Istituzione di cellule proliferativa tetraploide da non trasformate fibroblasti umani

Sommario

Sebbene le cellule poliploidi proliferative siano necessarie per analizzare l'instabilità cromosomica delle cellule poliploidi, creare tali cellule da cellule umane non trasformate non è facile. Il presente rapporto descrive procedure relativamente semplici per stabilire cellule tetraploidi proliferative prive di una popolazione diploide da fibroblasti umani normali.

Abstract

Le cellule poliploidi (per lo più tetraploidi) sono spesso osservate nelle lesioni preneoplastiche dei tessuti umani e la loro instabilità cromosomica è stata considerata responsabile della carcinogenesi in tali tessuti. Sebbene le cellule poliploidi proliferative siano necessarie per analizzare l'instabilità cromosomica delle cellule poliploidi, la creazione di tali cellule da cellule umane non trasformate è piuttosto impegnativa. L'induzione della tetraploidia da parte di agenti chimici di solito si traduce in una miscela di popolazioni diploidi e tetraploidi, e la maggior parte degli studi ha impiegato la selezione o il clonaggio cellulare attivato dalla fluorescenza limitando la diluizione per separare le cellule tetraploidi da quelle diploidi. Tuttavia, queste procedure richiedono tempo e laboriose. Il presente rapporto descrive un protocollo relativamente semplice per indurre cellule tetraploidi proliferative da fibroblasti umani normali con una contaminazione minima da parte di cellule diploidi. In breve, il protocollo comprende le seguenti fasi: arresto delle cellule in mitosi mediante demecolcina (DC), raccolta di cellule mitotiche dopo averlo scosso, incubazione delle cellule raccolte con DC per altri 3 giorni e incubazione delle cellule in terreno privo di farmaci (riprendono la proliferazione come cellule tetraploidi entro diversi giorni). A seconda del tipo di cellula, la raccolta delle cellule mitotiche mediante scrollandosi potrebbe essere omessa. Questo protocollo fornisce un metodo semplice e fattibile per stabilire cellule tetraploidi proliferative da fibroblasti umani normali. Le cellule tetraploidi stabilite con questo metodo potrebbero essere un modello utile per studiare l'instabilità cromosomica e il potenziale oncogenico delle cellule umane poliploidi.

Introduzione

Poliploidia è stata osservata non solo in tessuti specializzati di specie di mammiferi, ma anche in una varietà di condizioni patologiche, come il cancro e malattie degenerative. Poliploidi (per lo più tetraploide), le cellule sono spesso osservate nelle lesioni preneoplastiche di tessuti umani, come l'esofago ^1,2 o squamose lesioni intraepiteliali di Barrett della cervice ^3,4, e sono stati considerati per essere la fonte di cellule aneuploidi maligne in quei tessuti ^{5 , 6.} Sebbene si suggerisce che la conversione di tetraploide di cellule aneuploidi potrebbe essere un evento cruciale nelle prime fasi della tumorigenesi, i meccani....

Protocollo

Cultura 1. cellulare

1. Ottenere le cellule per indurre tetraploidia. Fino ad oggi è stato confermato che questa tecnica può essere applicata alle linee cellulari di fibroblasti umani TIG-1, BJ, IMR-90 e telomerasi immortalizzate TIG-1 (TIG-HT).
2. Crescere le cellule in terreno minimo essenziale con modificazione α o qualsiasi altro mezzo di coltura cellulare adatto per il tipo di cellula da studiare supplementato con 10% (v / v) di siero fetale bovino inattivato al calore (FBS) incubando in un 5% (v / v) di CO ₂ nell'atmosfera a 37 ° C. cellule di passaggio ogni 3 o 4 giorni di non superare la densità subconfluenti.
   NOTA: livell....

Risultati

Nella nostra esperienza, cellule TIG-1 possono essere realizzati quasi completamente tetraploid per semplice trattamento continuo con 0,1 mg / mL DC per 4 giorni (Figura 2A). Al contrario, altri ceppi di fibroblasti, come BJ o IMR-90, e le cellule TIG-HT, è diventato una miscela di diploide e popolazioni tetraploidi seguito lo stesso trattamento, e l'isolamento di cellule mitotiche con il metodo shake-off è necessario durante il corso di trattamento DC (di solito 16 .......

Discussione

Un grave problema nel induzione di tetraploidia da cellule diploidi di agenti chimici, sia da inibitori Citochinesi o con inibitori del fuso, è che le cellule diventano spesso un miscuglio di popolazioni diploidi e tetraploidi, e le cellule tetraploidi devono essere separati dalle cellule diploidi. approcci più comuni per l'isolamento di una popolazione tetraploide privo di cellule diploidi utilizzano FACS o clonazione, limitando la diluizione. Tuttavia, queste procedure sono laboriosa e non facile da eseguire. In q.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
MEM-&alfa;	Sigma-Aldrich	M8042-500ML
Tripsina-EDTA	Sigma-Aldrich	T4174
FBS	Sigma-Aldrich	172012-500ML
Soluzione di demecolina (10 μ g/mL in HBSS)	Sigma-Aldrich	D1925-10ML
BD CycleTES Plus Kit di reagenti DNA BD	Biosciences	#340242	Per l'esame della ploidia del DNA mediante citometria a flusso
Sonda FISH multicolore per cromosomi umani 24XCyte	MetaSystems	#D-0125-060-DI	Sono necessari un set di filtri specializzati e un software per l'analisi mFISH
Sistema di imaging Isis con software mFISH	necessario un kit di sonde specializzato	MetaSystems

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