Il disegno sperimentale per Microdissezione laser RNA-Seq: Lezioni da una analisi dello sviluppo di mais Leaf

Sommario

Molti geni importanti per lo sviluppo hanno modelli di espressione specifici per cellule o tessuti. Questo articolo descrive esperimenti LM RNA-seq per identificare i geni che sono espressi in modo differenziale al confine tra la lamina e la guaina della foglia di mais e nei mutanti lg1-R rispetto ai wild-type. Le considerazioni sperimentali qui discusse si applicano alle analisi trascrittomiche di altri fenomeni dello sviluppo.

Abstract

I geni con ruoli importanti nello sviluppo spesso hanno modelli di espressione spazialmente e / o temporalmente limitati. Spesso questi trascritti genici non vengono rilevate o non sono identificati come differenzialmente espressi (DE) in analisi trascrittomica di organi vegetali integrali. Microdissezione laser RNA-Seq (LM RNA-Seq) è un potente strumento per identificare i geni che sono DE in specifici ambiti di sviluppo. Tuttavia, la scelta dei domini cellulari per microdissect e confrontare, e la precisione dei microdissections sono cruciali per il successo degli esperimenti. Qui, due esempi illustrano considerazioni di progettazione per gli esperimenti trascrittomica; un LM analisi RNA-seq per identificare geni che sono de lungo l'asse prossimale-distale foglia di mais, e un secondo esperimento di identificare geni che sono DE in liguleless1-R (lg1-R) mutanti rispetto al wild-type. Gli elementi chiave che hanno contribuito al successo di questi esperimenti sono stati dettagliati istologica e in SItu ibridazione analisi della regione da analizzare, la selezione della foglia primordi a stadi di sviluppo equivalenti, l'uso di punti di riferimento morfologici per selezionare le regioni per microdissezione e microdissezione dei domini misurato con precisione. Questo documento fornisce un protocollo dettagliato per l'analisi dei domini di sviluppo da LM RNA-Seq. I dati qui presentati illustrano come l'area selezionata per microdissezione influenzerà i risultati ottenuti.

Introduzione

La foglia mais è un modello ideale per studiare la formazione di campi di sviluppo durante morfogenesi, in quanto ha un confine netto tra la lama e guaina che è suscettibile di dissezione genetica (Figura 1A). Durante le prime fasi di sviluppo foglia, una banda lineare di celle più piccole, la band preligule (PLB), suddivide il primordio foglia in domini pre-blade e pre-guaina. A ligule frange-like e atri triangolari sviluppano dalla PLB (Figura 1A, C, D). schermi genetici hanno identificato mutazioni che inficiano il confine lama-guaina. Ad esempio, liguleless1 recessivo (LG1) muta....

Protocollo

NOTA: Fix tessuto per l'analisi istologica allo stesso tempo che il tessuto è fissato per LM. Esaminare sezioni colorate per caratteristiche morfologiche che guideranno successivamente LM. Quando si confrontano mutante wild-type, eseguire ibridazione in situ o immunolocalizzazione per definire il dominio in cui viene espresso il gene di interesse (in questo caso lg1).

1. Fissazione dei tessuti e la lavorazione

1. Crescere appartamenti di piantine di mais a due settimane in condizioni standard ^6.
2. Sezionare apici sparare per le sezioni laterali (figura 4).
   ....

Risultati

Utilizzando lo schema di LM delineato nella figura 2, a circa 1,000,000-1,500,000 micron ² di tessuto sono stati raccolti per ogni replica in tutti i-Cell-strati LM (Figura 5), e 200.000 micron ² per replicare per l'epidermide adaxial LM. Circa 2.500.000 micron ² di tessuto è stato raccolto per ogni replica nel LM di wild-type primordi foglia LG1-R e. Due turni di amplificazione RNA lineare ha prodotto microg.......

Discussione

Disegno sperimentale è un fattore critico in esperimenti di RNA-Seq. Considerazioni chiave sono il dominio precisi (s) e fase di sviluppo (s) da analizzare, e quali i confronti saranno fatti. E 'fondamentale pensare in termini di confronto, poiché l'uscita è in genere un elenco di geni che sono de tra due o più condizioni. Come con tutti gli esperimenti, è importante modificare una sola variabile alla volta. Ad esempio, quando si confrontano diversi domini di foglie, foglie della stessa età e stadio di sviluppo,.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Pirocarbonato di dietil	Sigma-Aldrich	159220	Utilizzato per il trattamento con RNasi di soluzioni
Lamette da barba	Microscopia elettronica Sciences	72000
RNasi Zap	Sigma-Aldrich	R2020-250ML	Soluzione di decontaminazione con RNasi
Etanolo assoluto 200 proof	Fisher Scientific	BP28184
Acido acetico, glaciale	Sigma-Aldrich	A6283
Fiale di vetro - 22 ml	VWR	470206-384
Xileni, grado istologico	Sigma-Aldrich	534056-4L
Paraplast plus	Sigma-Aldrich	P3683-1KG
Stampi base monouso, 15 mm x 15 mm x 5 mm	VWR	15154-072
Anelli di inclusione	VWR	15154-303
Pacchetti di gel di silice	Microscopia elettronica	Sciences 71206-01	Essiccante per la conservazione di blocchi di paraffina
Forno	Fisher Scientific	15-103-0503	Il forno deve mantenere una temperatura di 60 gradi C
Stazione di inclusione della paraffina	Leica	EG1160
Microtomo	Leica	RM2235
Scaldavetrini	Microscopia elettronica Sciences	71317-10
Barattoli Coplin Microscopia	elettronica	Sciences 70316-02
Microdissettore laser	Zeiss
KIMWIPES&commercio; Tergicristalli per compiti delicati	Kimberly-Clark Professional	34120	Salviette prive di lanugine per l'assorbimento delle soluzioni in eccesso dai vetrini del microscopio
Vetrino a membrana 1.0 PEN	Zeiss	415190-9041-000	Vetrini per microdissezione laser
Tappo adesivo 200 opaco	Zeiss	415190-9181-000	Provette per microdissezione laser
di isolamento dell'RNA PicoPure	ThermoFisher Scientific	KIT0204

Kit