Questo protocollo descrive la generazione riproducibile e fenotipizzazione delle cellule T regolatorie indotte umane (iTregs) dalle cellule naïve T CD4 + in vitro. Diversi protocolli per l'induzione FOXP3 permettono lo studio di specifici fenotipi iTreg ottenuti con rispettivi protocolli.
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Articolo metodologico
La differenziazione in vitro di cellule CD4 + umana FOXP3 + indotta da T regolatorie (iTregs) da cellule T CD4 Naïve utilizzando un protocollo TGF-β contenenti
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule T regolatorie (Treg) sono parte integrante della tolleranza periferica, sopprimendo le reazioni immunitarie contro le autostrutture e prevenendo così le malattie autoimmuni. Sono in corso approcci clinici per trasferire adottivamente le Treg, o per esaurire le Treg nel cancro, con primi risultati promettenti.
Poiché il numero di Treg presenti in natura (nTregs) è molto limitato, lo studio di alcune caratteristiche delle Treg utilizzando Treg indotte in vitro (iTregs) può essere vantaggioso. Ad oggi, il miglior marcatore proteico, anche se non assolutamente specifico, per delineare le Treg è il fattore di trascrizione FOXP3. Nonostante l'importanza delle Treg, compresi i ruoli non ridondanti delle Treg indotte perifericamente, i protocolli per generare le iTreg sono attualmente controversi, in particolare per le cellule umane. Questo protocollo descrive quindi la differenziazione in vitro di iTreg CD4+FOXP3+ umani da cellule T naïve umane utilizzando una serie di fattori induttori di Treg (TGF-β più solo IL-2, o la loro combinazione con acido retinoico, rapamicina o butirrato) in parallelo. Descrive anche la fenotipizzazione di queste cellule mediante citometria a flusso e qRT-PCR.
Questi protocolli determinano un'espressione riproducibile di FOXP3 e di altri geni di firma delle Treg e consentono lo studio dei meccanismi generali di regolazione di FOXP3 e degli effetti specifici del protocollo per delineare l'impatto di determinati fattori. Gli iTreg possono essere utilizzati per studiare vari aspetti fenotipici e i meccanismi molecolari dell'induzione delle Treg. Studi molecolari dettagliati sono facilitati da un numero relativamente elevato di cellule che può essere ottenuto.
Una limitazione per l'applicazione degli iTreg è la relativa instabilità dell'espressione di FOXP3 in queste cellule rispetto agli nTreg. Gli iTreg generati da questi protocolli possono essere utilizzati anche per saggi funzionali come lo studio della loro funzione soppressiva, in cui gli iTreg indotti da TGF-β più acido retinoico e rapamicina mostrano un'attività soppressiva superiore. Tuttavia, la capacità soppressiva degli iTreg può differire da quella degli nTreg e l'uso di controlli appropriati è fondamentale.
Introduzione
Cellule T regolatorie CD4 + CD25 + FOXP3 + (Tregs) sopprimere le altre cellule del sistema immunitario e sono mediatori critici di tolleranza periferica, impedendo autoimmunità ed eccessiva infiammazione 1. L'importanza di Tregs è esemplificata dalla malattia umana sindrome immunodysregulation poliendocrinopatia enteropatia legata all'X (IPEX), in cui la perdita di Tregs a causa di mutazioni nel master' Treg fattore di trascrizione forkhead box P3 `(FOXP3) porta ad una grave malattia autoimmune sistemica, letale in tenera età. Tuttavia, Tregs agire come una spada a doppio taglio nel sistema immunitario in quanto possono anche ostacolare l'i....
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Protocollo
cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono stati appena isolati da anonimi donatori sani buffy coats acquistati dal Karolinska University Hospital, in Svezia. permesso di etica per gli esperimenti è stata ottenuta dalla Ethical Review Board regionale a Stoccolma (Regionala etikprövningsnämnden i Stockholm), Svezia (numero di omologazione: 2013 / 1458-1431 / 1).
1. T isolamento delle cellule da sangue periferico
- Isolamento PBMC
- Pre-lay 15 ml media densità centrifugazione (come Ficoll) soluzione in provette da 50 ml (5 tubi per buffy coat). Pre-caldo a temperatura ambiente.
- Riempire buffy coat con tampo....
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Risultati
La figura 1 mostra uno schema del setup sperimentale. La figura 2 mostra una colorazione rappresentante controllo della purezza per le cellule T CD4 + naive magneticamente isolate e nTregs.
F IGURA 3A mostra la citometria a flusso strategia di gating e la Figura 3B mostra FOXP3 rappresentante e CD25 citometria a flusso colorazioni il giorno 6 della .......
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Discussione
Il protocollo descritto consente l'induzione robusto di CD4 umana + FOXP3 + iTregs da cellule T CD4 + naive umane. Esso comprende un nuovo protocollo che abbiamo descritto recentemente, utilizzando una combinazione di TGF-β, ATRA e rapamicina, per l'induzione di iTregs con superior funzione in vitro soppressiva 22. Rispetto ad altri protocolli pubblicati, un altro vantaggio è l'induzione di diverse popolazioni iTreg in parallelo da diversi protocolli, che consente il confronto .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Nina Nagel è grata per l'assistenza tecnica durante le riprese video e la preparazione sperimentale. Ringraziamo Eva-Maria Weiss per l'aiuto con il protocollo di colorazione intracellulare FOXP3 e Elisabeth Suri-Payer e Nina Oberle per aver stabilito il protocollo di isolamento nTreg. Matilda Eriksson e Peri Noori sono riconosciute per la gestione del laboratorio.
Finanziamento: A.S. è stato supportato da una borsa di studio intraeuropea Marie Curie nell'ambito del 7° Programma Quadro della Comunità Europea, dalla Fondazione Dr. Åke Olsson e dalle fondazioni di ricerca KI; A.S. e J.T. sono stati supportati da una sovvenzione CERIC (Center ....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acido retinoico all-trans | Sigma Aldrich | R2625-50MG | |
| clone anit-umano Foxp3-APC 236A/E7 | eBioscience | 17-4777-42 | |
| microsfere CD25 anti-umane | Miltenyi Biotec | 130-092-983 | |
| anti-umano CD25-PE | Miltenyi Biotec | 130-091-024 | |
| anticorpo CD28 anti-umano, LEAF Purified | Biolegend | 302914 | |
| anticorpo CD3 umano, LEAF purificato | Biolegend | 317315 | |
| anti-umano CD45RA, FITC | Miltenyi Biotec | 130-092-247 | |
| anti-umano CD45RO PE clone UCHL1 | BD Biosciences | 555493 | |
| anti-umano CD4-PerCP clone SK3; mIgG1 | BD Biosciences | 345770 | |
| anti-umano CD8-eFluor 450 (clone OKT8), mIgG2a | eBioscience | 48-0086-42 | |
| anti-umano CTLA-4 (CD152), clone BNI3, mIgG2ak, viola brillante 421 | BD Biosciences | 562743 | |
| anti-umano IFN-g FITC clone 4S. B3; mIgG1k | eBioscience | 11-7319-81 | |
| Brefeldin Soluzione contenente A: GolgiPlug | BD Biosciences | 555029 | |
| Kit di sintesi del cDNA: SuperScript VILO (Trascrittasi inversa) Kit di sintesi del cDNA | Invitrogen | 11754-250 | |
| Mezzo di centrifugazione a densità: Ficoll-Paque | GE healthcare | 17-1440-03 | |
| DMSO 99,7% | Sigma Aldrich | D2650-5X5ML | |
| FBS, inattivato a caldo | Invitrogen | 10082-147 | |
| Colorante di vitalità fissabile, eFluor 780 | eBioscience | 65-0865-14 o 65-0865-18 | |
| Set di tamponi per colorazione Foxp3 | eBioscience | 00-5523-00 | Attenzione: contiene paraformaldeide. Può essere acquistato anche in kit combinato con anticorpi; 77-5774-40 Set di colorazione Foxp3 anti-umano Clone APC: 236A/E7 Set |
| GlutaMAX (200 mM L-alanil-L-glutammina) | Invitrogen | 35050-061 | |
| kit di isolamento delle cellule T CD4 naive umane II | Miltenyi Biotec | 130-094-131 | |
| Albumina sierica umana 50 g/L | Baxter | 1501057 | |
| Ionomicina da Streptomyces conglobatus >98% | Sigma Aldrich | I9657-1MG | |
| Colonne MACS LS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| topo IgG1 K Controllo isotipo APC Clone: P3.6.2.8.1 | eBioscience | 17-4714-42 | |
| topo IgG1 K Controllo isotipo FITC 50 μ g | eBioscience | 11-4714-81 | |
| controllo dell'isotipo IgG2a di topo, viola brillante 421, clone MOPC-173 | BD Biosciences | 563464 | |
| pipetta Pasteur in plastica, confezionato singolarmente | Sarstedt | 86.1172.001 | |
| PMA Phorbol 12-miristato 13-acetato | Sigma Aldrich | P1585-1MG | |
| Rapamicina | EMD (Merck) | 553210-100UG | |
| IL-2 umano ricombinante, CF | R& D | 202-IL-050/CF | |
| dell'RNA umano ricombinante TGF-beta 1, CF | RnD | 240-B-010/CF | |
| Kit RNAqueous-Micro | Ambion | AM1931 | |
| RPMI 1640 Medio | Invitrogen | 72400-054 | |
| Butirrato di sodio | Sigma Aldrich | B5887-250MG | |
| Terreno di coltura di cellule T: terreno X-Vivo 15, con gentamicina+fenolo Lonza | 04-418Q | ||
| TaqMan Gene Expression Assay, FOXP3 (Migliore copertura) | Applied Biosystems | 4331182; ID saggio: Hs01085834_m1 | Attenzione: contiene paraformaldeide |
| TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (Migliore copertura) | Applied Biosystems | 4351370; ID test: Hs04194366_g1 | Attenzione: contiene paraformaldeide |
| TaqMan Gene Expression Master mix | Applied Biosystems | 4369514 |
Riferimenti
- Sakaguchi, S. Regulatory T cells: history and perspective. Methods Mol.Biol. 707, 3-17 (2011).
- DeLeeuw, R. J., Kost, S. E., Kakal, J. A., Nelson, B. H. The prognostic value of FoxP3+ tumor-infiltrating lymphocytes in cancer: A critical review of the litera....
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Ristampe e permessi
