La presenza di tossine cianobatteriche nei serbatoi di acqua dolce per il consumo umano è una delle principali preoccupazioni per le autorità di gestione delle acque. Per valutare il rischio di contaminazione dell'acqua, questo articolo descrive un protocollo per la rilevazione sul campo di ceppi cianobatterici in campioni liquidi e solidi utilizzando un chip di microarray di anticorpi.
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Articolo metodologico
Protocollo sperimentale per il rilevamento cianobatteri In campioni liquidi e solidi con un anticorpo Microarray chip
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il riscaldamento globale e l'eutrofizzazione fanno alcuni ecosistemi acquatici si comportano come veri bioreattori che innescano la crescita dei cianobatteri rapida e massiccia; questo ha conseguenze economiche rilevanti sulla salute e. Molti ceppi di cianobatteri sono produttori di tossine, e solo poche cellule sono necessarie per indurre un danno irreparabile per l'ambiente. Pertanto, le autorità d'acqua del corpo e le amministrazioni richiedono sistemi di allarme precoce rapidi ed efficienti che forniscono dati affidabili per supportare le loro decisioni preventivo o curativo. Questo manoscritto riporta un protocollo sperimentale per la rilevazione sul campo di ceppi di cianobatteri produttori di tossine utilizzando un chip microarray anticorpo con 17 anticorpi (Abs) con risoluzione tassonomica (CYANOCHIP). Qui, una fluorescente immunodosaggio a sandwich microarray multiplex (FSMI) per il monitoraggio simultaneo di 17 ceppi di cianobatteri frequente che fiorisce in ecosistemi d'acqua dolce, alcuni dei quali produttori di tossine, è descritto. Un microarray con multiple replicati identici (fino a 24) del CYANOCHIP fu stampata su un unico vetrino per testare contemporaneamente un numero simile di campioni. Campioni liquidi possono essere testati mediante incubazione diretta con gli anticorpi (Abs) o dopo concentrazione cellulare mediante filtrazione attraverso un filtro da 1 a 3 micron. campioni solidi, come sedimenti e rocce macinate, vengono prima omogeneizzati e dispersi da un ultrasonicatore portatile in un tampone di incubazione. Essi vengono filtrati (i 5 - 20 micron) per rimuovere il materiale grossolano, e il filtrato viene incubato con Abs. Immunoreazioni sono rivelati da una incubazione finale con una miscela di 17 Abs fluorescenza etichettati e vengono letti da un rivelatore a fluorescenza portatile. L'intero processo richiede circa 3 ore, la maggior parte corrispondente a due periodi di 1 h di incubazione. L'uscita è un'immagine, in cui punti luminosi corrispondono alla rilevazione positiva di marcatori cianobatteri.
Introduzione
Il rilevamento e il monitoraggio dei microrganismi in complesse comunità microbiche naturali sono fondamentali in molti campi, tra cui la biomedicina, l'ecologia ambientale, e astrobiologia. I cianobatteri sono microrganismi procarioti ben noti per la loro capacità di formare fioriture (eccessiva proliferazione) delle cellule in acqua dolce. Essi sono onnipresenti, e molte specie sono in grado di produrre tossine, che porta non solo ad un potenziale rischio per la salute umana, ma anche ad un impatto ecologico. A questo proposito, è essenziale sviluppare metodi rapidi e sensibili per la diagnosi precoce di cianobatteri e / o loro tossine nel suo....
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Protocollo
1. Preparazione di immunogeni
- Grow ciascun ceppo cianobatteri nel mezzo di coltura corrispondente alle condizioni descritte nella Tabella 1.
NOTA: terreno di coltura e cultura condizioni per ogni ceppo cianobatteri sono elencati nella tabella 1. Tutti i ceppi di cianobatteri, con l'eccezione di K17, appartengono al gruppo di Antonio Quesada da Autonoma University (Madrid, Spagna). L'anticorpo contro Planktothrix rubescens è stata generata da un campione naturale della fioritura monospecifico di questo cianobatterio da Vilasouto serbatoio (nord della Spagna). - Quantificare il numero....
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Risultati
Questo lavoro descrive un test immunologico multiplex per l'identificazione simultanea delle più importanti specie di cianobatteri acqua dolce (Tabella 1) utilizzando il microarray anticorpi CYANOCHIP. Il microarray può essere un formato 3 x 8 microarray stampati su vetrini da microscopio. Ogni microarray è costituito da un insieme di 17 anticorpi stampate in un modello punto triplo, loro corrispondenti anticorpi pre-immuni e BSA come controlli negativi. I microarray inc.......
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Discussione
Qui, un multiplex a fluorescenza immunodosaggio a sandwich con il CYANOCHIP, un microarray 17-anticorpo per il rilevamento e l'identificazione di una vasta gamma di generi cianobatteri, è descritto 22. Questi cianobatteri rappresentano i generi bentonici e planctonici più frequente in habitat d'acqua dolce, alcuni dei quali produttori di tossine che sono. Recentemente, il formato a sandwich immunoassay fluorescente è stato usato per identificare i microrganismi e / o bioanalytes .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dr. Antonio Quesada presso la Universidad Autónoma de Madrid per la fornitura di ceppi di cianobatteri. Questo lavoro è stato finanziato dalla Subdirección General de Proyectos de Investigación dello spagnolo Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO), concede nessuna. AYA2011-24803 e ESP2014-58494-R.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Filtri con diametro dei pori di 0,22 mm | Millipore | GSWP04700 | Per la preparazione di immunogeni |
| Microcentrifuga Eppendorf 5424R | Fisher Scientific | Per la preparazione di immunogeni | |
| Soluzione salina tampone fosfato (PBS) pH 7,4 (10x) | Thermo Fisher Scientific | 70011036 | 50 mM di fosfato di potassio, 150 mM di NaCl, pH 7,4 |
| Processore a ultrasuoni UP50H | Hielscher | Per la preparazione di immunogeni | |
| Adiuvante completo di Freund | Sigma-Aldrich | F5881 | Immunopotenziatore |
| Incompleto adiuvante di Freud | Sigma-Aldrich | F5506 | Per iniezioni di boost |
| Kit di purificazione degli anticorpi della proteina A | Sigma-Aldrich | PURE1A | Per l'isolamento delle IgG |
| Dispositivi di filtraggio centrifugo MWCO< 100 kDa | Millipore | UFC510096-96K | Per l'isolamento di tubi per |
| dialisi IgG, benzoillati | Sigma-Aldrich | D7884-10FT | Per l'isolamento di colonne IgG |
| Illustra Microspin G-50 | GE-HealthCare | GE27-5330-02 | Per l'isolamento del reagente IgG |
| Bradford | Sigma-Aldrich | B6916-500 mL | Per quantificare la concentrazione di anticorpi |
| Kit di dosaggio della proteina MicroBCA. | Thermo Scientific | 23235 | Per quantificare la concentrazione di anticorpi |
| Tampone di array proteico 2x | Whatman (Sigma Aldrich) | S00537 | Tampone di stampa; 30 - 40% glicerolo in 1x PBS con 0,01% Tween 20 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Detergente non ionico |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | Control per la stampa; reagente bloccante |
| Micropiastra a 384 pozzetti | Genetix | X6004 | Per la stampa di anticorpi |
| Array robotizzato per vetrini multipli Arrayer | MicroGrid II TAS di Digilab | Per la stampa di anticorpi | |
| Vetrini in vetro con substrato epossidico | Arrayit corporation | VEPO25C | Supporto solido per la stampa di anticorpi |
| Alexa Fluor-647 Succinimidil-estere | Sonde molecolari | A20006 | Fluorocromo |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Dissolutore fluorocromo |
| Heidolph Titramax agitatore a piattaforma vibrante | Fisher Scientific | Per la marcatura degli anticorpi | |
| Illustra le colonne Microspin G-50 | Sanità | 27-5330-01 | Per la purificazione di anticorpi marcati |
| Sigillo sicuro marroni Provette da 0,5 mL | Sarstedt | 72.704.001 | Per la conservazione di anticorpi marcati |
| Spettrofotometro Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | Per quantificare la concentrazione di anticorpi e l'efficienza di marcatura | |
| 3 µ m pori policarbonato diametro 47 mm | Millipore | TMTP04700 | Per concentrare le cellule |
| 1 M Trizma cloridrato soluzione pH 8 | Sigma-Aldrich | T3038 | Per la preparazione TBSTRR; per bloccare i vetrini |
| Cloruro di sodio | Sigma-Aldrich | S7653 | Per preparazione TBSTRR |
| 20 µ m filtri in nylon | Millipore | NY2004700 | Per la preparazione di estratti ambientali |
| Portafiltri da 10 - 12 mm | Millipore | SX0001300 | Per la preparazione di estratti ambientali Cocktail |
| di inibitori della proteasi | Sigma-Aldrich | P8340 | Per la conservazione ambientale dell'estratto |
| 1 M Trizma cloridrato soluzione pH 9 | Sigma-Aldrich | T2819 | Per bloccare i vetrini |
| Heidolph Duomax 1030 agitatore a piattaforma oscillante | VWR | Per bloccare i vetrini; per processi di incubazione | |
| VWR Galaxy miniarray microcentrifuga | VWR | C1403-VWR | Per asciugare i vetrini |
| Cassetta di ibridazione per microarray multipozzetto | Arrayit corporation | AHC1X24 | Cassetta per 24 saggi per vetrino |
| Scanner per microarray GenePix 4100A | Molecular Devices | Scanner per fluorescenza | |
| GenePix Pro Software | Molecular Devices | Software per l'analisi e la quantificazione delle immagini |
Riferimenti
- Simis, S. G. H., Peters, S. W. M., Gons, H. J. Remote sensing of the cyanobacterial pigment phycocianin in turbid inland water. Limnol. Oceanogr. 50 (1), 237-245 (2005).
- Zamyadi, A., McQuaid, N., Prevost, M., Dorner, S. Monitoring of potentially toxic cyanobacteria using an online multi-probe in drinking water sources. J. Env....
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Ristampe e permessi
Tag
Rilevazione di cianobatterisaggio immunoenzimatico sandwich a fluorescenzaidentificazione di ceppi di cianobatterifiltrazione di campioni liquidiomogeneizzazione di campioni solidiultrasonificatore portatilerilevatore di fluorescenza portatileprotocollo di saggio immunoenzimatico multiplexmonitoraggio ambientale
