Questo protocollo fornisce un metodo per la raccolta di cellule staminali embrionali di topo (Mesc) medio -conditioned (Mesc-CM) derivato dal siero (siero fetale bovino, FBS) - e di alimentazione (fibroblasti embrionali di topo, MEF) Condizioni senza glutine per una cella approccio-free. Può essere applicabile per il trattamento di invecchiamento e malattie associate invecchiamento.
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Articolo metodologico
Raccolta di di siero e senza alimentatore staminali embrionali di topo medio-Cell condizionata per un approccio libero-Cell
In questo articolo
Sommario
Abstract
La capacità delle cellule staminali embrionali (ESC) e delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) di generare vari tipi di cellule ha aperto nuove strade nel campo della medicina rigenerativa. Tuttavia, nonostante i loro benefici, il potenziale tumorigenico delle ESC e delle iPSC è stato a lungo un ostacolo per le applicazioni cliniche. È interessante notare che è stato dimostrato che le ESC producono diversi fattori solubili che possono promuovere la rigenerazione dei tessuti e ritardare l'invecchiamento cellulare, suggerendo che le ESC e le iPSC possono essere utilizzate anche come metodo di intervento privo di cellule. Pertanto, il metodo per la raccolta di terreno condizionato con cellule staminali embrionali di topo (mESC) (mESC-CM) con una contaminazione minima dei componenti del siero (siero fetale bovino, FBS) e delle cellule di alimentazione (fibroblasti embrionali di topo, MEF) è stato molto richiesto. Qui, il presente studio dimostra un metodo ottimizzato per la raccolta di mESC-CM in condizioni prive di siero e alimentatore e per la caratterizzazione di mESC-CM utilizzando letture multiple associate alla senescenza. Questo protocollo fornirà un metodo per raccogliere fattori secretori puri specifici per mESC senza contaminazione del siero e dell'alimentatore.
Introduzione
L'obiettivo di questo protocollo è quello di raccogliere il mouse sulle cellule staminali embrionali (Mesc) medio -conditioned (Mesc-CM) da condizioni di coltura di siero e privo di alimentazione e per caratterizzare le sue funzioni biologiche.
In generale, le cellule staminali embrionali (ESC) hanno un grande potenziale per la medicina rigenerativa e terapia cellulare per la loro pluripotenza e la capacità di auto-rinnovamento 1-3. Tuttavia, il trapianto diretto di cellule staminali ha diverse limitazioni, come rigetto immunitario e la formazione del tumore 4,5. Pertanto, un approccio libero-cella può fornire un....
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Protocollo
NOTA: Uno schema del sierica- e protocollo di raccolta CM-free alimentatore è mostrato in Figura 1.
1. Materiali (Preparazione del MEF, Medium, piatti, e Solutions)
- Preparare 500 ml di terreno alla cultura i MEF. Supplemento Modified mezzo di Eagle Dulbecco (DMEM) con 10% FBS (ESC qualità), 50 unità / ml di penicillina, 50 mg / ml di streptomicina.
- Isolare MEF da embrioni a seguito di un protocollo di routine consolidata 13 e mantenerli in media MEF.
- Preparare 500 ml di terreno alla cultura i mESCs. DMEM è completato con 15% FBS e 2 mM L-glutammina, 100 mM aminoacidi non essenziali (NEAA), 100 mM β-me....
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Risultati
In origine, mESCs sono mantenuti su un alimentatore MEF in media Mesc con FBS e altri integratori (Figure 1A e 2A). CM è stato raccolto da mESCs a ridotto siero media senza uno strato alimentatore, FBS, o altri supplementi (figure 1B e 2B). Questa condizione la cultura ci permette di raccogliere Mesc specifico mezzo condizionato senza potenziale contaminazione da fattori dall'alimentatore, FBS, o altri supplementi. I.......
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Discussione
Per la collezione di successo di di siero e Mesc-CM senza alimentatore, i seguenti suggerimenti dovrebbero essere presi in considerazione. Il fattore più critico è usando mESCs passaggio primi per la raccolta di Mesc-CM. In precedenza, è stato dimostrato che il passaggio anticipato Mesc-CM ha migliori effetti anti-invecchiamento rispetto al mESCs fine del passaggio. Stato segnalato il numero passaggio di mESCs di influenzare il loro potenziale di sviluppo 16 e 17 pluripotenza.
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata sostenuta dalla scienza Basic Program Research (2013R1A1A2060930) e il Medical Research Programma Center (2015R1A5A2009124) attraverso la Fondazione Nazionale delle Ricerche di Corea (NRF), finanziato dal Ministero della Scienza, ICT, e la pianificazione futura. Questa ricerca è supportata anche da una start-up sovvenzione di funzionamento dalla Hospital for Sick Children (HK Sung). Vorremmo ringraziare Laura e Sarah Barwell JS Kim per la loro eccellente aiuto nella redazione di questo manoscritto e il Dr. Andras Nagy per la fornitura della linea G4 Mesc.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | #11960-044 | |
| FBS | Invitrogen | #30044333 | 20%, qualità cellulare ES |
| Penicillina e streptomicina | Invitrogen | #15140 | 50 unità/ml penicillina e 50 mg/ml di streptomicina |
| L-glutammina | Invitrogen | #25030 | 2 mM |
| Aminoacidi non essenziali (NEAA) | Invitrogen | #11140 | 100 µ M |
| β-mercaptoetanolo | Sigma | #M3148 | 100 µ M |
| Fattore inibitorio della leucemia | Millipore | #ESG1107 | 100 unità/ml |
| OPTI-MEM | Invitrogen | #22600 | |
| X-gal | Sigma | #B4252 | 1 mg/ml |
| Paraformaldeide (PFA) | Sigma | P6148 | 3,70% |
| Dimetilformammide (DMF) | Sigma | #D4551 | |
| Ferricianuro di potassio | Aldrich | #455946 | 5 mM |
| ferrocianuro di potassio | Aldrich | #455989 | 5 mM |
| NaCl | Sigma | #S7653 | 150 mM |
| MgCl2 | Sigma | #M2393 | 2 mM |
| Mitomicina C | Sigma | #M4287 | 10 µ g/ml |
| di ioduro di propidio | Sigma | #P4170 | 50 µ g/ml |
| TRIzol | Ambion | #15596018 | |
| M-MLV trascrizione inversa-tasi | Promega | #M170B | |
| Power SYBR Green PCR master mix | Biosistemi applicati | #4367659 | |
| HDF, NHDF-Ad-Der-Fibroblasti | LONZA | #CC-2511 | |
| Filtro per bottiglie | Corning | #430513 | 0.2 μ m |
Riferimenti
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Lavasani, M., et al. Muscle-derived stem/progenitor cell dysfunction limits healthspan and lifespan in a murine progeria model.
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Ristampe e permessi
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