Un sensore di diffusione angolare della luce fototermica (PT-AS) consente il dosaggio rapido e privo di sostanze chimiche dell'emoglobina di campioni di sangue su scala nanolitrometrica. Qui vengono forniti i dettagli della configurazione PT-AS e un protocollo di misurazione della concentrazione di emoglobina nel sangue. Vengono inoltre presentati risultati rappresentativi per i campioni di sangue anemico.
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Articolo metodologico
Una rapida e chimico-libera emoglobina Assay con Photothermal angolare Light Scattering
In questo articolo
Sommario
Abstract
Photo-termica angolare light scattering (PT-AS) è un metodo ottico innovativo per la misurazione della concentrazione di emoglobina ([Hb]) dei campioni di sangue. Sulla base della risposta fototermico intrinseca delle molecole di emoglobina, il sensore permette ad alta sensibilità, misura privo di sostanze chimiche di [Hb]. [Hb] capacità di rilevazione con un limite di 0,12 g / dl nel range di 0,35 - 17.9 g / dl è stata dimostrata in precedenza. Il metodo può essere facilmente implementato utilizzando dispositivi elettronici economico consumo come un puntatore laser e una webcam. L'uso di un tubo micro-capillare come un contenitore di sangue permette anche il dosaggio dell'emoglobina con un volume di sangue nanolitro scala ed un basso costo di esercizio. Qui, istruzioni dettagliate per le procedure di elaborazione di impostazione PT-AS ottica e di segnale sono presentati. protocolli sperimentali e risultati rappresentativi per i campioni di sangue in condizioni anemici ([Hb] = 5,3, 7,5, e 9,9 g / dl) sono anche previste, e le misurazioni vengono confrontati con quelli froma analizzatore ematologico. La sua semplicità di implementazione e gestione dovrebbe consentire la sua ampia adozione nei laboratori clinici e di risorse limitate.
Introduzione
Un esame del sangue è comunemente eseguita per valutare la salute umana in generale e per rilevare i biomarcatori legati a determinate malattie. Ad esempio, la concentrazione di colesterolo nel sangue serve come criterio per iperlipidemia, che è strettamente correlato a malattie cardiovascolari e pancreatite. Il contenuto di glucosio nel sangue devono essere misurati di frequente, come il livello di glucosio è associata a complicazioni come la chetoacidosi diabetica e la sindrome iperosmolare iperglicemici. gravi malattie come la malaria, il virus dell'immunodeficienza umana e la sindrome da immunodeficienza acquisita sono diagnosticati da esami del sangue, e la quantificazione dei componenti del sangue, tra cui eritrociti, trombociti, leucociti e consente lo screening del pancreas e malattie renali.
L'emoglobina (Hb), una componente fondamentale del sangue, rappresenta circa il 96% degli eritrociti, e trasporta l'ossigeno a organi umani. alterazione significativa della sua concentrazione di massa ([Hb]) può indicare memodifiche tabolic, malattie epatobiliari e neurologiche, cardiovascolari e disturbi endocrinologici 1. [Hb] è quindi regolarmente misurato in esami del sangue. In particolare, i pazienti anemici, pazienti in dialisi, e le donne in gravidanza sono fortemente raccomandati per il monitoraggio [Hb] come un compito di vitale importanza 2.
Sono stati così sviluppati diversi [Hb] metodi di rilevamento. Il metodo emoglobina cianuro, una delle tecniche più comuni per [Hb] quantificazione, impiega cianuro di potassio (KCN) per distruggere il doppio strato lipidico di eritrociti 3. L'emoglobina cianuro prodotto dalla esposizioni chimiche ad alto assorbimento intorno a 540 nm; quindi, [Hb] misurazioni possono essere effettuate tramite analisi colorimetrica. Questo metodo è ampiamente utilizzato per la sua semplicità, ma i prodotti chimici utilizzati (ad esempio, KCN e ossido dimethyllaurylamine) sono tossici per l'uomo e per l'ambiente. Il regime ematocrito misura il rapporto del volume dei globuli rossi rispetto al totale vol sangueume attraverso separazione centrifuga; tuttavia richiede un volume relativamente grande di sangue (50-100 ml) 4. Spettrofotometria metodi di misura [Hb] appunto senza alcun prodotto chimico, ma misure a lunghezze d'onda multiple e un grande volume di sangue sono necessari 5,6. Analogamente, sono stati proposti diversi metodi ottici di misura [Hb] compresi metodi di rilevamento basato su luce-dispersione, ma i loro precisione delle misure dipende fortemente dalla precisione del modello sangue teorico.
Per superare queste limitazioni, sono stati recentemente proposti [Hb] metodi di rilevamento basati sull'effetto fototermico (PT) di Hb 7. Hb, che è composto principalmente da ossidi di ferro, assorbe la luce a 532 nm e converte l'energia luminosa in calore 8-10. Questo aumento di temperatura PT può essere rilevato otticamente misurando una variazione dell'indice di rifrazione (RI) dei campioni di sangue. Yim et al. impiegato spettrale-dominio di coerenza ottica reflectometry per misurare la variazione ottica percorso di lunghezza PT in una camera di sangue contenente 11. Sebbene il metodo consente chemical free e misurazione diretta [Hb], l'uso di uno spettrometro e una disposizione interferometrica possono ostacolare la sua miniaturizzazione. Recentemente abbiamo presentato un metodo di rivelazione [Hb], chiamato sensore foto-termico angolare light scattering (PT-AS), che è più adatto per il dispositivo di miniaturizzazione 12. Il sensore PT-AS sfrutta l'elevata sensibilità RI dell'interferometria retrodiffusione (BSI) per misurare le variazioni nel PT RI di un campione di sangue all'interno di un tubo capillare. BSI sono stati utilizzati per misurare RI di varie soluzioni 13-15 e per monitorare le interazioni biochimiche in soluzione free 16. Il sensore PT-AS impiega disposizione ottica simile come in BSI, ma combina l'installazione di eccitazione fototermico per misurare aumento PT di RI in campioni di sangue. principi di funzionamento del BSI e sensori PT-AS sono descritti in dettaglio altrove 12,15. PT-AS sensore dimostrato alta sensibilità di misura [Hb] in un ampio campo di rilevamento (0,35-17,9 g / dl) ed è in grado di funzionare con volumi di campione di <100 nl. Non è richiesto alcun condizionamento del campione di sangue, e il tempo di misurazione è solo ~ 5 sec. Qui, l'apparato sperimentale e una dettagliata protocollo di misurazione sono descritti. Risultati rappresentativa PT-AS sono forniti utilizzando campioni di sangue di pazienti anemici, ed i risultati vengono confrontati con quelli di un analizzatore ematologico per valutare la precisione del sensore PT-AS.
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Protocollo
Esperimenti con campioni di sangue sono stati eseguiti in conformità con le leggi e le linee guida istituzionali. I campioni sono stati i campioni di sangue residui che erano stati acquisiti ed elaborati in test clinici presso l'istituto.
1. PT-AS Setup ottico
NOTA: Si può utilizzare un tubo vuoto micro-capillare per una configurazione iniziale PT-AS.
- Montare un tubo micro-capillare vuota con diametri interno ed esterno rispettivamente di 200 e 330 micron, e una lunghezza superiore a ~ 5 cm un dispositivo capillare. infissi fibre disponibili in commercio possono essere usati come proiettori tubo.
- Trovare ancorare un puntatore laser 650 nm, cioè, sondare sorgente luminosa, per illuminare il tubo capillare. Il fascio sonda deve essere maggiore del tubo capillare. Posizionare uno schermo (ad esempio, carta bianca) dietro il tubo capillare per osservare un reticolo periodico angolare.
- Per la parte di rilevamento, rimuovere le lenti in una webcam per catturare direttamente il Scattrendo modello. Posizionare la webcam dietro il tubo capillare con un angolo di 25-35 ° rispetto alla direzione del fascio sonda. Assicurarsi che il modello periodica angolare prodotta dal tubo capillare può essere misurata con il rivelatore (Figura 1). Osservare il modello periodica angolare nel mezzo del sensore di immagine quando il sensore è posizionato correttamente.
- Posizionare una sorgente di luce di eccitazione PT 532 nm per illuminare il tubo capillare. Posizionare la sorgente luminosa PT con qualsiasi angolazione, finché la luce di eccitazione PT sovrappone con fascio sonda sul tubo capillare e non raggiunge direttamente il rivelatore. PT eccitazione dei campioni di sangue utilizzando alta potenza ottica tipicamente migliora la PT-AS sensibilità, in quanto porta ad un cambiamento maggiore nella RI.
- Utilizzare la massima potenza ottica della sorgente di luce di eccitazione PT impiegato. Inoltre, assicurarsi che la luce di eccitazione PT si sovrappone alla luce sonda sul tubo capillare. Utilizzare una dimensione del fascio di luce di eccitazione PTalmeno doppia di quella della luce sonda per riscaldare l'intero volume della sonda.
- Collocare un filtro passa lungo davanti al rivelatore per bloccare la luce 532 nm e misurare solo la luce della sonda 650 nm.
- Installare un chopper nel cammino ottico della luce di eccitazione PT prima illuminare il tubo capillare. Il chopper ottico è utilizzato per modulare l'intensità PT eccitazione luminosa.
2. Preparazione del campione di sangue
- Disegnare 6 ml di sangue intero fresco in condizione anemica in tubi di campionamento del sangue acido etilendiamminotetraacetico, e mescolare bene i campioni. Non è richiesta alcuna altra elaborazione.
- Misurare i campioni di sangue utilizzando il sensore PT-AS entro 24 ore di estrazione per prevenire la coagulazione.
3. PT-AS Protocolli di misura
- Caricare un tubo micro-capillare con un campione di sangue per misurare. Riempire il capillare del sangue attraverso l'azione capillare inserendo il tubo nel sangue sampio. Il volume di campione minimo richiesto per la misurazione è determinata dal diametro interno del tubo capillare e la dimensione fascio sonda.
- Impiegare un tubo con un diametro interno di 200 micron. La dimensione fascio sonda era di 2 mm nei risultati rappresentativi, suggerendo che la misurazione può essere eseguita con un volume di campione di> 63 nl.
- Montare il tubo capillare nella posizione indicata nel dispositivo.
- Accendere il laser della sonda 650 nm per illuminare il tubo micro-capillare del sangue-caricato. Il modello periodico angolare deve essere osservato con la webcam.
- Accendere il 532-nm laser PT di eccitazione per illuminare il tubo.
- Eseguire il chopper ottico per modulare l'intensità della luce di eccitazione PT a 2 Hz.
NOTA: Il razionale per la selezione di questa condizione di funzionamento è descritto in discussione e Kim et al. 12.- Montare una ruota chopper nel montaggio testa del motore del chopper otticasistema.
- Selezionare la casella di controllo del chopper, e utilizzare la manopola di comando nella console per impostare la frequenza di modulazione.
- Eseguire l'elicottero con la manopola di controllo.
- Registrare il modello di diffusione fluttuante tramite la webcam per 5 secondi in formato MPEG-4 (mp4).
4. Signal Processing
NOTA: l'elaborazione del segnale PT-AS è stata effettuata utilizzando un codice MATLAB laboratorio sviluppato.
- Caricare il file video per estrarre le immagini. Per ogni immagine [vedere figura 2 (a) per una immagine rappresentativa], ottenere il pattern dispersione media calcolando la media dei valori dei pixel lungo la direzione verticale [Figura 2 (b, c)].
- Valutare la trasformata di Fourier del modello dispersione media, e calcolare la fase alla frequenza spaziale picco. Eseguite le operazioni per tutti i fotogrammi di tutte le immagini registrate.
- Utilizzando i valori di fase ottenuti da tutte le immagini, tracciare la fase temporalefluttuazione [Figura 2 (d)]. Si noti che la fase oscilla alla frequenza di modulazione PT. Prendere la trasformata di Fourier della fluttuazione di fase nel dominio del tempo, e di ottenere l'ampiezza alla frequenza di modulazione. Questo segnale è indicato come PT-AS segnale [figura 2 (e)].
- Misurare la [Hb] di un campione di sangue convertendo il suo segnale PT-AS nella corrispondente [Hb] alla curva di taratura che si ottiene nel protocollo 5.
5. PT-AS Calibrazione
- Preparare campioni di sangue, con [Hb] valori che sono uniformemente distribuiti nel campo di rilevamento del sensore PT-AS (ad esempio 0 - 18 g / dl).
- Prima di calibrazione, quantificare i valori [Hb] dei campioni utilizzando un analizzatore ematologico di riferimento. Misurare i segnali PT-AS dei campioni.
- Ricavare una curva di calibrazione relativa [Hb] al segnale PT-AS eseguendo un lineare minimi quadrati, [Hb] = A [PT-AS segnale] + B, delle experimental risultati. Per le condizioni di esercizio di cui alla tabella 1, il rapporto tra [Hb] e il segnale di PT-AS è risultato essere [Hb] = 5.13 [segnale PT-AS] - 0.09. Usa il codice MATLAB per eseguire la misura lineare.
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Risultati
Un test dell'emoglobina è stata eseguita utilizzando il sensore PT-AS, e le sue misure sono stati confrontati con quelli di un analizzatore ematologico. L'esperimento è stato condotto con una intensità luminosa PT di eccitazione di 1,4 W / cm 2, PT frequenza di modulazione di 2 Hz, e misura del tempo di 5 sec. La tabella 1 riassume le condizioni sperimentali. Le dimensioni del fascio di luce di eccitazione sonda e PT erano 5,5 e 2 mm, rispettivamente. ...
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Discussione
Il sensore PT-AS rappresenta un metodo completamente ottica in grado di misurare direttamente [Hb] di campioni di sangue non trasformati. Il metodo quantifica [Hb] nel sangue utilizzando la risposta PT intrinseca di molecole di emoglobina negli eritrociti. Sotto illuminazione da luce 532 nm, le molecole di Hb assorbono l'energia luminosa e producono calore. L'aumento di temperatura risultante cambia il RI del campione di sangue. L'elevata sensibilità del RI di BSI è stata sfruttata per misurare questo cambia...
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Dichiarazioni
Non viene dichiarato alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata supportata dai programmi di ricerca della National Research Foundation of Korea (NRF) (NRF-2015R1A1A1A05001548 e NRF-2015R1A5A1037668).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Puntatore laser da 650 nm | LASMAC | LED-1 | Luce della sonda |
| Capillari rotondi cavi in vetro | VitroCom | CV2033 | Contenitore per campioni di sangue |
| Webcam | Sensore ottico | CMOS Logitech | C525 |
| Sistema di taglio ottico | Thorlabs | MC2000-EC | Chopper ottico |
| Filtro passa-lungo in plastica | Edmund Optics | #43-942 | Per rifiutare la luce di eccitazione PT a 532 nm |
| Morsetto in fibra | Thorlabs | SM1F1-250 | Dispositivo per tubo capillare |
| Tubo per prelievo di sangue rivestito in EDTA | Greiner Bio-One | VACUETTE 454217 | prelievo di sangue e anticoagulante |
| Siemens AG | ADVIA 2120i | Analizzatore ematologico di riferimento |
Riferimenti
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