Qui, vi presentiamo i protocolli per l'allevamento di un coleottero intermedio di germi, Dermestes maculatus (D. maculatus) in laboratorio. Condividiamo anche protocolli per embrionale e genitori RNAi e metodi per l'analisi dei fenotipi embrionali per studiare la funzione dei geni in questa specie.
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Articolo metodologico
Allevamento e RNA a doppio filamento mediata silenziamento genico nel Hide Beetle, Dermestes maculatus
In questo articolo
Sommario
Abstract
I progressi della genomica hanno sollevato la possibilità di sondare la biodiversità su una scala senza precedenti. Tuttavia, la sequenza da sola non sarà informativa senza strumenti per studiare la funzione genica. Lo sviluppo e la condivisione di protocolli dettagliati per la creazione di nuovi sistemi modello nei laboratori e per gli strumenti per effettuare studi funzionali, è quindi cruciale per sfruttare la potenza della genomica. I coleotteri (coleotteri) sono il più grande clade di insetti e occupano praticamente tutti i tipi di habitat del pianeta. Oltre a fornire modelli ideali per la ricerca di base, gli studi sui coleotteri possono avere un impatto sul controllo dei parassiti in quanto sono spesso parassiti delle famiglie, dell'agricoltura e delle industrie alimentari. Vengono presentati protocolli dettagliati per l'allevamento e il mantenimento delle colonie di laboratorio di D. maculatus e per l'esecuzione dell'interferenza mediata da dsRNA in D. maculatus. Vengono descritte sia le procedure RNAi embrionali che parentali, tra cui l'impostazione dell'apparecchiatura, la preparazione, l'iniezione e il recupero post-iniezione. Vengono inoltre presentati metodi per l'analisi dei fenotipi embrionali, tra cui la vitalità, i difetti di patterning nelle larve schiuse e le preparazioni delle cuticole per le larve non schiuse. Questi saggi, insieme all'ibridazione in situ e all'immunocolorazione per marcatori molecolari, rendono D. maculatus un sistema modello accessibile per la ricerca di base e applicata. Forniscono inoltre informazioni utili per stabilire procedure in altri sistemi modello di insetti emergenti.
Introduzione
Nel 1998, Fuoco e Mello hanno riferito che a doppio filamento di RNA (dsRNA) può indurre inibizione della funzione del gene in Caenorhabditis elegans 1. Questa risposta innescato da dsRNA è stato chiamato interferenza dell'RNA (RNAi), e tale silenziamento genico RNAi-mediata è stato segnalato per essere conservato in animali, piante e funghi 2-7. In piante e alcuni animali, funzioni RNAi sistemica, il che significa che l'effetto può diffondersi ad altre cellule / tessuti dove dsRNA non viene introdotto direttamente (rivisto nel 8-10). Gli scienziati hanno fatto uso di questo endogena risposta RNAi cellulare progettando dsRNAs....
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Protocollo
1. allevamento di D. maculatus
NOTA: Una colonia di allevamento di D. maculatus è stato istituito nel laboratorio degli autori con gli adulti e le larve acquistato per uso commerciale. L'identità di specie è stata verificata utilizzando DNA barcoding 53.
- Per impostare una nuova gabbia in laboratorio, si sviluppa un sottile strato di trucioli di legno in una gabbia di insetti di medie dimensioni (30,5 x 19 x 20.3 cm 3). Posizionare un ~ 10 x 6 x 3 cm 3 pezzo di polistirolo nella gabbia per far nascondere le larve per impupamento. Aggiungere 20 - 50 coleotteri (sia adulti o larve....
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Risultati
Laboratorio degli autori ha utilizzato la tecnologia RNAi per studiare l'evoluzione funzionale dei geni che regolano la segmentazione negli insetti 53,55. Mentre tutti gli insetti sono segmentati, i geni che regolano questo processo sembrano aver discostato durante radiazioni insetti 26,38,56-63. Schermi genetiche in Drosophila hanno identificato una serie di nove geni di segmentazione coppia-di regole che sono responsabili per promuovere la formazione di s.......
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Discussione
Mentre un piccolo numero di sistemi modello sofisticati (topi, mosche, vermi) sono stati sviluppati nel corso del 20 ° secolo, il 21 ° secolo ha visto un'ondata di nuovi sistemi di animali in fase di sviluppo nei laboratori di tutto il mondo. Questi nuovi sistemi consentono agli scienziati di affrontare comparativi, domande evolutive che non può essere sondato utilizzando solo gli 'standard' sistemi modello. Questa distribuzione di nuovi modelli richiede il rapido sviluppo di metodi per.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo i dottori Alison Heffer e Yong Lu per aver creato l'apparato di microiniezione e aver condiviso la loro inestimabile conoscenza ed esperienza con l'RNAi degli insetti. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (da R01GM113230 a L.P.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Dermestes maculatus coleotteri vivi | Il nostro laboratorio o Carolina Biological Supply | #144168 | Il nostro ceppo di laboratorio è stato verificato mediante codice a barre COI; la variazione del ceppo da Carolina non può essere esclusa |
| Cibo umido per gatti | Fancy Feast | Pezzi di carne con salsa. Può acquistare nella maggior parte dei negozi di alimenti per animali e alimentari | |
| Cibo secco per cani | Purina Puppy Chow | Può acquistare nella maggior parte dei negozi di cibo per animali e alimentari | |
| Gabbia per insetti (dimensioni medie, 30,5 x 19 x 20,3 cm) | Exo Terra | PT2260 | Per il mantenimento della colonia. Può utilizzare una gabbia più grande, se necessario |
| Gabbia per insetti (dimensioni mini, 17,8 x 10,2 x 12,7 cm) | Exo Terra | PT2250 | Per la raccolta di embrioni |
| Capsula di Petri | VWR | 89038-968 | |
| Batuffolo di cotone | Fisher | 22-456-883 | |
| Kit di trascrizione Megascript T7 | Fisher | AM1334 | Per 40 reazioni |
| Pompa pneumatica | WPI | PV830 | |
| Supporto capillare | WPI | ||
| Micromanipolatore | NARISHIGE | MN-151 | |
| Carta da filtro nera (90 mm) | VWR | 28342-010 | |
| Colorante alimentare (verde) | McCormick | ||
| Capillare in vetro borosilicato | Hilgenberg | 1406119 | |
| Estrattore per aghi (estrattore per micropipette) | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Vetrino per microscopio | WorldWide Life Sciences Division | 41351157 | |
| Pellicola sigillante (Parafilm M) | Fisher | 13-374-12 | |
| Modello 801 Siringa (10 µ l) | Hamilton | 7642-01 | |
| Ago (calibro 32) | Hamilton | 7762-05 | |
| Soluzione di fissaggio (Pampel's) | BioQuip Products, Inc. | 1184C | Tossico, deve essere maneggiato in cappa aspirante |
| Pinze (DUMONT #5) | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Vetrino coprioggetti (24 x 50 mm, n. 1,5) | Globe Scientific | 1415-15 | |
| Eppendorf Femtotips Puntale per pipetta Microloader | Fisher | E5242956003 | |
| Microscopia da dissezione per iniezione di embrioni | Leica | M420 | |
| Microscopia da dissezione per la visualizzazione fenotipica larvale | Zeiss | SteREO Discover. Microscopia DIC V12 | |
| Zeiss | AXIO Imager. M1 |
Riferimenti
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. Specific interference with gene function by double-stranded RNA in....
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Ristampe e permessi
