verde malachite. Assicurarsi che tha il tempo tra l'aggiunta del reagente di malachite e la lettura è costante per garantire la riproducibilità dei risultati.
  6. Generare una curva standard tracciando OD 650 degli standard in funzione della concentrazione di fosfato. Utilizzare la regressione lineare per determinare la relazione tra OD 650 e la concentrazione di fosfato in un campione.
  7. Utilizzando la regressione lineare, convertire la OD 650 dei campioni di reazione proteina mM fosfato. Determinare la velocità di generazione di fosfato per ciascuna miscela di reazione riportando concentrazione di fosfato in funzione del tempo, e convertire k cat dividendo il tasso dalla concentrazione DRP1 (0,5 mM).
    NOTA: Solo la velocità lineare iniziale dovrebbe essere usato per determinare la velocità di generazione di fosfato, e un minimo di 3 punti di dati deve essere utilizzato. Se la velocità di reazione è sufficientemente rapida che i primi tre punti di dati non sono lineari (cioè la r 2 del fit lineare è inferiore a 0,9) di un segnoNaturalmente tempo ificantly breve con almeno 3 punti di tempo deve essere eseguita.

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Risultati

Mentre l'interazione tra DRP1 e QFP ha dimostrato di essere importante per fissione mitocondriale, questa interazione è stato difficile ricapitolare in vitro. Il nostro obiettivo era quello di emulare meglio l'ambiente cellulare in cui DRP1 e del QFP interagiscono. A tal fine, liposomi contenenti concentrazioni limitanti del NTA (Ni 2+) headgroups sono stati preparati mediante reidratazione un film lipidico come descritto sopra. La soluzione lipidica inizialmente cost...

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Discussione

Questo protocollo offre un metodo per studiare le interazioni proteina-proteina che coinvolgono proteine ​​integrali di membrana. Utilizzando un ponteggio liposoma modulare, investigatori sono in grado di valutare l'attività di una o più proteine ​​in un ambiente lipidico-prossimale. Studi precedenti hanno dimostrato un metodo simile per gli enzimi del recettore della membrana plasmatica 24 - 26. Abbiamo ampliato questo metodo per incorporare cofattori lipidici ed esplorare le intera...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano riconoscere il finanziamento ricevuto dall'American Heart Association (SDG12SDG9130039).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Fosfatidilcolina (DOPC)Avanti Polar Lipids850375
Fosfatidiletanolammina (DOPE)Avanti Polar Lipids850725
DGS-NTA(Ni2+)AvantiPolar Lipids790404
Bovine Heart Cardiolipina (CL)Avanti Polar Lipids840012
CloroformioAcros Organics
Estrusore di liposomiAvanti Lipidi polari610023
Cu/Rh Griglie di colorazione negativeTed Pella79712
Tubo per microfugaBeckman357448
GTPJena BiosciencesNU-1012
GMP-PCPSigma AldrichM3509
Strisce per piastre per microtitolazioneThermo Scientific469949
EDTAAcros Organics40993-0010
Colorante Coomassie blu istantaneoExpedeonISB1L
HEPESFisher ScientificBP310
BMESigma AldrichM6250
KClFisher ScientificP330
KOHFisher ScientificP250
Cloruro di magnesioAcros Organics223211000
4 - 20% SDS-PAGE GelBio Rad456-1096
4x Laemmli Caricamento coloranteBio Rad161-0747
HCLFisher ScientificA144S
Malachite Carbinolo verdeSigmaAldrich 229105
Molibdato di ammonio TetraidratoSigma AldrichA7302
Pellicola da laboratorioParafilmPM-996
Acetato di uranilePolysciences21447
Tecnai T12 100 keV MicroscopioFEI
Optima MAXBeckman
TLA-55 RotoreBeckman
Refrigerato CentriVap ConcentratoreLabconico
Mastercycler Pro ThermocyclerEppendorf
VersaMax Lettore di micropiastreMolecular Devices
268320010

Riferimenti

  1. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  2. Clinton, R. W., Francy, C. A., Ramachandran, R., Qi, X., Mears, J. A. Dynamin-related Protein 1 Oligomerization in Solution Impairs Functional Interactions with Membrane-anchored Mitochondrial Fission Factor. J Biol Chem. 291 (1), 478-492 (2016).
  3. Chan, D. C. Mitochondrial Fusion and Fission in Mammals. Annual Review of Cell and Dev Biol. 22 (1), 79-99 (2006).
  4. Bui, H. T., Shaw, J. M. Dynamin Assembly Strategies and Adaptor Proteins in Mitochondrial Fission. Curr Biol. 23 (19), R891-R899 (2013).
  5. Elgass, K., Pakay, J., Ryan, M. T., Palmer, C. S. Recent advances into the understanding of mitochondrial fission. Biochim Biophys Acta (BBA) - Mol Cell Res. 1833 (1), 150-161 (2013).
  6. Losón, O. C., Song, Z., Chen, H., Chan, D. C. Fis1, Mff, MiD49, and MiD51 mediate Drp1 recruitment in mitochondrial fission. Mol Biol Cell. 24 (5), 659-667 (2013).
  7. Otera, H., Wang, C., et al. Mff is an essential factor for mitochondrial recruitment of Drp1 during mitochondrial fission in mammalian cells. J Cell Biol. 191 (6), 1141-1158 (2010).
  8. Gandre-Babbe, S., van der Bliek, A. M. The Novel Tail-anchored Membrane Protein Mff Controls Mitochondrial and Peroxisomal Fission in Mammalian Cells. Mol Biol Cell. 19 (6), 2402-2412 (2008).
  9. Koirala, S., Guo, Q., et al. Interchangeable adaptors regulate mitochondrial dynamin assembly for membrane scission. Proc Natl Acad Sci. 110 (15), E1342-E1351 (2013).
  10. Macdonald, P. J., Stepanyants, N., et al. A dimeric equilibrium intermediate nucleates Drp1 reassembly on mitochondrial membranes for fission. Mol Biol Cell. 25 (12), 1905-1915 (2014).
  11. Macdonald, P. J., Francy, C. A., et al. Distinct Splice Variants of Dynamin-related Protein 1 Differentially Utilize Mitochondrial Fission Factor as an Effector of Cooperative GTPase Activity. J Biol Chem. 291 (1), 493-507 (2016).
  12. Bustillo-Zabalbeitia, I., Montessuit, S., Raemy, E., Basañez, G., Terrones, O., Martinou, J. -C. Specific Interaction with Cardiolipin Triggers Functional Activation of Dynamin-Related Protein 1. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
  13. Francy, C. A., Alvarez, F. J. D., Zhou, L., Ramachandran, R., Mears, J. A. The Mechanoenzymatic Core of Dynamin-Related Protein 1 Comprises the Minimal Machinery Required for Membrane Constriction. J Biol Chem. 290 (18), 11692-11703 (2015).
  14. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  15. Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid preparation of giant unilamellar vesicles. Proc Natl Acad Sci. 93 (21), 11443-11447 (1996).
  16. Klingler, J., Vargas, C., Fiedler, S., Keller, S. Preparation of ready-to-use small unilamellar phospholipid vesicles by ultrasonication with a beaker resonator. Anal Biochem. 477, 10-12 (2015).
  17. Mears, J. A., Hinshaw, J. E. Chapter 13 Visualization of Dynamins. Methods Cell Biol. 88, 237-256 (2008).
  18. Leonard, M., Doo Song, B., Ramachandran, R., Schmid, S. L. Robust Colorimetric Assays for Dynamin's Basal and Stimulated GTPase Activities. Methods Enzymol. 404, 490-503 (2005).
  19. Ingerman, E., Perkins, E. M., et al. Dnm1 forms spirals that are structurally tailored to fit mitochondria. J Cell Biol. 170 (7), 1021-1027 (2005).
  20. Fröhlich, C., Grabiger, S., et al. Structural insights into oligomerization and mitochondrial remodelling of dynamin 1-like protein. EMBO J. 32 (9), 1280-1292 (2013).
  21. James, D. I., Parone, P. A., Mattenberger, Y., Martinou, J. -C. hFis1, a Novel Component of the Mammalian Mitochondrial Fission Machinery. J Biol Chem. 278 (38), 36373-36379 (2003).
  22. Yoon, Y., Krueger, E. W., Oswald, B. J., McNiven, M. A. The Mitochondrial Protein hFis1 Regulates Mitochondrial Fission in Mammalian Cells through an Interaction with the Dynamin-Like Protein DLP1. Mol Cell Biol. 23 (15), 5409-5420 (2003).
  23. Osellame, L. D., Singh, A. P., et al. Cooperative and independent roles of Drp1 adaptors Mff and MiD49/51 in mitochondrial fission. J Cell Sci. 129 (11), 2170-2181 (2016).
  24. Esposito, E. A., Shrout, A. L., Weis, R. M. Template-Directed Self-Assembly Enhances RTK Catalytic Domain Function. J Biomol Screen. 13 (8), 810-816 (2008).
  25. Shrout, A. L., Esposito, E. A., Weis, R. M. Template-directed Assembly of Signaling Proteins: A Novel Drug Screening and Research Tool. Chem Biol Drug Des. 71 (3), 278-281 (2008).
  26. Celia, H., Wilson-Kubalek, E., Milligan, R. A., Teyton, L. Structure and function of a membrane-bound murine MHC class I molecule. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 96 (10), 5634-5639 (1999).
  27. Li, E., Wimley, W. C., Hristova, K. Transmembrane helix dimerization: Beyond the search for sequence motifs. Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (2), 183-193 (2012).
  28. Zhang, F., Crise, B., Su, B., Hou, Y., Rose, J. K., Bothwell, A., Jacobson, K. Lateral diffusion of membrane-spanning and glycosylphosphatidylinositol- linked proteins: toward establishing rules governing the lateral mobility of membrane proteins. J Cell Biol. 115 (1), 75-84 (1991).
  29. Ramadurai, S., Holt, A., Krasnikov, V., van den Bogaart, G., Killian, J. A., Poolman, B. Lateral diffusion of membrane proteins. J Am Chem Soc. 131 (35), 12650-12656 (2009).
  30. Gambin, Y., Reffay, M., et al. Variation of the lateral mobility of transmembrane peptides with hydrophobic mismatch. J Phys Chem. B. 114 (10), 3559-3566 (2010).
  31. Wilson-Kubalek, E. M., Brown, R. E., Celia, H., Milligan, R. A. Lipid nanotubes as substrates for helical crystallization of macromolecules. Proc Natl Acad Sci. 95 (14), 8040-8045 (1998).

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