Articolo metodologico

Criosezionamento di regioni contigue di un muscolo scheletrico mouse unico per l'espressione genica e analisi istologiche

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DOI:

10.3791/55058

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12 dicembre 2016

1Department of Pharmaceutical and Biomedical Sciences, University of Georgia

In questo articolo

Sommario

Consecutivi crio-sezioni sono raccolti per consentire alle applicazioni istologiche e l'arricchimento di RNA per misure di espressione genica utilizzando zone adiacenti da un muscolo scheletrico singolo mouse. RNA di alta qualità si ottiene da 20 - 30 mg di criosezioni e le misure messe in comune sono direttamente confrontato tra le applicazioni.

Abstract

Con questo metodo, criosezioni consecutivi sono raccolti per permettere alle applicazioni di microscopia per istologia dei tessuti e l'arricchimento di RNA per l'espressione genica utilizzando zone adiacenti da un muscolo scheletrico singolo mouse. In genere, è difficile da ottenere una adeguata omogeneizzazione dei piccoli campioni del muscolo scheletrico a causa volumi buffer può essere troppo bassa per le applicazioni di macinazione efficiente, ma senza sufficiente rottura meccanica, l'architettura del tessuto denso di limiti muscolari penetrazione dei reagenti tampone, in ultima analisi, causando bassa resa di RNA. Seguendo il protocollo qui riportato, 30 sezioni micron sono raccolti ed aggregati permettendo criosezionamento e successiva omogeneizzazione ago per interrompere meccanicamente il muscolo, aumentando l'area superficiale esposta per la penetrazione buffer. I limiti principali della tecnica sono che richiede un criostato, ed è relativamente ridotto. Tuttavia, RNA di alta qualità può essere ottenuto da piccoli campioni di m poolcriosezioni uscle, rendendo questo metodo accessibile per molti muscoli scheletrici diversi e altri tessuti. Analisi Inoltre, questa tecnica permette abbinato (ad esempio, istopatologia tessuto e di espressione genica) dalle regioni adiacenti di un singolo muscolo scheletrico in modo che le misurazioni sono direttamente confrontabili tra applicazioni per ridurre l'incertezza sperimentale e per ridurre gli esperimenti su animali replicativi necessario fonte un piccolo tessuto per la applicazioni multiple.

Introduzione

L'obiettivo di questa tecnica è quello di rendere più analisi sperimentali diverse modalità, quali l'espressione genica e istologia, accessibili da un unico piccolo tessuto d'origine muscolo scheletrico. applicazioni Microscopia sono più sensibili al campione metodi di conservazione, che devono essere controllati con attenzione per limitare la formazione di manufatti cristalli di ghiaccio durante crioconservazione. Pertanto, lo sviluppo del metodo si basa sulla tibiale anteriore (TA) muscolare congelati parzialmente coperto di incorporamento di resina in un raffreddato con azoto liquido vasca 2-metilbutano -140 ° C come materiale sorgente per immunofluorescenza e analisi dell'espressione genica.

La necessità di utilizzare lo stesso materiale di base per diversi approcci tecnici è particolarmente importante per gli esperimenti di iniezione a base intramuscolare cui i muscoli a destra e sinistra rappresentano differenti condizioni, una sperimentale e uno di controllo. Ad esempio, in studi di rigenerazione muscolare, uno muSCLE viene iniettato con una tossina provocare danni ai tessuti diffusa mentre il muscolo controlaterale serve come un controllo del veicolo iniettato 1. Analogamente, studi di terapia genica per disturbi muscolari tipicamente iniziano con la convalida del vettore terapia genica mediante iniezione intramuscolare da confrontare con vettore vuoto, vector estranei o controllo del veicolo sul lato controlaterale 2. Pertanto, non è possibile reperire ogni muscolo TA a un'altra applicazione.

Le strategie comuni per affrontare questo problema sono i seguenti: i) per utilizzare un gruppo muscolare diverso per ogni applicazione, ii) di utilizzare topi aggiuntivi, o iii) per tagliare un pezzo di muscolo per ogni applicazione. Tuttavia, le differenze sostanziali tra i gruppi muscolari rendono difficile il confronto dei dati da applicazioni separate, e altri animali aumentano spese e sono scarsamente giustificata se esistono altre alternative. Dividendo il muscolo dopo la dissezione di procurarsi diverse applicazioni è il migliore che l'opzionen molti casi. Tuttavia, i pezzi muscolari sono spesso troppo piccole per utilizzare polverizzazione sotto azoto liquido o tecniche di macinazione meccanica per omogeneizzazione 2-5. Come il muscolo è un tessuto altamente strutturale ricco di proteine ​​della matrice extracellulare e contrattili, inadeguata omogeneizzazione meccanica porta ad una bassa resa di successive DNA, RNA o proteine. Il metodo descritto qui consente di piccole quantità di tessuto da un muscolo fonte per l'utilizzo in diverse applicazioni, e l'inclusione di criosezionamento e l'ago triturazione migliora omogeneizzazione meccanica per una migliore resa RNA.

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Protocollo

Tutte le procedure di animali sono state approvate dalla Università della Georgia Istituzionale cura degli animali e del Comitato uso in condizioni di utilizzo degli animali protocollo A2013 07-016 (Beda).

1. La crioconservazione di non fissato muscolo scheletrico

  1. Preparazione
    1. Tagliare il sughero in piccoli quadrati (circa 1 cm x 1 cm) con una lama di rasoio, scrivere sul sughero con un pennarello punta fine che è resistente alla 2-metilbutano per identificare il mouse sorgente e muscolare, e fare un taglio molto bassa (circa 1mm) sulla superficie superiore. Inserire un vetrino di plastica nel taglio da utilizzare per orientare il tessuto. Ripetere fino a quando un tappo di sughero è pronto per ogni tessuto per essere crioconservati.
    2. Ottenere azoto liquido, 2-metilbutano, resina embedding, termometro a bassa temperatura, tappi, strumenti di dissezione e mouse studio.
      ATTENZIONE: Liquido di azoto è un gas compresso che può esplodere se riscaldato. Indossare un camice da laboratorio, guanti a bassa temperatura, e la faccia durante la manipolazione del liquido niTrogen; contatto con la pelle o con gli occhi può provocare ustioni o congelamento. 2-metilbutano è un pericolo per l'ambiente infiammabile, tossico, salute e. Indossare dispositivi di protezione individuale (camice, guanti, occhiali di sicurezza), aprire il contenitore magazzino in una cappa aspirante, trasferire la piccola quantità necessaria per il congelamento (in genere da 200 a 400 ml) per un contenitore separato che può essere ben chiuso, e di evitare l'inalazione .
    3. Euthanize topi con un metodo approvato dell'eutanasia sotto anestesia. In breve, inserire il mouse in una camera di inalazione con il 2,5% isoflurano in ossigeno da un vaporizzatore isoflurano, attendere 20 secondi dopo il mouse smette di muoversi per verificare la presenza di un riflesso del pedale. Quando il riflesso pedale è negativo, eutanasia il mouse studio per dislocazione cervicale 6.
      NOTA: metodi di eutanasia richiedono l'approvazione da parte del comitato etico istituzionale.
    4. Togliere la pelle sovrastante il hindlimb distale e tagliare i tendini anteriori distali appena sopra la caviglia, con punta fine Disseforbici ction. Afferrare i tendini distali con una pinza sottile e delicatamente tirare su e verso il ginocchio, mentre il taglio fascia laterale per rilasciare la muscolatura. Estrarre il muscolo fuori perpendicolarmente dal ginocchio e fare un taglio finale di asportare il muscolo TA 7.
      NOTA: Il muscolo TA viene qui utilizzato come esempio, ma qualsiasi mouse muscolo scheletrico o cuore può essere sostituito per il TA in questo protocollo, se opportuno obiettivi sperimentali dell'utente. L'unica limitazione è che un tessuto deve essere abbastanza piccolo per ottenere crioconservazione rapida tutta la sua profondità; Si consiglia una dimensione massima del tessuto cm 1 x 1 cm.
    5. Ripetere sulla gamba opposta, e sezionare eventuali altri tessuti da incassare. Eseguire dissezione più rapidamente possibile limitare la degradazione dei tessuti prima crioconservazione.
    6. Orient ogni muscolo per le sezioni trasversali sul suo sughero pre-etichettati. Basamento muscolo perpendicolare al sughero con il tendine distale toccare il tappo e la parte superiore della ext muscolarefinendo via, tenuto in posizione verticale dal vetrino.
    7. Cryopreserve tutti i tessuti per l'analisi istologica appena possibile dopo la dissezione, preferibilmente entro 5 minuti, ma sicuramente non più di 15 min tempo trascorso dalla euthanization dell'animale sorgente.
  2. Crioconservazione
    1. Iniziare il raffreddamento del bagno di crioconservazione cinque minuti prima della fine della dissezione. Versare 2-metilbutano in un becher metallo aperto ad una profondità di circa 3 cm. Versare azoto liquido in un contenitore isolato ad una profondità di 2 a 4 cm. Impostare il becher di 2-metilbutano in azoto liquido; l'azoto inizierà a bollire. Evitare gli schizzi di azoto nel bicchiere 2-metilbutano.
      ATTENZIONE: Preparare il congelamento bagno in una cappa o un luogo ben ventilato.
    2. Inserire un termometro a bassa temperatura in-2 metilbutano per monitorare la temperatura e mescolate spesso con una forchetta per garantire anche il raffreddamento. Continuare a mescolare e raffreddare fino a 2 methylbutane raggiunge -140 ° C, aggiungendo nuovi azoto liquido alla vasca esterna secondo necessità.
      NOTA: -140 ° C è la temperatura ottimale per ridurre al minimo gli artefatti di cristalli di ghiaccio nel muscolo striato; altri tessuti possono cryopreserve migliore a diverse temperature (ad esempio, il cervello, -90 ° C).
    3. Applicare resina incorporamento solo ai minori 35 - 50% del muscolo dove incontra il sughero e immediatamente cadere il tappo nella 2-metilbutano a -140 ° C. Rapidamente ripetere per un massimo di 8 tessuti per congelare batch. Agitare per 30 secondi, raschiando il fondo del recipiente per assicurare che i tessuti non congelano in solidificazione 2-metilbutano.
    4. Utilizzare una forchetta, cucchiaio fessurato o grandi pinze per tirare ogni tappo tessuto dal 2-metilbutano. rimuovere rapidamente il vetrino, tamponare l'eccesso di 2-metilbutano nel bicchiere, e poi cadere il tappo tessuto nel bagno di azoto esterno. Ripetere l'operazione per tutti i tappi rimanenti nel bicchiere.
    5. campioni di trasferimento in azoto liquido o in ghiaccio secco a-80 ° C per una conservazione.
    6. Se i tessuti rimangono per la crioconservazione, ripetere i passaggi da 1.2.3 a 1.2.4. Aggiungere ulteriore 2-metilbutano al bicchiere o azoto liquido per il bagno esterno, se necessario, e ri-cool a -140 ° C. Smaltire usato 2-metilbutano come rifiuti pericolosi.

2. Raccogliere criosezioni per l'istologia e RNA Applicazioni

  1. Preparazione.
    1. Pre-pesare un tubo autoclavato DNasi / RNasi libero-su una bilancia analitica. Poi, spostarlo nella camera criostato a preraffreddare. Ripetere fino a quando i tubi sono pronti per tutti i campioni cryosection in pool da raccogliere.
    2. Per sezionamento muscolo scheletrico, verificare che la temperatura della camera criostato è -21 a -22 ° C dal suo termostato interno. Trasferire i contenitori con i tessuti da tagliare nella camera e consentire al contenitore (s) raggiunga la temperatura criostato per almeno 15 minuti prima dell'apertura.
    3. Inserire una nuova lama criostato usa e getta. In alternativa, rimuovere la lama esistente, spruzzare con la soluzione di decontaminazione RNasi, sciacquare con DDH 2 O, e reinserire nel criostato a raffreddare. Spruzzare un panno pulito con il 70% di etanolo e pulire accuratamente la piattaforma di bloccaggio della lama e la lama.
      1. Spruzzare un panno pulito con una soluzione di decontaminazione RNasi e pulire pennelli criostato. Spruzzare un tessuto con DDH 2 O, pulire di nuovo le spazzole e metterli nella camera criostato su una superficie pulita.
        ATTENZIONE: La lama criostato dovrebbe essere coperto dalla guardia coltello quando non in uso. Inoltre, soluzione decontaminante RNasi è tossico e si blocca per formare un precipitato nella camera criostato fredda. Pertanto, maneggiare con cura ed evitare il suo uso nella camera criostato.
    4. All'interno della camera criostato, mettere un monetina dimensioni goccia (circa 300 ml) di incorporare in resina su un mandrino esemplare caldo, impostare un tappo di sughero di tessuto sulla parte superiore della resina, premere verso il basso, e quindi impostare il mandrino in freezing treno o su un elemento di congelamento rapido, se disponibile.
    5. Dopo l'incorporamento solidifica resina (bianco), aggiungere resina embedding aggiuntivo sulla parte superiore del tappo, intorno al 35% più basso del tessuto e premere l'estrattore di calore nella resina embedding di congelamento rapido per stabilizzare meglio il tessuto. Attendere 5 min prima di sezionamento per permettere alla resina di indurire completamente.
    6. Assicurarsi che il morsetto portacampione è nella sua posizione più arretrata, più lontana dalla lama. Inserire il mandrino tessuto provino nel morsetto campione.
  2. preparazione Cryosection.
    1. Allentare il supporto portante della lama, impostare l'angolo di spoglia della lama di 10 ° (o un angolo appropriato per il vettore lama usata), e serrare nuovamente. Rilasciare il freno e ruotare il volantino per abbassare il muscolo verso la lama. Stimare la distanza minima tra il tessuto e la lama, quindi spostare il tessuto lontano dalla lama e inserire il freno di volantino.
    2. Allentare la leve di regolazione dell'altezzar e spostare il portalama in avanti o indietro, rispettivamente se la fine del tessuto è superiore a circa 2 mm dalla lama o se la lama colpisce il tessuto. Serrare e abbassare nuovamente il tessuto per controllare la distanza dalla lama. Ripetere regolazioni fino a quando la lama è da 1 a 2 mm dall'estremità del tessuto dalla stima visiva.
    3. Abbassare il tessuto verso la lama e valutare l'angolo di tessuto per sezioni trasversali. Bloccare il volantino e rilasciare la leva di bloccaggio del campione. Premere il morsetto portacampione sinistra oa destra fino l'orientamento orizzontale del tessuto è perpendicolare alla lama.
    4. Spingere il campione Fissare su o giù per regolare l'orientamento "y" in modo che le sezioni di tessuto saranno perpendicolari all'asse lungo del muscolo. Stringere la leva di bloccaggio del campione.
    5. Utilizzare il corso e flusso fine in avanti per far avanzare il campione fino a quando non tocca appena la lama. Se cerca di sezioni da una particolare profondità dei tessuti, reimpostare la somma di sezione spessori a zero (superiore del tessuto).
    6. Impostare il criostato alla funzione di assetto con spessore di sezione a 30 micron. Tagliare ed eliminare sezioni fino a raggiungere la profondità prescelta per la raccolta del tessuto (ad esempio, 400 micron dall'alto).
  3. Raccogliere criosezioni per l'estrazione di RNA.
    1. Aprire il tubo per le sezioni che raccolgono e posizionarlo vicino al vettore lama. Utilizzare un pennello pre-raffreddata pulito per prelevare ciascuna sezione come è tagliato dalla lama e trasferire il cryosection nel tubo. Ripetere fino a quando le sezioni pool pesano 30 mg o viene raggiunta la profondità del tessuto desiderato.
      NOTA: Per un tibiale anteriore topo adulto, raccolta dalla profondità del tessuto di circa 400 a 4.000 micron produce tipicamente 25 - 40 mg. Utilizzando pinze metalliche per trasferire le sezioni di tubo di raccolta non è raccomandato come sezioni tendono ad attaccarsi e ciuffo sulla superficie del metallo.
    2. Se embedding resina circonda la cryosection muscolare, bloccare il freno a mano e utilizzare una lama di rasoio perradere pezzetti di resina fino vi è solo uno strato sottile intorno alla parte superiore del muscolo. resina tagliare sempre con la lama inclinata lontano dal muscolo.
      NOTA: un sottile strato di resina embedding non alterare sensibilmente la preparazione di RNA a valle. Se è presente più spesso in resina embedding, usare i pennelli per prendere in giro via dal muscolo prima di spostare il cryosection nel tubo di raccolta.
    3. In alternativa, piscina sezioni sul supporto della lama e il trasferimento in massa al tubo di raccolta.
      NOTA: Tuttavia, questo metodo tende ad essere più lento, e le sezioni sono più propensi a bastone e raggrupparsi, che può ridurre l'efficienza della ago omogeneizzazione nei passaggi successivi.
    4. posizionare rapidamente il tubo cryosection pool in un equilibrio e il tubo di registrare il peso analitico. restituire immediatamente la provetta alla camera criostato fredda per mantenere la temperatura sezione vicino -20 ° C. Calcolare il peso delle sezioni pool.
      NOTA: Se l'isolamento di RNA avverrà annunciogiorno ifferent, memorizzare il tubo cryosection pool a -80 ° C fino al momento dell'uso.
  4. Raccogliere criosezioni per istologia.
    1. Premere il pulsante di spessore della sezione per il sezionamento e utilizzare le frecce sottili per impostare lo spessore della sezione criostato a 7 micron (o altro spessore di sezione appropriata, in genere da 6 a 10 micron).
      NOTA: Diluente sezioni (da 6 a 10 micron) devono essere utilizzati per applicazioni istologiche per garantire che i reagenti di colorazione può penetrare la profondità della sezione di tessuto. Le sezioni sottili possono essere prelevati da qualsiasi profondità durante il criosezionamento, ma le sezioni più profonde sono da preferire perché embedding resina, che aumenta con la profondità dei tessuti, non compromette colorazione istologica.
    2. Tagliare e gettare da 4 a 7 sezioni per ottenere una superficie uniforme, tessuto. Prendere nota della profondità dei tessuti.
    3. Tagliare una sezione e orientarla sulla superficie del supporto della lama. Raccogliete la sezione in fretta e delicatamente toccando un ambiente caldo (temperatura ambiente) vetrino da microscopiola sezione sul supporto lama. Riportare il vetrino a temperatura ambiente. Continuare fino ad ottenere il numero di diapositive prescelte. Prendere nota della profondità del tessuto finale.
      NOTA: Raccolta una seconda sezione (duplicato) per ogni tessuto è raccomandato.
    4. Con sezionamento completo, azionare il freno volantino, restituire l'esemplare in posizione posteriore-più, e rimuovere il mandrino tessuti. Utilizzare l'elemento di calore criostato per sciogliere la resina embedding tenendo il tappo di sughero tessuto sul mandrino campione. Rimuovere sughero tessuto, asciugare con il tessuto, e tornare allo stoccaggio.
    5. Ripetere dal punto 2.1.2 per ciascun tessuto rimanente. Lasciare i vetrini si asciughino per 20 minuti dopo l'ultimo tessuto viene montato. Quindi, utilizzare diapositive per istologica o immunofluorescenza colorazione o congelamento a -80 ° C in una scatola di scorrimento fino a quando necessario.

3. Isolamento di RNA da Pooled criosezioni

  1. estrazione di RNA
    1. tubo Move (s) di criosezioni pool di ghiaccio. Aggiungere immediatamente unorganico reattivo estrazione di RNA in un rapporto di circa 1 ml di reagente per 50 mg di peso cryosection, tipicamente 600 microlitri per provetta.
      ATTENZIONE: RNA reagenti di isolamento sono tossici, corrosivi e irritanti. Seguire le istruzioni del produttore per una manipolazione sicura.
    2. Usando una siringa da 1 ml con un ago calibro 18, richiamare l'RNA estrazione liquido e lavare le pareti del tubo fino a tutto il tessuto viene sospeso in soluzione. Cercare di ridurre al minimo le bolle d'aria durante l'ago omogeneizzazione.
    3. Utilizzare la punta dell'ago per schiacciare e disperdere eventuali criosezioni aggregata e pezzi che aderiscono alla parete del tubo. Triturate per omogeneizzare facendo passare il campione su e giù attraverso l'ago per cinque colpi, e poi riportare il campione in ghiaccio. Ripetere entrambi i passaggi tre a cinque volte, o il numero di volte necessario per interrompere tutti grumi e passare il campione facilmente attraverso l'ago.
    4. Rimuovere l'ago calibro 18 e sostituirlo con un ago calibro 22. attenzione TRiturate il campione per cinque colpi, e poi tornare il campione in ghiaccio. Ripetere la triturazione tre a quattro volte per ottenere un tessuto omogenato finemente disperso.
      NOTA: Se le particelle dei tessuti iniziano a bloccare l'ago in sede di elaborazione del campione, espellere tutta campione dalla siringa e tornare alla ago calibro 18 per un ulteriore omogeneizzazione. Un passo ulteriore triturazione con un ago 25 o 26 calibro può essere aggiunto per ottenere la resa massima. Tuttavia, l'ago può intasarsi cui vi è un rischio di fuoriuscita del campione.
    5. Spostare il campione di ghiaccio a temperatura ambiente. Incubare per 5 minuti per distruggere complessi molecolari.
    6. In una cappa aspirante, aggiungere 0,1 ml di 1-bromo-3-chloropentane (BCP) per 1 ml di reagente isolamento dell'RNA utilizzato (fase 3.1.1), in genere 60 ml per provetta. Agitare la provetta vigorosamente a mano per 15 secondi (non vortex). Incubare il campione a temperatura ambiente per 2 a 3 min. Poi, centrifugare per 15 min a 12.000 xg e 4 ° C.
      ATTENZIONE: BCP è infiammabile e tossico. Maniglia in una cappa aspirante e indossare guanti, un camice da laboratorio e occhiali di sicurezza.
    7. Raccogliere accuratamente la fase acquosa superiore (incolore) contenente RNA e trasferirlo in una provetta pulita. Aggiungere un uguale volume di etanolo al 70% (in acqua DEPC) e agitare per miscelare. Incubare a temperatura ambiente per un massimo di 10 min.
      NOTA: l'interfase medio e fasi di fenolo-BCP inferiori possono essere trattati per DNA genomico e proteine, rispettivamente, secondo le istruzioni del produttore o raccolti in un fenolo-BCP contenitore per rifiuti pericolosi per un appropriato smaltimento.
  2. purificazione dell'RNA.
    1. Seguire le istruzioni del produttore per vincolante del campione, il lavaggio e la eluizione con lievi 8 varianti. Per esempio:
    2. Posizionare una aliquota di acqua DNasi / RNasi-free in un bagno C 37 ° o incubatore di pre-caldo per passo 3.2.4.
    3. Aggiungere il campione di RNA da 3.1.8 sopra ad una colonna di purificazione e centrifugare il campione per 15 seca 12.000 xg a temperatura ambiente. Versare il flusso attraverso indietro nella stessa colonna e ri-centrifuga. Ripetere una volta in più per massimizzare il legame RNA, e poi scarta il flusso finale attraverso.
    4. Eseguire i passaggi di lavaggio in base alle istruzioni del produttore 8. Applicare 700 ml di tampone di lavaggio (senza etanolo) alla colonna centrifugare per 15 secondi a 12.000 xg, e scartare il flusso attraverso.
    5. Aggiungere 500 pl di tampone di lavaggio (con etanolo) alla colonna centrifugare per 15 secondi a 12.000 xg, ed eliminare il flusso attraverso. Ripetere questa operazione una sola volta.
    6. Centrifugare vuoto per 1 min a 12.000 xg per asciugare la membrana.
    7. Trasferire la colonna di selezione per un RNasi pulito, tubo-free DNasi. Aggiungere 40 ml di acqua preriscaldata DNasi / RNasi-free (da 3.2.1) al centro della membrana colonna. A temperatura ambiente, incubare per 2 minuti e quindi si centrifuga per 2 minuti a 12.000 x g.
      NOTA: Il volume di eluizione di 40 ml è di circa 1,3 ml per mg di originaletessuti per 30 mg di criosezioni pool. Regolare il volume di eluizione come appropriato per i diversi pesi dei tessuti di partenza, ma non abbassare al di sotto di 32 ml. Una seconda eluizione, con circa 0,7 ml per mg di tessuto originale, può essere aggiunto per aumentare il rendimento totale RNA.
    8. Analizzare l'RNA (colonna eluizione) per la concentrazione e la purezza da uno spettrofotometro, elettroforesi, e / o un bioanalyzer. Conservare l'RNA a -80 ° C fino al momento della applicazioni a valle, come trascrizione inversa per la PCR quantitativa 4.
      NOTA: Si consiglia un trattamento DNasi prima di utilizzare l'RNA in applicazioni a valle. Questo trattamento può essere effettuato su alcune colonne di purificazione dell'RNA prima della fase di lavaggio, a questo punto specifico colonna seguente eluizione, o su una aliquota di RNA come primo passo in qualsiasi applicazione valle. L'RNA deve essere stabile per diversi anni.

4. analisi istologica da immunofluorescente Staining di criosezioni muscolari

  1. Semplice protocollo di immunofluorescenza.
    1. Utilizzare una penna idrofobico fare il giro del gruppo di sezioni in ogni diapositiva. Delicatamente rilasciare PBS nella zona cerchiata (circa 80 ml per una piccola superficie fino a 500 microlitri per una grande superficie), facendo attenzione a non toccare i tessuti. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
      NOTA: Se si utilizza diapositive congelati, rimuovere diapositive da -80 ° C congelatore e incubare a temperatura ambiente per 20 a 30 minuti per scongelare e asciutto, quindi procedere come sopra. Sono necessari almeno due diapositive: una diapositiva sperimentale da incubato in anticorpo primario e secondario; e uno scivolo di controllo per il quale anticorpo primario è escluso, "l'unica secondario" di controllo.
    2. Suggerimento la slitta per versare fuori PBS. Aggiungere 5% di siero asino in PBS (soluzione di saturazione) per l'area cerchiata; essere attenti a garantire che le sezioni muscolari non si seccano. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti (o fino a diverse ore in una camera umida).
    3. Preparare la soluzione anticorpo primario per analizzare la rigenerazione muscolare. Mescolare soluzione bloccante, con un anticorpo eMHC (01:40) e un anticorpo ColVI (1: 1.000). Preparare circa 150 ml, 300 ml o 500 ml per piccole, medie o grandi superfici di scorrimento, rispettivamente. Vortex per 5 secondi, e poi centrifugare per 2 min a 15.000 xg per far sedimentare i precipitato.
    4. Per diapositive sperimentali, punta la slitta per versare fuori il blocco soluzione e quindi aggiungere soluzione di anticorpo primario dal 4.1.3. Per il vetrino di controllo secondario, punta la slitta per versare fuori il blocco soluzione e quindi aggiungere la soluzione bloccante fresco (senza anticorpi). Incubare i vetrini in una camera umida a 4 ° C durante la notte.
      NOTA: Quando pipettando soluzioni di anticorpi su vetrini, tirare sempre liquido dalla parte superiore del tubo di soluzione di anticorpo primario, non disturbare l'eventuale precipitato sul fondo della provetta.
    5. Suggerimento scivola a versare off soluzione. Aggiungere PBS goccia a goccia alla regione cerchiata di ogni diapositiva per lavare, punta a versareoff, quindi aggiungere più PBS e incubare per 3 a 5 min. Ripetere per un totale di tre lavaggi.
      NOTA: Il tempo di lavaggio è molto flessibile e può essere allungato fino a 20 minuti se lo si desidera. Generalmente, il numero di modifiche soluzione è più importante del tempo.
    6. Preparare la soluzione di anticorpo secondario per tutte le diapositive (compreso il vetrino di controllo secondario) utilizzando una diluizione 1: 500 di anticorpi secondari rossi e verdi fluoroforo accoppiato per rilevare IgG1 mouse (eMHC) e IgG di coniglio (ColVI) e 1: 10.000 diluizione DAPI nucleare macchia.
      1. Ad esempio, mescolare 1 ml di DAPI con 9 ml di DDH 2 O per fare una diluizione 1:10 di DAPI. Poi, per un volume finale ml 500, aggiungere 1,0 microlitri anti-topo IgG1-rosso + 1,0 microlitri anti-coniglio IgG-verde + 0,5 l di 01:10 DAPI a 447,5 ml di soluzione bloccante. Vortex per mescolare e centrifugare per 2 minuti a 15.000 xg per far sedimentare i precipitato.
        NOTA: Idealmente, tutti gli anticorpi secondari dovrebbe essere dalle stesse specie ospite.
    7. Suggerimento le diapositive per versare fuori l'ultimo lavaggio PBS. Aggiungere la soluzione anticorpo secondario per coprire tutti i tessuti. Coprire i vetrini per proteggerli dalla luce e incubare a temperatura ambiente per 30 min.
      NOTA: Tutti gli anticorpi secondari devono essere convalidati per avere reattività crociata minimo con altre specie negli esperimenti doppia etichettatura.
    8. Lavare i vetrini come descritto in 4.1.5. Dopo l'ultimo lavaggio, capovolgere la slitta per versare fuori dal PBS e impostare la diapositiva su un tessuto. Aggiungere 3 a 4 gocce di un mezzo di montaggio acquoso lungo un lato.
    9. Impostare il bordo di un vetrino di vetro appena al bordo esterno del supporto di montaggio. Utilizzando pinze, abbassare lentamente il vetrino verso i tessuti, quindi, rilasciare il vetrino e picchiettare delicatamente in posizione. Infine, premere delicatamente ogni angolo del vetrino per stabilizzarlo.
    10. Proteggere le diapositive dalla luce e conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso.
      NOTA: Per la conservazione a lungo termine, applicare un sottile strato di smalto lungo il bordo di The vetrino per aiutare a prevenire il vetrino si secchi.
  2. la valutazione istologica.
    1. Immagine le diapositive utilizzando un epifluorescente o microscopio confocale con filtri appropriati per rilevare eMHC (rosso); ColVI (verde); e nuclei (blu) DAPI-macchiato, in genere utilizzando un 20X obiettivo 1,5.
    2. Verificare che il segnale fluorescente da diapositive sperimentali è diverso dal vetrino di controllo secondario per dimostrare la specificità del eMHC e ColVI rilevamento 4.
      NOTA: eMHC fibre rigeneranti positivi dovrebbero essere visibili da circa 2 a 7 giorni dopo un infortunio muscolare e variabile nei topi con distrofia muscolare. Il collagene VI è presente nella matrice extracellulare che circonda le fibre muscolari, vasi sanguigni e nervi e nei grandi fasci di tessuto connettivo peri- e epimisio. DAPI nucleare macchia è utile identificare fibre muscolari con nuclei centrali rispetto nuclei periferico indicano rigenerazione delle fibre, e la presenza di infiltrating cellule. fibre necrotiche o feriti possono macchiare debolmente con l'anticorpo secondario IgG di topo a causa del rilevamento di endogena IgG che penetra le fibre attraverso le membrane muscolari danneggiate.
    3. Per quantificare la rigenerazione, scattare foto sovrapposte con il microscopio a fluorescenza ogni filtro attraverso l'intera immagine. Unire le immagini eMHC, ColVI e DAPI per ogni posizione e quindi allineare le immagini per ricostruire una mappa di tutta la sezione 1,5.
    4. Utilizzando il software di analisi, contare il numero di fibre positivi eMHC e il numero di fibre totali per calcolare recente rigenerazione (100 * (# eMHC + fibre / # fibre totali)). Inoltre, contare il numero di fibre centralmente nucleati su fibre totali per misurare la rigenerazione su un periodo più lungo (fibre 100 * (# CN + fibre / # totali)) 1,5.

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Risultati

Muscle cryosection RNA è ad alto contenuto di qualità e fornisce il rendimento sufficiente per la maggior parte delle applicazioni

Analisi di sedici preparati di RNA muscolo scheletrico sono mostrati nella Tabella 1 utilizzando 19,4 a 41 mg di pool muscolo tibiale anteriore (TA) da 8 topi di controllo. Sia a sinistra (L) e destra muscoli (R) TA sono stati preparati in esperimenti di rigenerazione con muscoli racc...

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Discussione

Per ottenere i migliori risultati con questo metodo, tenere embedding resina limitato al terzo inferiore o mezza del muscolo durante la crioconservazione di tessuto, perché la resina in eccesso rallenta la raccolta dei criosezioni pool e può aumentare l'incorporamento contaminazione resina nell'isolamento dell'RNA. Inoltre, attenzione durante dell'ago omogeneizzazione è importante per ottimizzare il rendimento e minimizzare la probabilità di intasamento dell'ago. Il protocollo può essere modificato u...

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Dichiarazioni

L'autrice dichiara di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Madison Grant, Steven Foltz, Halie Zastre e Junna Luan hanno fornito assistenza tecnica. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata dal National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases del National Institutes of Health con il numero di premio AR065077. Il contenuto è di esclusiva responsabilità dell'autore e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
SugheroVWR Scientific23420-708Tagliare in piccoli quadrati con una lama affilata.
Vetrino coprioggetti in plasticaFisher Scientific12-547Utilizzato per orientare il muscolo durante il congelamento.
Termometro a bassa temperaturaVWR Scientific89370-158
2-metilbutanoSigmaM32631-4LAttenzione: sostanza chimica pericolosa. Conservare in un armadio infiammabile.
Resina di inclusione: "cryomatrix"Thermo Fisher Scientific6769006Altre resine di inclusione possono essere sostituite alla cryomatrix.
CriostatoThermo Fisher Scientificmicrom HM550 con portalama monousoQualsiasi criostato funzionante dovrebbe essere sufficiente per il protocollo.
Lama monouso per criostatoThermo Fisher Scientific3052835Utilizzare una lama o un coltello appropriati per il criostato da utilizzare.
Soluzione di decontaminazione dell'RNAsi: "RNase Zap"Thermo Fisher ScientificAM9780
Bilancia analiticaMettler ToledoXS64
PennelloDaler Rowney214900920Utilizzare per gestire le criosezioni. Può essere trovato nei negozi con semplici forniture artistiche.
Lama di rasoioVWR Scientific55411-050
Vetrino per microscopioVWR Scientific48311600
Reagente per estrazione organica a RNA: TRIzolThermo Fisher Scientific15596026Attenzione: TRIzol è una sostanza chimica pericolosa. Nota: per l'estrazione dell'RNA dal muscolo scheletrico si raccomandano solo reagenti di estrazione organica.
Ago calibro 18VWR ScientificBD305185
ago calibro 22VWR ScientificBD305155
ago calibro 26VWR ScientificBD305115Opzionale. Può essere utilizzato per un terzo ciclo di triturazione del campione nel protocollo di estrazione dell'RNA.
Siringa da 1 mlVWR ScientificBD309659Per campioni di valore molto elevato, si consiglia una siringa Luer-Lok (es., VWR BD309628).
1-bromo-3-cloropentano (BCP)SigmaB9673
Per il 70% di etanolo in acqua DEPC: 200 alcol proofDecon Laboratories, Inc.+M18027161MMescolare 35 ml di alcol a 200 gradi + 15 ml di acqua DEPC.
Per il 70% di etanolo in acqua DEPC: acqua trattata con DEPCThermo Fisher ScientificAM9922Mix 35 ml di alcol 200 proof + 15 ml di acqua DEPC.
Kit di purificazione dell'RNA: PureLink RNA minikitThermo Fisher Scientific12183018AFasi finali della preparazione dell'RNA.
Acqua priva di DNasi/RNASI È possibile utilizzare anche acqua trattatacon Gibco10977
Spettrofotometro: Nanodrop 2000Thermo Fisher Scientific NanoDrop2000
Dnase IThermo Fisher ScientificAM2222Trattare l'RNA purificato per rimuovere qualsiasi contaminazione del DNA prima delle applicazioni a valle.
Penna idrofobicaThermo Fisher Scientific8899
Dulbecco's PBSGibco14190PBS per protocollo di immunofluorescenza.
Siero d'asinoJackson ImmunoResearch Laoratories, Inc017-000-121Reidratare il normale stock di siero d'asino secondo le istruzioni del produttore, quindi diluire un'aliquota al 5% per l'immunofluorescenza. Può essere utilizzato anche il normale siero di capra.
eMHC AnticorpoUniversità dell'Iowa Studi sullo sviluppo Ibridoma BancaF1.652
Anticorpo Collagene VIFitzgerald Industries#70R-CR009x
Asino anti-coniglio AlexaFluor488Thermo Fisher ScientificA21206
Capra anti-topo IgG1 AlexaFluor546Thermo Fisher ScientificA21123
DAPI (4',6- diamidino-2-fenilidolo)Thermo Fisher ScientificD1306
Mezzi di montaggio acquosi: PermafluorThermo Fisher ScientificTA-030-FMUtilizzare solo mezzi di montaggio progettati per applicazioni fluorescenti con proprietà anti-sbiadimento.
Vetrino coprioggettiVWR Scientific16004-314Utilizzo per il montaggio di vetrini alla fine del protocollo di immunofluorescenza
Software di analisi delle immagini: ImageProExpressMedia Cybernetics, Inc.Image-Pro Express, o prodotti più avanzatiFreeware ImageJ dovrebbero funzionare anche per il conteggio manuale. Software più avanzati con capacità di segmentazione possono consentire una parziale automazione del processo; ad esempio, ImageProPremier.
Unisci e mappa le immagini delle sezioni: PhotoshopAdobePhotoshop
CardiotoxinSigmaC9659Sigma C9659 è stato interrotto. Altre opzioni per la cardiotossina sono EMD Millipore #217503; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618; o Ge Script # RP17303; Ma questi non sono stati convalidati.
Kit di trascrizione inversa: Sistema di sintesi del primo filamento Superscript IIIThermo Fisher Scientific18080051È possibile utilizzare qualsiasi reagente di trascrizione inversa convalidato e di alta qualità.
PCR standard: Sistema GoTaq Flexi polimerasiPromegaM8298È possibile utilizzare qualsiasi sistema Taq polimerasi convalidato e di alta qualità. Se il sequenziamento del DNA deve essere utilizzato per qualsiasi applicazione a valle della PCR, è necessario utilizzare un sistema PCR ad alta fedeltà.
SYBR verdeThermo Fisher ScientificS7585Per l'uso in qPCR quando non si utilizza una master mix qPCR dedicata. Utilizzabile con SuperROX (per strumenti Applied Biosystems) e GoTaq Flexi polimerasi e tamponi.
ROX: SuperROX, 15 mMBioResearch Technologies, Inc. Novato CASR-1000-10SuperROX è più stabile nella reazione PCR, quindi è preferibile per l'uso come colorante di riferimento passivo qPCR rispetto a ROX (carbossi-X-rodamina). Per qPCR con strumenti Applied Biosystems
PCR in tempo realeApplied Biosystems7900HT
DEPC.

Riferimenti

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