È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Immagini dal vivo per studiare Microtubulo instabilità dinamica nei tumori al seno taxani resistente

7.4K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/55027

⸱

20 febbraio 2017

 ,  , 
1Department of Medical Genetics, Signal Transduction Research Group, Faculty of Medicine and Dentistry, University of Alberta

In questo articolo

Sommario

In questo articolo, riportiamo un protocollo che descrive un metodo in vivo per misurare l'instabilità dinamica dei microtubuli nelle cellule di carcinoma mammario resistenti al docetaxel (MCF-7TXT). In questo metodo, viene utilizzato un sistema di imaging al microscopio a deconvoluzione per rilevare l'espressione della GFP-tubulina nelle cellule bersaglio.

Abstract

I taxani come il docetaxel appartengono a un gruppo di agenti mirati ai microtubuli (MTA) che sono comunemente utilizzati per trattare il cancro. Tuttavia, la resistenza ai taxani nelle cellule cancerose riduce drasticamente l'efficacia dell'uso a lungo termine dei farmaci. L'evidenza accumulata suggerisce che i meccanismi alla base della resistenza ai taxani includono sia meccanismi generali, come lo sviluppo di resistenza multifarmaco dovuta alla sovraespressione delle proteine di efflusso dei farmaci, sia meccanismi taxano-specifici, come quelli che coinvolgono la dinamica dei microtubuli.

Poiché i taxani prendono di mira i microtubuli cellulari, misurare l'instabilità dinamica dei microtubuli è un passo importante per determinare i meccanismi di resistenza ai taxani e fornisce informazioni su come superare questa resistenza. Nell'esperimento, è stato utilizzato un metodo in vivo per misurare l'instabilità dinamica dei microtubuli. La α-tubulina marcata con GFP è stata espressa e incorporata nei microtubuli nelle cellule MCF-7, consentendo la registrazione della dinamica dei microtubuli mediante time lapse utilizzando una fotocamera sensibile. I risultati hanno mostrato che, a differenza delle celluleCC MCF-7 parentali non resistenti, la dinamica dei microtubuli delle celluleTXT MCF-7 resistenti al docetaxel è insensibile al trattamento con docetaxel, che causa la resistenza all'arresto mitotico e all'apoptosi indotti dal docetaxel. Questo articolo illustrerà questo metodo in vivo per misurare l'instabilità dinamica dei microtubuli.

Introduzione

La principale causa di mortalità per cancro al seno è attraverso le metastasi 1, 2. Taxani, come docetaxel e paclitaxel, sono attualmente utilizzati come prima linea di regimi nel trattamento del carcinoma mammario metastatico 2, 3, 4, 5, 6. Fanno parte di un gruppo di agenti microtubuli-targeting (MTA) che interrompono la dinamica dei microtubuli. Tuttavia, una delle più grandi sfide di utilizzare taxani nella terapia curativa è lo sviluppo della resistenza taxani nelle cellule tumorali, che porta alla malattia recidiva 7. La resistenza ai farmaci rappresenta oltre il 90% di tutti i decessi tra i pazienti con carcinoma mammario metastatico 7.

I microtubuli sono formati dalla polimerizzazione di eterodimeri alfa- e beta-tubulinaclass = "xref"> 8, 9. La regolazione precisa della dinamica dei microtubuli è importante per molte funzioni cellulari, tra cui la polarizzazione delle cellule, progressione del ciclo cellulare, trasporto intracellulare, e segnalazione cellulare. Disregolazione dei microtubuli e le loro dinamiche interromperà la funzione delle cellule e causare la morte delle cellule 10, 11. A seconda di come essi causano questa disregolazione, farmaci MTA possono essere classificati come agenti dei microtubuli di stabilizzazione (ad esempio, taxani) o agenti microtubuli destabalizing (cioè, alcaloidi della vinca o colchicina loco agenti leganti) 20. Nonostante i loro effetti opposti sulla massa microtubuli, ad una dose sufficiente, entrambe le classi possono uccidere le cellule tumorali attraverso i loro effetti sulla dinamica dei microtubuli 21.

Taxani funzionano principalmente dalla stabilizzazione del microtubulo del mandrino 12, che porta adisallineamento cromosomica. La successiva attivazione perpetua del punto di controllo di assemblaggio del mandrino (SAC) arresta la cella in mitosi. Mitotico arresto prolungato provoca quindi l'apoptosi 13, 14. Taxano interagisce con microtubuli attraverso il sito di legame taxano on β-tubulina 8, 15, che è presente solo in tubulina assemblato 16.

Meccanismi multipli per resistenza taxani sono stati proposti 9, 17. Questi meccanismi comprendono sia la resistenza ai farmaci in generale a causa della sovraespressione di proteine droga efflusso e specifici taxano resistenza 5, 9, 18, 19. Ad esempio, le cellule tumorali taxani resistenti potrebbero aver alterato espressione e la funzione di alcuni β-tubulin isotipi 5, 9, 19, 20, 21, 22, 23. Utilizzando un metodo in vivo per misurare microtubuli instabilità dinamica, dimostriamo che, rispetto ai non-resistenti, parentali cellule MCF-7 CC 17, la dinamica dei microtubuli di cellule MCF-7 TXT docetaxel-resistenti sono insensibili al trattamento con docetaxel.

Per capire meglio la funzione di MTA e l'esatto meccanismo di taxano-resistenza in cellule cancerose, è essenziale misurare dinamica dei microtubuli. Qui riportiamo un metodo in vivo di farlo. Utilizzando immagini dal vivo, in combinazione con l'espressione di tubulina GFP-tagged nelle cellule, siamo in grado di misurare la dinamica dei microtubuli di MCF-7 TXT e le cellule CC MCF-7 con e wisarie, senza trattamento con docetaxel. I risultati possono aiutarci a progettare farmaci più efficaci che possono superare la resistenza taxano.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

1. Preparare le cellule per Immagini dal vivo

  1. Coltura cellulare e la semina
    1. Utilizzare le cellule MCF-7 di tumore mammario selezionate per la resistenza a docetaxel (MCF-7 TXT) e la loro linea cellulare dei genitori non resistente (MCF-7 CC). Il processo di selezione dettagliata e la caratterizzazione di queste linee cellulari selezionate sono state descritte in precedenza 24.
    2. Grow tutte le cellule in coltura 10 cm a 37 ° C in un mezzo costituito 90% del mezzo di Dulbecco modificato Eagle (DMEM) e il 10% di siero fetale bovino (FBS) e integrati con amminoacidi non essenziali. Mantenere il mezzo in CO 2 atmosphere 5%. Mantenere le cellule MCF-7 TXT a 5 nM docetaxel.
    3. cellule seme su vetrini per l'imaging dal vivo. Sterilizzare 24 mm vetrini poli-L-lisina rivestite risciacquandole con il 70% di alcol e poi esporli ai raggi UV durante la notte. Mettere i coprioggetti in una piastra di coltura 6 pozzetti di 35 mm. Plasso un vetrino in ciascun pozzetto.
    4. Rimuovere il mezzo dal piatto di coltura di 10 cm e lavare le cellule con PBS. Aggiungere 0,5 ml di tripsina-EDTA al piatto per staccare le cellule dal piatto. Aggiungere 5 ml di terreno di coltura al piatto di neutralizzare la tripsina dopo il distacco delle cellule.
    5. Contare le cellule con un emocitometro per determinare il numero di cellule per unità di volume.
    6. Aggiungere circa 10 5 cellule in ciascun pozzetto in base al numero di cellule per unità di volume. Dopo aver agitato delicatamente, mettere la piastra posteriore in incubatrice per permettere alle cellule di allegare alle lamelle.
  2. L'espressione di GFP-tagged α-tubulina
    1. Per saggiare dinamica dei microtubuli, trasdurre le cellule con GFP-tagged α-tubulina con il controllo di trasduzione GFP commerciale (ad esempio, BacMam) secondo il protocollo del produttore.
    2. Cultura le cellule nel pozzo per 36 h in un incubatore a 37 ° C coltura cellulare per consentire comadesione completo e il 60% di confluenza.
    3. Calcolare il volume appropriato di GFP-tagged α-tubulina aggiungere a ciascun pozzetto, secondo la seguente equazione:
      figure-protocol-1
      Il numero di cellule è il numero totale stimato di cellule nel pozzo al momento dell'etichettatura e PPC desiderato è il numero di particelle per cella.
      NOTA: Semina le cellule MCF-7 va raddoppiato il numero di celle da 10 5 2 x 10 5 con un PPC desiderata del 20, il volume necessario per ogni vetrino è quindi di 40 microlitri. Per le cellule differenti, il volume calcolato sulla base della formula di cui sopra non può essere la migliore. Il volume esatto deve essere regolata in base al livello di espressione reale di GFP-tubulina.
    4. Mescolare le alfa-tubulina più volte GFP-etichettato per inversione per garantire una soluzione omogenea. Non farlo vortice.
      NOTA: Per il controllo, la (controllo) reagente Null manca di qualsiasi genetica dei mammiferielementi e possono essere usati per aiutare a determinare i potenziali effetti baculovirus-mediata e fluorescenza di fondo. Un controllo di trasduzione non mirati GFP può anche essere utilizzato, che si illuminerà l'intera cella.
    5. Sostituire il terreno di coltura con terreno fresco. Aggiungere 2 ml del nuovo mezzo e 40 ml di GFP-tagged α-tubulina in ciascun pozzetto.
    6. Agitare delicatamente la piastra per permettere la completa miscelazione di GFP-tagged α-tubulina con il terreno di coltura. Riportare la piastra alla cultura incubatore e incubare per 24 ore per permettere l'espressione di GFP-tubulina.
  3. Trattare le cellule con docetaxel
    NOTA: Questo esperimento è quello di testare l'effetto di docetaxel in microtubuli instabilità dinamica. Così, le cellule vengono trattate con la concentrazione desiderata di docetaxel.
    1. Preparare un mezzo composto 90% di DMEM e il 10% di FBS e completato con amminoacidi non essenziali. Utilizzare DMEM senza rosso fenolo perché rosso fenolo può interferire con la fluorescence di GFP-tubulina. Aggiungere la concentrazione desiderata di docetaxel (da 10 nM a 10 pM). La soluzione madre di docetaxel è di 10 mm di dimetilsolfossido (DMSO).
    2. Pre-riscaldare il mezzo docetaxel a 37 ° C in incubatore di coltura tissutale.
    3. Sostituire il terreno di coltura normale con il mezzo contenente docetaxel e incubare per 30 minuti nel tessuto culturale incubatore. Ci dovrebbe essere almeno 3 lamelle per pozzetto per ciascuna concentrazione docetaxel.

2. l'imaging dal vivo per esaminare microtubuli instabilità dinamica

  1. Impostazione del sistema
    1. Eseguire esperimenti in una camera mantenuta a 37 ° C e 5% CO 2. Acquisire immagini di fluorescenza dal lasso di tempo di un sistema microscopico dotato di 60X, 1.42 olio NA lente obiettivo su un microscopio a fluorescenza invertito e con una telecamera CCD.
    2. Impostare le cellule per l'imaging dal vivo. Pre-caldo sia il titolare del campione eil mezzo a 37 ° C. Scegliere un vetrino da esaminare. Montare il vetrino di interesse su un porta-campioni e incubare con 1 ml del mezzo contenente docetaxel preparato al punto 1.3.1.
  2. Immagini dal vivo di microtubuli instabilità dinamica
    1. Identificare le celle che verranno utilizzati per l'imaging. Essi dovrebbero essere piatta, hanno una elevata intensità di fluorescenza di espresso GFP-tubulina, e hanno strutture microtubuli chiare.
    2. Scegliere una cella dal gruppo di cellule identificate dal punto 2.2.1 di esaminare prima. Focus sulla superficie periferica della cella identificata. Impostare il programma per il tempo di esposizione e la frequenza di acquisizione delle immagini. Mentre il tempo di esposizione è di solito di 0,5 s, le immagini saranno acquisite ogni due s.
    3. Lasciare un ulteriore 20 minuti per i passi da 1,33 a 2.2.3. Così, esattamente 50 minuti dopo l'aggiunta del docetaxel, come descritto al punto 1.3.3, avviare l'imaging (questo è per la standardizzazione).
    4. Registrare il microtubulo dynamics per 2 minuti, scattare una foto ogni 2 s. In totale, acquisire 60 immagini per la cella identificata.
    5. Passare alla successiva cella identificata e ripetere i passaggi 2.2.2 a 2.2.4. Ripetere la procedura fino a 5 celle sono state ripreso. È indispensabile farlo prima del tempo raggiunge 70 min dopo l'aggiunta del docetaxel, come descritto al punto 1.3.3.
    6. Per ogni condizione di trattamento, ripetere i passaggi da 2.2.1 a 2.2.5 per 3 diverse lamelle. In totale, immagine 15 celle, che è abbastanza dati per misurare microtubuli instabilità dinamica.

3. Elaborazione delle immagini e analisi dei dati

  1. Deconvoluzione di immagini
    1. Deconvolve le immagini acquisite per ottenere una qualità elevata. Aprire il programma deconvoluzione equipaggiato con il sistema del microscopio.
    2. Fai clic su "Processo" e selezionare "Deconvolve." Trascinate il file immagine nella finestra "Input" e fare clic su "Do." Il file di immagine verrà deconvolved, ed ilfile di deconvolved verrà salvato come un nuovo file automaticamente.
  2. Generazione di video
    1. Fare clic sul file immagine deconvolved da aprire con il software attrezzato.
    2. Fai clic su "File" e selezionare "Salva come film". Selezionare il "formato di un film" come "AV" e lo "stile di animazione" come "Forward". Impostare la "qualità di compressione" a "100%" e il "frame rate" a "5 / secondo."
    3. Selezionare la casella di "animare attraverso il tempo" e fare clic su "Do it". Il video verrà generato.
  3. Misura di microtubuli accorciamento e tasso di crescita
    1. Identificare i microtubuli che verranno utilizzati per la misurazione. Per ogni cella, solo pochi microtubuli potranno avere il loro accorciamento o di crescita seguiti chiaro e completo.
    2. Esaminate ogni frame del video per identificare il fotogramma che mostra la lunghezza iniziale del microtubulo unND il telaio con il microtubulo più estesa o ridotta. Misurare la variazione di lunghezza tra i due microtubuli e il tempo trascorso tra i due telai.
    3. Calcolare il tasso di crescita o accorciamento dividendo la variazione di lunghezza per tempo (l'unità è micron / s). Per ogni condizione di trattamento, seguire almeno 10 cellule e misurare almeno 20 microtubuli.
    4. Calcolare la media e l'errore standard per ogni condizione di trattamento. Analizzare la differenza statistica tra le condizioni utilizzando il test di Student. Riportare i dati in una tabella e / o in un grafico.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Utilizzando il protocollo presentato qui, abbiamo studiato gli effetti del docetaxel sulla dinamica dei microtubuli del normale (MCF-7 CC) e docetaxel-resistente (MCF-7 TXT), le cellule del cancro al seno. Due serie di immagini mostrano gli effetti di docetaxel (0,5 mM) sulla crescita microtubuli e accorciamento in MCF-7 CC e MCF-7 TXT cellule (Figura 1A).

Abbiamo in...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Ci sono due metodi principali per misurare microtubuli instabilità dinamica: in vitro e in vivo. Nel metodo in vitro, tubulina purificato viene utilizzato per misurare instabilità dinamica dei microtubuli con time-lapse microscopia a interferenza differenziale contrasto informatica avanzata. Nel metodo in vivo, microiniettato tubulina fluorescenti, o espresso GFP-tubulina, è incorporato in microtubuli. La dinamica (crescita e accorciamento) dei microtubuli vengono quindi registrati da...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Questa ricerca è supportata da finanziamenti da CBCF (a ZW).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Sigma-AldrichD5796
Aminoacidi non essenzialiLife Technologies, Invitrogen11140-050
FBSGibco, Invitrogen12483
Anti-Anti (100x)Life Technologies, Invitrogen15240-062
docetaxelSigma-Aldrich01885-5mg-F
DMEM fenolo senza rossoGibco, Invitrogen21063
Reagente CellLight *BacMam 2.0* GFP-tubulinaThermoFisher ScientificC10613Reagente chiave per l'espressione della tubulina GFP nelle cellule
Reagente CellLight *BacMam 2.0* GFPThermoFisher ScientificB10383Controllo
Dimetil solfossido (DMSO)Sigma-Aldrich+B9:AA9472301per dissoving decetaxel
22 mm vetro coveslipFisher Scientifics12-545-101
Piastra di coltura a 6 pozzettiGreiner Bio-One Internationalcoltura Celi a 6 pozzetti
Sistemi di imaging per microscopia DeltaVision GEHealthQuesto sistema è dotato di stazione meteorologica per il controllo della temperatura e della CO2. Dotato inoltre di software Worx per la deconvoluzione e il controllo del time lapse.
Tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenoloBright-Line 25200056
, Hausser ScientificHausser Scientific, distribuito da VWRN. fornitore: 1492 N. VWR:15170-172
Piastra di Set di ematocitometri ThermoFisher Scientific

Riferimenti

  1. Kamangar, F., Dores, G. M., Anderson, W. F. Patterns of cancer incidence, mortality, and prevalence across five continents: defining priorities to reduce cancer disparities in different geographic regions of the world. J Clin Oncol. 24 (14), 2137-2150 (2006).
  2. Yardley, D. A. Drug resistance and the role of combination chemotherapy in improving patient outcomes. Int J Breast Cancer. 2013, 137414(2013).
  3. Jassem, J., et al. Doxorubicin and paclitaxel versus fluorouracil, doxorubicin, and cyclophosphamide as first-line therapy for women with metastatic breast cancer: final results of a randomized phase III multicenter trial. J Clin Oncol. 19 (6), 1707-1715 (2001).
  4. Nabholtz, J. M., et al. Docetaxel and doxorubicin compared with doxorubicin and cyclophosphamide as first-line chemotherapy for metastatic breast cancer: results of a randomized, multicenter, phase III trial. J Clin Oncol. 21 (6), 968-975 (2003).
  5. Zelnak, A. Overcoming taxane and anthracycline resistance. Breast J. 16 (3), 309-312 (2010).
  6. Rivera, E. Implications of anthracycline-resistant and taxane-resistant metastatic breast cancer and new therapeutic options. Breast J. 16 (3), 252-263 (2010).
  7. Longley, D. B., Johnston, P. G. Molecular mechanisms of drug resistance. J Pathol. 205 (2), 275-292 (2005).
  8. Downing, K. H., Nogales, E. Crystallographic structure of tubulin: implications for dynamics and drug binding. Cell Struct.Funct. 24 (5), 269-275 (1999).
  9. McGrogan, B. T., Gilmartin, B., Carney, D. N., McCann, A. Taxanes, microtubules and chemoresistant breast cancer. Biochim.Biophys.Acta. 1785 (2), 96-132 (2008).
  10. Kamath, K., Oroudjev, E., Jordan, M. A. Determination of microtubule dynamic instability in living cells. Methods Cell Biol. 97, 1-14 (2010).
  11. Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (10), 790-803 (2010).
  12. Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nat.Rev.Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
  13. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J.Cell Sci. 122 (15), 2579-2585 (2009).
  14. Kavallaris, M. Microtubules and resistance to tubulin-binding agents. Nat.Rev.Cancer. 10 (3), 194-204 (2010).
  15. Diaz, J. F., Valpuesta, J. M., Chacon, P., Diakun, G., Andreu, J. M. Changes in microtubule protofilament number induced by Taxol binding to an easily accessible site. Internal microtubule dynamics. J.Biol.Chem. 273 (50), 33803-33810 (1998).
  16. Abal, M., Andreu, J. M., Barasoain, I. Taxanes: microtubule and centrosome targets, and cell cycle dependent mechanisms of action. Curr Cancer Drug Targets. 3 (3), 193-203 (2003).
  17. Wang, H., et al. Multiple mechanisms underlying acquired resistance to taxanes in selected docetaxel-resistant MCF-7 breast cancer cells. BMC Cancer. 14 (37), (2014).
  18. Lal, S., Mahajan, A., Chen, W. N., Chowbay, B. Pharmacogenetics of target genes across doxorubicin disposition pathway: a review. Curr. Drug Metab. 11 (1), 115-128 (2010).
  19. Murray, S., Briasoulis, E., Linardou, H., Bafaloukos, D., Papadimitriou, C. Taxane resistance in breast cancer: mechanisms, predictive biomarkers and circumvention strategies. Cancer Treat.Rev. 38 (7), 890-903 (2012).
  20. Kamath, K., Wilson, L., Cabral, F., Jordan, M. A. BetaIII-tubulin induces paclitaxel resistance in association with reduced effects on microtubule dynamic instability. J.Biol.Chem. 280 (13), 12902-12907 (2005).
  21. Banerjee, A. Increased levels of tyrosinated alpha-, beta(III)-, and beta(IV)-tubulin isotypes in paclitaxel-resistant MCF-7 breast cancer cells. Biochem.Biophys.Res.Commun. 293 (1), 598-601 (2002).
  22. Wiesen, K. M., Xia, S., Yang, C. P., Horwitz, S. B. Wild-type class I beta-tubulin sensitizes Taxol-resistant breast adenocarcinoma cells harboring a beta-tubulin mutation. Cancer Lett. 257 (2), 227-235 (2007).
  23. Iseri, O. D., Kars, M. D., Arpaci, F., Gunduz, U. Gene expression analysis of drug-resistant MCF-7 cells: implications for relation to extracellular matrix proteins. Cancer Chemother.Pharmacol. 65 (3), 447-455 (2010).
  24. Hembruff, S. L., et al. Role of drug transporters and drug accumulation in the temporal acquisition of drug resistance. BMC.Cancer. 8, 318(2008).
  25. Yenjerla, M., Lopus, M., Wilson, L. Analysis of dynamic instability of steady-state microtubules in vitro by video-enhanced differential interference contrast microscopy with an appendix by Emin Oroudjev. Methods Cell Biol. 95, 189-206 (2010).
  26. Sammak, P. J., Gorbsky, G. J., Borisy, G. G. Microtubule dynamics in vivo: a test of mechanisms of turnover. J Cell Biol. 104 (3), 395-405 (1987).
  27. Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. J Cell Biol. 107 (4), 1437-1448 (1988).
  28. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 83-117 (1997).
  29. Walczak, C. E. Microtubule dynamics and tubulin interacting proteins. Curr Opin Cell Biol. 12 (1), 52-56 (2000).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Cellule resistenti al docetaxelalfa-tubulina marcata con GFPimaging time-lapsemicroscopia a fluorescenzacrescita dei microtubuliaccorciamento dei microtubulimetodo in vivocellule di cancro al senotrattamento farmacologico
Immagini dal vivo per studiare Microtubulo instabilità dinamica nei tumori al seno taxani resistente
Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.