Un modello per perineurale Invasion in testa e del collo carcinoma a cellule squamose

Sommario

L'invasione perineurale (PNI) è una caratteristica comune del carcinoma a cellule squamose della testa e del collo (HNSCC), che conferisce tassi di sopravvivenza più bassi. I suoi meccanismi sono poco conosciuti. Utilizzando neuriti generati da gangli murini della radice dorsale confinati in una matrice semisolida, è possibile studiare le vie coinvolte nel PNI delle linee cellulari HNSCC.

Abstract

L'invasione perineurale (PNI) si trova in circa il 40% dei carcinomi a cellule squamose della testa e del collo (HNSCC). Nonostante il trattamento multimodale con chirurgia, radioterapia e chemioterapia, le recidive locoregionali e le metastasi a distanza si verificano a tassi più elevati e la sopravvivenza globale è ridotta del 40% rispetto all'HNSCC senza PNI. Gli studi in vitro dei percorsi coinvolti nell'HNSCC PNI sono stati storicamente impegnativi data la mancanza di un test coerente e riproducibile. Qui descritto è l'adattamento del test del ganglio della radice dorsale (DRG) per l'esame della PNI nell'HNSCC. In questo modello, i DRG vengono raccolti dalla colonna vertebrale di un topo nudo sacrificato e collocati all'interno di una matrice semisolida. Nei giorni successivi, i neuriti vengono generati e crescono in un modello radiale dai corpi cellulari del DRG. Le linee cellulari di HNSCC vengono quindi posizionate perifericamente attorno alla matrice e invadono preferenzialmente lungo i neuriti verso il DRG. Questo metodo consente una rapida valutazione di più condizioni di trattamento, con tassi di successo e riproducibilità dei saggi molto elevati.

Introduzione

Il carcinoma a cellule squamose della testa e del collo (HNSCC) è il sesto tumore più comune negli Stati Uniti, con 10.000 decessi all'anno a livello nazionale e 300.000 decessi all'anno in tutto il mondo¹. La prognosi complessiva per l'HNSCC è rimasta invariata al 50% negli ultimi decenni. L'invasione perineurale (PNI) è una delle caratteristiche patologiche più importanti che fanno presagire una prognosi infausta nei pazienti con HNSCC. Sfortunatamente, la PNI è un'evenienza frequente nell'HNSCC e può essere riscontrata fino al 40% dei pazienti con HNSCC^2,3.

PNI è il processo attraverso il quale le cellule maligne seguono i nervi fino ai tessuti adiacenti, consentendo tassi più elevati di diffusione locale e a distanza. Di conseguenza, i tumori HNSCC PNI-positivi hanno tassi più elevati di recidive locoregionali e metastasi a distanza, con conseguente sopravvivenza globale inferiore rispetto ai pazienti con HNSCC senza PNI^4-8.

>jove_content^9-11. Pertanto, è chiaro che le attuali modalità di trattamento per l'HNSCC sono inefficaci nel migliorare la prognosi avversa associata alla PNI. L'approccio di sviluppo di una terapia mirata contro la PNI nell'HNSCC è stato ostacolato dalla scarsa comprensione dei fattori che regolano questo processo. Ciò è, in parte, una conseguenza della mancanza di un modello in vitro coerente per lo studio della PNI nell'HNSCC.

Negli ultimi anni, diversi gruppi hanno utilizzato un modello in vitro per studiare la PNI nei tumori prevalentemente del pancreas e della prostata^12-19. Questo modello utilizza i neuriti generati dai gangli delle radici dorsali isolati da topi o ratti come surrogato per l'invasione dei grandi nervi. I gangli della radice dorsale sono fissati in una matrice semisolida impoverita di fattore, che è una miscela proteica solubilizzata della membrana basale secreta dalle cellule del sarcoma del topo di Engelbreth-Holm-Swarm. Questa matrice consente la crescita dei neuriti e il tracciamento di singole cellule tumorali lungo questi neuriti. Di seguito viene descritto l'adattamento di questo modello per l'esame della PNI nell'HNSCC.

Protocollo

1. Preparazione del terreno di coltura e di Piatti (10 min)

1. Aggiungere 100 ml di Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM) con siero fetale bovino al 10% (FBS) per i pozzetti di una piastra a 96 pozzetti V-parte inferiore.
2. Rimuovere un pre-aliquotati-fiala di circa 100 ml di matrice semisolida dal congelatore 20 ° C e posizionarlo direttamente sul ghiaccio.
   NOTA: Eseguire questa prima ganglio della radice dorsale (DRG) raccolta perché la matrice semisolida dura circa 30 minuti per raggiungere stato liquido sul ghiaccio, che è necessaria per le fasi successive. Il mancato mantenimento matrice semisolida su ghiaccio in ogni momento comporterà una matrice gocciolina di scarsa qualità.
3. Etichetta di vetro a fondo culture piastre con inchiostro permanente, creando identificatori unici in ciascuno dei quattro angoli sulla superficie inferiore della piastra. Posizionare le piastre lato destro in alto sul ghiaccio per raffreddare la superficie della piastra.
   NOTA: resa ogni mouse 32 - 40 DRG, così etichettateli da 1 a 40. Non è necessario pre-raffreddare pipet punte, come suggerimenti refrigerati riscalderanno nel corso di collocare le goccioline di matrice, potenzialmente introdurre differenze di consistenza della matrice.

2. La dissezione di Murine DRG (45 min)

1. Euthanize un mouse nudi atimici secondo protocolli di laboratorio specifici, ad esempio attraverso l'uso di una camera di CO ₂ e una toracotomia.
2. Impostare l'area dissezione e microscopio. Utilizzare la parte inferiore pulito, sterilizzato, e piatto di contenitori in polistirolo per 15- o conici 50 mL.
   NOTA: Inoltre, sono adatti per l'uso come la superficie dissezione, come sono economici, monouso, e consentire il fissaggio della colonna con perni o aghi. Utilizzare solo strumenti sterilizzati e aghi.
3. Sotto visione naturale, fare una incisione longitudinale lungo la colonna vertebrale dalla radice della coda alla testa del mouse con un paio di forbici sottili dritte o curve.
4. Utilizzare le stesse forbici per dividere trasversalmente al di sotto del sacral rachide. Sezionare entrambi i lati della colonna vertebrale tutta la strada fino alla base cranica usando le forbici. A questo punto, assicurarsi che la colonna vertebrale cervicale è sezionato cranialmente quanto possibile con le forbici.
5. Osservare fine cervicale della colonna vertebrale sotto il microscopio operatorio a bassa potenza. Il midollo spinale bianca è evidente nel mezzo di un anello osseo, che è circondata da quantità variabili di muscoli paravertebrali e dei tessuti molli.
6. Dividere la dorsale o aspetto superiore dei primi 2 - 3 corpi vertebrali con le forbici a molla microscopici. Utilizzando l'azione della molla delle forbici, aprire questo ossea iniziale tagliare per garantire che la dissezione corpo vertebrale avvenuta alla linea mediana. Continuare piccoli incrementi verso il sacrale e quindi bisect rachide completando i tagli identiche sul faccia ventrale o inferiore dei corpi vertebrali.
   NOTA: mancata garantire la dissezione linea mediana della colonna vertebrale ossea si tradurrà in una resa DRG inferiore.
7. A thipunto s, la colonna vertebrale è divisa in due metà. Mettere una emi-colonna vertebrale a parte, con il midollo spinale in atto e rivolto verso il basso su un piatto sterile.
   NOTA: Lasciare il midollo spinale in atto impedirà i DRG si secchi, come i DRG sono profonde al midollo spinale.
8. Fissare due estremità dell'altro emi-spinale con due aghi calibro 18 sulla piattaforma polistirene dissezione. A partire dalla fine cervicale (che è evidente in quanto la colonna vertebrale è stretto, il DRG sono più vicini l'uno all'altro, e ci sono inserzioni costola), sbucciare delicatamente il midollo spinale da circa 4 livelli vertebrali.
9. Osservare i nervi sensoriali (di solito due) che collegano il DRG. Nella zona in cui i nervi inseriscono al DRG, prenda delicatamente la fascia circostanti con una pinza microscopici. Sezionare e tagliare questa fascia e altri tessuto nervoso con le forbici a molla microscopici per liberare il DRG. retrazione Gentle porterà DRG fuori dalla sua posizione all'interno della colonna vertebrale ossea.
   NOTA: L'aumento dellaalimentazione del microscopio in questa fase è vantaggiosa. Crush lesioni al DRG limiterà in modo significativo la crescita dei neuriti. Questo è evitato mai afferrare direttamente il DRG, bensì afferrando la fascia circostanti.
10. Tagliare il nervo periferico (DRG ha generalmente un nervo periferico, che è profondo relativo alla vista dissezione) con le forbici a molla microscopici per rilasciare il DRG.
    NOTA: È più facile accertare dove le estremità nervose e DRG inizia mentre sulla tensione, rendendo questo taglio il più vicino possibile al DRG a questo punto è ideale. Una volta che questo ramo distale è tagliato, i rami prossimali vengono tagliati pure.
11. Tagliare il DRG di eventuali fibre nervose randagi o allegati fasciali con le forbici primavera microscopici. Dopo un adeguato isolamento, posizionare il DRG nel medium temperatura ambiente all'interno della piastra a 96 pozzetti V-bottom.
    NOTA: Posizionamento di un fondo scuro sotto la piastra fa visualizzare il sub-mm DRG bianchi più facile. Solo mettere un DRG in EACh ben; questo modo, possono essere rappresentato più facilmente nei passaggi successivi.
12. Ripetere questo processo fino in fondo un emi-colonna vertebrale e poi l'altro. Ogni lato produce 16 - 20 DRG, per un totale di 32 - 40.
    NOTA: Se ci sono meno DRG di questo, la dissezione della colonna vertebrale deve essere effettuata ulteriormente craniale e / o caudalmente. I DRG diventano sempre meno ben definito come si procede caudale.

3. Preparazione del semiduri Matrix goccioline (<1 min per piastra)

1. Rimuovere una lastra di vetro ben inferiore dal ghiaccio e posizionarlo su un blocco di ghiaccio sotto il microscopio operatorio. Assicurarsi che la aliquota di matrice rimane sul ghiaccio in ogni momento.
2. Posizionare una goccia 1,5 ml di matrice in ciascuno dei quattro angoli della piastra con fondo di vetro con un 2-microlitri o 10 microlitri micropipetter, lasciando una distanza almeno grande quanto la stessa goccia dal bordo del vetro bene.
   1. Posizionare la punta della pipetta direttamente suil vetro in un angolo di 45 gradi. Lentamente pipettare la matrice. Lentamente allontanarsi dal fondo di vetro dopo la matrice è impegnata sulla piastra.
      NOTA: La tensione superficiale tra la matrice ed il vetro dovrebbe creare un emisfero perfetto ogni volta.
   2. Arrestare pipettaggio appena prima della punta è vuoto, in quanto l'iniezione accidentale di aria nel gocciolina matrice rende il diametro della goccia matrice molto più grande ed è difficile da rimuovere.
      NOTA: l'utilizzo di una seconda mano per stabilizzare la mano pipettaggio facilita il posizionamento più accurato.

4. Inserimento di DRG in semiduri Matrix goccioline (<2 min per piastra)

1. Lasciare la piastra con le goccioline matrice brevemente a temperatura ambiente (~ 1 min). Questo irrigidisce leggermente la matrice, rendendo più facile per il posizionamento preciso del DRG.
2. Scoop (non cogliere) il DRG delicatamente con una pinza microscopiche chiuse nella mano sinistra. Ancora una volta, un fondo scuro contro il piccolo, biancoDRG facilita la visualizzazione. Trasferire il DRG alla punta di un ago 21-gauge nella mano destra. Questo trasferimento lascerà i media residua sulle pinze.
3. Inserire delicatamente la DRG nel mezzo della goccia di matrice utilizzando l'ago 21-gauge (Figura 1). La maggior parte del tempo, il DRG saranno facilmente rilasciare nella matrice e quindi possono essere posizionati centralmente con l'ago.
   1. Se il DRG attacca all'ago, utilizzare le pinze microscopici per spingere il DRG fuori dell'ago e nella gocciolina di matrice. Wick supporto via eccesso dalla pinza microscopici con un laboratorio di pulire.
      NOTA: Introdurre supporto alla matrice altera il diametro, il volume e la consistenza del test. Un blocco di ghiaccio con il colore o la scrittura colorata offre il contrasto di fondo, che facilita la visualizzazione di questo delicato processo.
4. Dopo la piastra ha quattro DRG, eseguire un controllo finale per garantire che il DRG è al centro della goccia matrice. Effettuare le regolazionise necessario con l'ago 21-calibro.
5. Trasferire la piastra di completamento di un incubatore a 37 °. Questo rafforzerà la matrice semisolida e fissare il DRG in posizione.
6. Ripetere questa procedura per tutte le DRG. Mettere goccioline di matrice vuoti senza un DRG come il controllo negativo.
7. Aggiungere 4 ml di DMEM con 10% FBS supporti per ogni piatto fondo di vetro dopo aver completato tutti i piatti e li espone alla 37 ° C incubatore per almeno 3 minuti. Porre la piastra con una leggera angolazione e aggiungere lentamente il mezzo, in modo tale che entra in contatto con le unità matrice DRG.
   NOTA: Se si aggiunge troppo velocemente o con forza il medium, la matrice e / o DRG può diventare sloggiato.
8. Conservare i saggi nel 37 ° C incubatore per le prossime 48 - 72 ore.
   NOTA: Esame periodico dei saggi mostrerà conseguenza circonferenziale dei neuriti verso il bordo della matrice (Figura 2). Quando i neuriti sono superiori tre quarti della strada per la matrice,è opportuno piastra le cellule.

5. Preparazione della testa e del collo cellule tumorali

NOTA: Le linee cellulari diverse testa e cellule di carcinoma delle cellule squamose del collo possono essere utilizzati in questo disegno sperimentale.

1. Mantenere le linee di carcinoma delle cellule squamose cellule in DMEM con 10% FBS in fusti preferiti o piastre di coltura in un incubatore a 37 °. Per preparare le cellule per la sperimentazione, l'aspirazione tutto il medium dal pallone di coltura o un piatto e lavare due volte con PBS. Sospendere le cellule aggiungendo un'appropriata quantità di 0,025% tripsina per 5 minuti, seguito da DMEM con 10% FBS. Dispensare 4 ml della miscela delle cellule e dei media in capsule di Petri 6-mL.
   NOTA: una piastra di coltura a 6 ml fornisce più di abbastanza cellule, anche se meno del 50% confluenti.
2. Esporre le linee di cellule HNSCC alle diverse condizioni di 24 ore prima della colorazione e placcatura sul test DRG. Re-dosare la condizione di una volta che le cellule sono placcati per mantenere una environme coerentent.
   NOTA: Aggiungere gli anticorpi, fattori di crescita, citochine, o altre molecole per i piatti di coltura cellulare 1 - 2 giorni dopo la dissezione del mouse e l'impianto del DRG nella matrice.
3. Aggiungere macchie di cellule fluorescenti 1 h prima placcatura le cellule (2 - 3 giorni dopo la raccolta e l'impianto DRG nella matrice).
   NOTA: Le macchie particolari usati qui passare liberamente attraverso la membrana cellulare; tuttavia, dopo reagire con gruppi tiolici intracellulari, la macchia rimane all'interno della cellula e viene trasmesso alle cellule figlie. La colorazione facilita notevolmente la visualizzazione all'interno dei saggi. Queste macchie temporanee sono ideali per questi saggi perché la fluorescenza è presente per 2 - 3 giorni, che è il termine di questi esperimenti. Esso consente anche l'uso di molti colori diversi e elimina la necessità di creare linee cellulari trasfettate proteine ​​fluorescenti.
   1. Preparare 10 mM di soluzione colorante miscelando 2 ml di 10 mM macchie stock cellule in 2 ml di DMEM senza sieroper ogni condizione cellule. Riscaldare questo a 37 ° C prima di aggiungere alle celle.
   2. Rimuovere il terreno di coltura all'interno della piastra 6-mL, lasciando le cellule aderenti HNSCC sulla piastra. Aggiungere 2 ml di PBS (PBS) e rimuovere 2 ml di 10 macchia cellule micron / DMEM senza siero aggiunto a ogni piatto
   3. Riportare la piastra di coltura a 6 ml con la macchia cella a 37 ° C incubatore per 40 min.
   4. Dopo 40 min, aspirare il terreno. Aggiungere 2 ml di PBS e la aspirerà. Aggiungere 1 ml di 0,025% tripsina ad ogni piatto e sostituirli nel 37 ° C incubatore.
   5. Aggiungere 2 ml di DMEM con 10% FBS dopo il 3 - 5 minuti e trasferire le cellule in sospensione in una provetta conica da 15 ml. Spin le cellule e risospeso in 1 ml di DMEM con 10% FBS.
   6. Contare le cellule con un emocitometro o contatore automatico di cellule, e quindi aggiungere DMEM con 10% FBS per creare una concentrazione cellulare finale di 300.000 cellule per ml.

6. placcatura testa e NLe cellule tumorali eck

1. Rimuovere le piastre con fondo di vetro con i saggi di matrice-DRG dal termostato.
   NOTA: Anche in questo caso, essi sono appropriati quando neuriti sono almeno il 75% del fino al bordo della matrice, che generalmente si verifica dopo 2 - 3 giorni. Questo si vede meglio utilizzando almeno un obiettivo 10X.
2. Aspirare il terreno all'interno della piastra con fondo di vetro. Completamente aspirare il terreno all'interno del vetro e senza rimuovere le unità di matrice DRG.
3. Elaborare 200 ml di 300.000 cellule / ml di media utilizzando una pipetta da 200 ml. Mettere due gocce di cellule su ogni saggio matrice-DRG. Eseguire questo passaggio per ogni goccia di matrice, la creazione di quattro ripetizioni di ogni condizione di cella su una piastra.
   NOTA: La forma emisferica della matrice permette alle cellule di stabilirsi in un anello lungo la periferia del test (Figura 3a, Figura 3b). Trovare una pipetta con un trigger liscia rende il posizionamento di uniforme scende molto più facile.
4. Confermare il numero di cellule simili e distribuzione delle diverse condizioni di cellule sotto 4X microscopia.
5. Posizionare le lastre di vetro-fondo nel 37 ° C incubatore per circa 60 min. NOTA: Anche se c'è solo una piccola quantità di cellule e dei media (~ 150 mL), i saggi non si asciugano fino a diverse ore di tempo incubatore sono trascorsi.
6. Dopo 60 min, aggiungere delicatamente 4 ml di DMEM con 10% FBS lungo la parete laterale della piastra di fondo di vetro.
   NOTA: Per un periodo di tempo, le cellule parzialmente aderiscono al fondo piatto, e il metodo di aggiunta del mezzo non disturba le cellule. Diversi tipi di cellule fanno prendere più o meno tempo per iniziare ad aderire alla lastra di vetro-bottom.
7. Sostituire tutte le droghe esogeni o fattori di crescita in questo momento per mantenere i livelli di concentrazione precedenti.
8. Riportare i test per la 37 ° C incubatore, tranne quando vengono esaminati al microscopio. Quantificare i risultati di questo test da immagini microscopiche. In breve, contare i fili di invasione perineurale conin quattro quadranti usando un'immagine microscopica 4X.
   NOTA: Un microscopio con un 4X capacità oggettivi e fluorescenza è adeguata per la foto-documentare i test. La dimensione dei saggi adatta bene all'interno del campo di un obiettivo 4X, che è dettagliato sufficiente a catturare le singole aree di invasione perineurale. invasione perineurale si manifesta entro 24 ore, ma dopo 48 h, l'integrità dei saggi comincia a indebolirsi, come le cellule tumorali dividono lungo la periferia della matrice e invadere. Al di là di 48 ore, vi è anche sostanziale efflusso dei fibroblasti del DRG, che oscura la visualizzazione usando la microscopia in campo chiaro. Pertanto, è consigliabile foto-documento i risultati con 4X microscopia almeno due volte durante questa finestra (ad esempio, a 24 e 48 ore dopo placcatura le cellule tumorali). Essere consapevoli che questi sono saggi 3-dimensionale, ed è difficile completamente l'immagine intero test. Più invasione perineurale si verifica in un piano dal basso della piastra, dove tegli cellule sono incorporati nella matrice leggermente sopra il fondo della piastra. Poiché questo piano è vicino a orizzontale, la stragrande maggioranza dei neuriti con cellule tumorali vengono catturate un'immagine singolo livello 4X in.

Risultati

Dopo la dissezione del DRG e il posizionamento all'interno della gocciolina di matrice, l'aspetto del dosaggio dovrebbe assomigliare alla Figura 1. Si noti che il DRG non sia perfettamente circolare, ma è centrato all'interno della gocciolina di matrice. Questo permette la conseguenza di neuriti a 360 gradi, illustrata parzialmente in figura 2. Essere consapevoli del fatto che alcune parti del DRG inviano neuriti più velocemente e in numero maggiore risp...

Discussione

I passaggi critici all'interno del protocollo

I passi più importanti all'interno di questo protocollo sono la dissezione precisa e l'estrazione del gangli spinali. La corretta resezione della colonna vertebrale e una divisione linea mediana-longitudinale in due emi-spine sono fondamentali per ottenere un gran numero di DRG. Durante la dissezione dei singoli DRG, il ganglio non dovrebbe mai essere gestiti direttamente, ma piuttosto la fascia circostanti deve esser...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM/F-12 50/50 Miscela con L-glutammina e 15 mM HEPES	Corning Cellgro	10-090-CV	Manassas, VA
Siero fetale bovino	Atlanta biologicals	S11150	Flowery Branch, GA
0,25% Tripsina-EDTA (1x)	Life Technologies Corporation	25200056	Grand Island, NY
Soluzione salina tamponata con fosfato 1x	Corning	21-040-CM	Manassas, VA
Matrigel hESC-Qualif Mouse	Corning Incorporated	354277	Bedford, MA
Piastre di coltura con fondo in vetro da 35 mm irradiate con raggi gamma	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	Ashland, MA
SteREO Discovery.V8 Microscopio operatorio	Carl Zeiss Microimaging	495015-0021-000	Thornwood, NY
Sorgente luminosa Schott ACE I	Schott	A20500	Germania
CellTracker	Life Technologies Corporation	C2925	Carlsbad, CA
BD Ago PrecisionGlide 18 G e 21 G	BD	305195	Franklin Lakes, NJ
Pinzetta per microdissezione Premium	Harvard Apparatus	60-3851	Holliston, MA
Forbici standard operative di alta qualità	Harvard Apparatus	52-2789	Holliston, MA
Premium Spring Scissors	Harvard Apparecchio	60-3923	Holliston, MA
Pinze per medicazione	Apparecchio Harvard	72-8949	Holliston, MA
Topi nudi atimici (002019)	Jackson Laboratory	002019	Bar Harbor, ME