Le infezioni causate da ceppi batterici multiresistenti (MDR) sono emerse come una seria minaccia per la salute pubblica, rendendo necessario lo sviluppo di terapie alternative. Presentiamo un protocollo per valutare l'efficacia della terapia antimicrobica con luce blu (aBL) per le infezioni da MDR Acinetobacter baumannii nelle ustioni di topo utilizzando l'imaging a bioluminescenza.
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Articolo metodologico
In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy per la multi-resistente baumannii Acinetobacter Masterizzare Infezioni Utilizzando bioluminescenza Imaging
In questo articolo
Sommario
Abstract
Bruciano le infezioni continuano ad essere una causa importante di morbilità e mortalità. La crescente emergere di (MDR) batteri multiresistenti ha portato alla frequente fallimento dei trattamenti tradizionali antibiotici. terapie alternative sono urgentemente necessari per affrontare i batteri MDR.
Un approccio non antibiotico innovativo, antimicrobico luce blu (ABL), ha dimostrato efficacia contro le infezioni promettente MDR. Il meccanismo di azione di ABL non è ancora ben compreso. È comunemente ipotizzato che naturalmente cromofori fotosensibilizzanti endogeni nei batteri (ad esempio, porfirine esenti da ferro, flavine, etc.) sono eccitati da abl, che a sua volta produce specie reattive dell'ossigeno citotossici (ROS) attraverso un processo fotochimico.
A differenza di un altro approccio antimicrobico a base di luce, antimicrobico terapia fotodinamica (aPDT), la terapia ABL non richiede il coinvolgimento di un photosensitiz esogenaER. Tutto ciò che serve per entrare in vigore è l'irradiazione di luce blu; pertanto, è semplice e poco costoso. I recettori ABL sono i fotosensibilizzatori endogeni cellulari nei batteri, piuttosto che il DNA. Così, ABL è ritenuto essere molto meno genotossico alle cellule ospiti di irradiazione ultravioletta-C (UVC), che provoca direttamente danni al DNA in cellule ospiti.
In questo articolo, vi presentiamo un protocollo per valutare l'efficacia della terapia ABL per MDR Acinetobacter baumannii infezioni in un modello murino di ustioni. Utilizzando un ceppo bioluminescente ingegnerizzato, siamo stati in grado di monitorare in maniera non invasiva il grado di infezione in tempo reale in animali viventi. Questa tecnica è anche un efficace strumento di controllo della distribuzione spaziale delle infezioni negli animali.
Introduzione
Bruciare infezioni, che sono riportati di frequente causa di infortuni termici cutanee, continuano ad essere una causa importante di morbilità e mortalità 1. La gestione delle infezioni ustione è stata ulteriormente compromessa dalla crescente emergere di (MDR) ceppi batterici multiresistenti 2 a causa dell'uso massiccio di antibiotici. Un importante batteri MDR Gram-negativi è Acinetobacter baumannii, che è noto per essere associato con le recenti ferite in battaglia ed è resistente a quasi tutti gli antibiotici disponibili 3. La presenza di biofilm in foci ferito 'stato segnala....
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Protocollo
1. Preparazione di coltura batterica
- Aggiungere 7,5 ml di Brain Heart Infusion (BHI) medium ad un tubo da 50 ml per centrifuga. Seme cellule A. baumannii nel mezzo BHI e poi incubare la coltura A. baumannii in un incubatore orbitale (37 ° C) per 18 ore.
- Centrifugare la coltura delle cellule a 3500 xg per 5 minuti, rimuovere il surnatante e lavare il pellet in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
- Risospendere i batteri pellets in PBS fresco e accuratamente pipetta la sospensione.
- Raccogliere 100 microlitri della sospensione batterica e fare una diluizione 1:10 usando PBS fresco.
- Trasferire l....
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Risultati
Il ceppo A. baumannii che abbiamo usato è un isolato clinico MDR, come riportato in precedenza 12, 17. Il ceppo batterico è stata fatta bioluminescente dalla trasfezione di luxCDABE opera 11. La Figura 1A mostra le successive immagini di luminescenza batteriche da un mouse rappresentante bruciano infettati con 5 x 10 6 A. baumannii ed esposti ad una si.......
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Discussione
ABL è un nuovo metodo per il trattamento delle infezioni. Dal momento che il suo meccanismo d'azione è completamente diversa da quella della chemioterapia, è più di una fisioterapia. L'agente che media l'effetto antimicrobico è blu irradiazione di luce (400-470 nm). Con lo sviluppo di LED blu, abbiamo guadagnato l'accesso a un approccio antimicrobica a base di luce efficace e semplice per le infezioni MDR.
In questo protocollo, abbiamo descritto lo sviluppo di un modello muri.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato in parte dal Center for Integration of Medicine and Innovative Technology (CIMIT) nell'ambito dell'U.S. Army Medical Research Acquisition Activity Cooperative Agreement (CIMIT No. 14-1894 to TD) e dal National Institutes of Health (1R21AI109172 to TD). YW è stato supportato da una borsa di studio ASLMS Student Research Grant (BS. S02.15). Siamo grati a Tayyaba Hasan, PhD presso il Wellman Center, per il suo lavoro di co-mentorship per YW.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| IVIS | PerkinElmer Inc, Waltham, MA | IVIS Lumina Serie III | in vivo imaging |
| Diodo a emissione di luce LED | VieLight Inc, Toronto, Canada | 415 nm | Sorgente luminosa per illuminazione |
| Contatore di potenza/energia | Thorlabs, Inc., Newton, NJ | PM100D | Rilevatore di irraggiamento della luce |
| Mouse | Charles River Laboratories, Wilmington, MA | BALB/c | 7-8 settimane di età, 17-19 g peso |
| Acinetobacter baumannii | Brooke Army Medical Center, Fort Sam Houston, TX | Isolato clinico | Ceppo luminescente ingegnerizzato |
| Siringhe da insulina | Fisher Scientific | 14-826-79 | BD Lo-Dose U-100 Siringhe per insulina iniettabile |
| Cloruro di sodio | Fisher Scientific | 721016 | cloruro di sodio allo 0,9%, |
| 1x soluzione | Fisher Scientific | BP24384 | Un tampone fosfato standard utilizzato in molte procedure biomolecolari |
| Infusione di cuore cerebrale | Fisher Scientific | B11059 | Terreno di coltura batterica |
| Falcon 15 mL Provette da centrifuga coniche | Fisher Scientific | 14-959-70C | Per centrifuga in sospensione batterica |
| Agitatori orbitali incubati da banco | Rete di fornitura di laboratorio, Inc, Atkinson, NH | Incu-Shaker Mini | Per la coltura di batteri |
| Anelli di inoculazione | Fisher Scientific | 22-363-605 | Per spalmare l'inoclum batterico sulla superficie ustionata dei topi |
| Fisher Scientific Punte per pipette Redi-Tip, 1-200 & micro; L | Fisher Scientific | 02-707-502 | Punte per pipette |
| Thermo Scientific Centrifuga Sorvall Legend X1 | Fisher Scientific | 75-004-220 | Per la separazione batterica |
| della sospensione Blocco d'ottone | Small Parts, Inc., Miami, FL | 10 mm per 10 mm | Per la creazione di ustioni nei topi |
| Guanti ad alta temperatura Extreme Dragon PBI/Kevlar | Superior Glove Works Ltd, Cheektowaga, NY | PBI83514 | Guanti resistenti al calore |
| Piatti Greiner | Sigma-Aldrich Co. LLC | P5112-740EA | 35 mm & |
| Piastra riscaldante digitale Corning | Cole-Parmer Instrument Company, LLC | UX-84301-65 | 10" x 10", 220 V CA, per acqua bollente |
| Lettino chirurgico riscaldato ad acqua Mouse/Rat Thin Line | E-Z Systems | EZ-211 | Previene la perdita di calore e l'ipotermia durante l'intervento |
| Unguento veterinario | S& K Pharma, GmbH | Kerato Biciron 5%, | unguento oftalmico Augensalbe per prevenire la secchezza oculare |
Riferimenti
- Gibran, N. S. Summary of the 2012 ABA Burn Quality Consensus conference. J Burn Care Res. 34 (4), 361-385 (2013).
- Sommer, R., Joachim, I., Wagner, S., Titz, A. New approaches to control infections: anti-biofilm strategies against gram-negative bacteria.....
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Ristampe e permessi
