Immagini dal vivo per studiare Microtubulo instabilità dinamica nei tumori al seno taxani resistente

Sommario

In questo articolo, riportiamo un protocollo che descrive un metodo in vivo per misurare l'instabilità dinamica dei microtubuli nelle cellule di carcinoma mammario resistenti al docetaxel (MCF-7_TXT). In questo metodo, viene utilizzato un sistema di imaging al microscopio a deconvoluzione per rilevare l'espressione della GFP-tubulina nelle cellule bersaglio.

Abstract

I taxani come il docetaxel appartengono a un gruppo di agenti mirati ai microtubuli (MTA) che sono comunemente utilizzati per trattare il cancro. Tuttavia, la resistenza ai taxani nelle cellule cancerose riduce drasticamente l'efficacia dell'uso a lungo termine dei farmaci. L'evidenza accumulata suggerisce che i meccanismi alla base della resistenza ai taxani includono sia meccanismi generali, come lo sviluppo di resistenza multifarmaco dovuta alla sovraespressione delle proteine di efflusso dei farmaci, sia meccanismi taxano-specifici, come quelli che coinvolgono la dinamica dei microtubuli.

Poiché i taxani prendono di mira i microtubuli cellulari, misurare l'instabilità dinamica dei microtubuli è un passo importante per determinare i meccanismi di resistenza ai taxani e fornisce informazioni su come superare questa resistenza. Nell'esperimento, è stato utilizzato un metodo in vivo per misurare l'instabilità dinamica dei microtubuli. La α-tubulina marcata con GFP è stata espressa e incorporata nei microtubuli nelle cellule MCF-7, consentendo la registrazione della dinamica dei microtubuli mediante time lapse utilizzando una fotocamera sensibile. I risultati hanno mostrato che, a differenza delle cellule_CC MCF-7 parentali non resistenti, la dinamica dei microtubuli delle cellule_TXT MCF-7 resistenti al docetaxel è insensibile al trattamento con docetaxel, che causa la resistenza all'arresto mitotico e all'apoptosi indotti dal docetaxel. Questo articolo illustrerà questo metodo in vivo per misurare l'instabilità dinamica dei microtubuli.

Introduzione

La principale causa di mortalità per cancro al seno è attraverso le metastasi ^{1, 2.} Taxani, come docetaxel e paclitaxel, sono attualmente utilizzati come prima linea di regimi nel trattamento del carcinoma mammario metastatico ^{2, 3, 4, 5, 6.} Fanno parte di un gruppo di agenti microtubuli-targeting (MTA) che interrompono la dinamica dei microtubuli. Tuttavia, una delle più grandi sfide di utilizzare taxani nella terapia curativa è lo sviluppo ....

Protocollo

1. Preparare le cellule per Immagini dal vivo

1. Coltura cellulare e la semina
   1. Utilizzare le cellule MCF-7 di tumore mammario selezionate per la resistenza a docetaxel (MCF-7 _TXT) e la loro linea cellulare dei genitori non resistente (MCF-7 _CC). Il processo di selezione dettagliata e la caratterizzazione di queste linee cellulari selezionate sono state descritte in precedenza ^24.
   2. Grow tutte le cellule in coltura 10 cm a 37 ° C in un mezzo costituito 90% del mezzo di Dulbecco modificato Eagle (DMEM) e il 10% di siero fetale bovino (FBS) e integrati con amminoacidi non essenziali.....

Risultati

Utilizzando il protocollo presentato qui, abbiamo studiato gli effetti del docetaxel sulla dinamica dei microtubuli del normale (MCF-7 _CC) e docetaxel-resistente (MCF-7 _TXT), le cellule del cancro al seno. Due serie di immagini mostrano gli effetti di docetaxel (0,5 mM) sulla crescita microtubuli e accorciamento in MCF-7 _CC e MCF-7 _TXT cellule (Figura 1A).

Abbiamo in.......

Discussione

Ci sono due metodi principali per misurare microtubuli instabilità dinamica: in vitro e in vivo. Nel metodo in vitro, tubulina purificato viene utilizzato per misurare instabilità dinamica dei microtubuli con time-lapse microscopia a interferenza differenziale contrasto informatica avanzata. Nel metodo in vivo, microiniettato tubulina fluorescenti, o espresso GFP-tubulina, è incorporato in microtubuli. La dinamica (crescita e accorciamento) dei microtubuli vengono quindi registrati da.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796
Aminoacidi non essenziali	Life Technologies, Invitrogen	11140-050
FBS	Gibco, Invitrogen	12483
Anti-Anti (100x)	Life Technologies, Invitrogen	15240-062
docetaxel	Sigma-Aldrich	01885-5mg-F
DMEM fenolo senza rosso	Gibco, Invitrogen	21063
Reagente CellLight *BacMam 2.0* GFP-tubulina	ThermoFisher Scientific	C10613	Reagente chiave per l'espressione della tubulina GFP nelle cellule
Reagente CellLight *BacMam 2.0* GFP	ThermoFisher Scientific	B10383	Controllo
Dimetil solfossido (DMSO)	Sigma-Aldrich+B9:AA9	472301	per dissoving decetaxel
22 mm vetro coveslip	Fisher Scientifics	12-545-101
Piastra di coltura a 6 pozzetti	Greiner Bio-One International		coltura Celi a 6 pozzetti
Sistemi di imaging per microscopia DeltaVision GE	Health		Questo sistema è dotato di stazione meteorologica per il controllo della temperatura e della CO2. Dotato inoltre di software Worx per la deconvoluzione e il controllo del time lapse.
Tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenolo		Bright-Line 25200056
, Hausser Scientific	Hausser Scientific, distribuito da VWR	N. fornitore: 1492 N. VWR:15170-172

Piastra di Set di ematocitometri ThermoFisher Scientific