La mappatura del sito di legame di un Aptamero su ATP Utilizzando MicroScale termoforesi

Sommario

MicroScale Thermophoresis (MST) è una tecnologia sensibile per caratterizzare le interazioni aptamero-bersaglio. Questo manoscritto descrive un protocollo MST per caratterizzare le interazioni aptamero-piccola molecola.

Abstract

La caratterizzazione delle interazioni molecolari in termini di parametri di legame di base come l'affinità di legame, la stechiometria e la termodinamica è un passo essenziale nella scienza di base e applicata. La termoforesi su microscala (MST) è un metodo biofisico sensibile per ottenere queste importanti informazioni. Basandosi su un effetto fisico chiamato termoforesi, che descrive il movimento delle molecole attraverso gradienti di temperatura, questa tecnologia consente la determinazione rapida e precisa dei parametri di legame in soluzione e consente la libera scelta delle condizioni del tampone (dal tampone ai lisati/sieri). La MST utilizza il fatto che una molecola non legata mostra un movimento termoforetico diverso rispetto a una molecola che è in complesso con un partner di legame. Il movimento termoforetico è alterato nel momento dell'interazione molecolare a causa di cambiamenti nelle dimensioni, nella carica e nell'idratazione del guscio. Confrontando i profili di movimento di diversi rapporti molecolari dei due partner di legame, è possibile determinare informazioni quantitative come l'affinità di legame (da pM a mM). Anche le interazioni difficili tra molecole di piccole dimensioni, come aptameri e piccoli composti, possono essere studiate mediante MST. Utilizzando l'interazione del modello ben studiata tra l'aptamero di DNA DH25.42 e l'ATP, questo manoscritto fornisce un protocollo per caratterizzare le interazioni aptamero-piccola molecola. Questo studio dimostra che l'MST è altamente sensibile e permette la mappatura del sito di legame dell'aptamero del DNA da 7,9 kDa all'adenina dell'ATP.

Introduzione

L'interazione tra le molecole è la base della natura. Quindi, gli scienziati in molti campi della ricerca di base e applicata cercano di capire i principi fondamentali delle interazioni molecolari di diversi tipi. MicroScale termoforesi (MST) consente agli scienziati di effettuare il veloce, preciso, caratterizzazione economicamente efficiente e di qualità controllata delle interazioni molecolari in soluzione, con una scelta di buffer. Ci sono già più di 1.000 pubblicazioni utilizzando MST, a partire dal 2016 da solo, che descrive i diversi tipi di analisi, tra cui proiezioni di libreria, convalide di eventi, analisi della concorrenza, e gli esperimenti di legame....

Protocollo

1. Preparazione del lavoro Aptamero l'Archivio

1. Seguire le istruzioni del produttore e sciogliere il oligonucleotide (5-Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, la sequenza di riferimento ¹⁸⁾ in acqua, raggiungendo una concentrazione finale di 100 micron.
2. Preparare la soluzione aptameri di lavoro diluendo lo stock oligonucleotide a 200 Nm con tampone assorbente (20 mM Tris, pH 7,6; 300 mM NaCl, 5 mM MgCl _2; 0,01% Tween20).
3. Incubare la miscela per 2 minuti a 90 ° C, lasciate raffreddare il campione immediatamente sul ghiaccio, e utilizzare il campione a temperatura ambiente.

2. Preparazi....

Risultati

In questo studio, MST è stato applicato per caratterizzare il sito di legame del DNA aptamer DH25.42 ¹⁸ ATP. A differenza di altri studi che caratterizzano l'interazione di ATP o ATP-mimando piccole molecole con proteine marcate casualmente con uno o più fluorofori ^38-40, questo studio include una etichetta versione del aptamer 7,9 kDa ssDNA con una molecola Cy5 sull'estremità 5' . Diversi derivati ​​ATP e molecole correlate, che differiscono da ATP in v.......

Discussione

Controlli di qualità:

Aspecifico sticking / adsorbimento di materiale campione a superfici, così come gli effetti di aggregazione, hanno una influenza notevole sulla qualità dei dati di affinità. Tuttavia, solo un paio di tecnologie state-of-the-art offrono opzioni precise e rapide per monitorare ed evitare questi effetti. MST offre controlli di qualità integrati che consentono di rilevare e aiutano a superare questi problemi, consentendo l'ottimizzazione graduale della configurazione tecni.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
		legante aptamero	20 mM Tris pH 7,6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0,01% Tween-20
Aptamero ATP marcato in fluorescenza	IDT, Lovanio, Belgio		sequenza: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT- ATTGCGGAGGAAGG-3
ATP	Sigma Aldrich, Germania	A2383	10 mM di soluzioni stock conservate a - 20 gradi C
ADP	Sigma Aldrich, Germania	A2754	10 mM di soluzioni stock conservate a - 20 gradi C
AMP	Sigma Aldrich, Germania	A2252	10 mM di soluzioni stock conservate a - 20 gradi C
Adenina	Sigma Aldrich, Germania	A8626	10 mM di soluzioni stock conservate a - 20 gradi C
SAM	Sigma Aldrich, Germania	A7007	10 mM di soluzioni stock conservate a - 20 gradi C
dATP	Sigma Aldrich, Germania	11934511001	10 mM di soluzioni stock conservate a - 20 gradi C
CTP	Sigma Aldrich, Germania	C1506	10 mM di soluzioni stock conservate a - 20 gradi C
GTP	Sigma Aldrich, Germania	G8877	10 mM di soluzioni stock conservate a - 20 gradi C
Monolite NT.115	NanoTemper Technologies, Monaco di Baviera, Germania	MO-G008	Canale blu/rosso Dispositivo MST con rivelatore standard, Monolith NT115 pico è un dispositivo MST con rivelatore ad alta sensibilità
Monolith NT.115 capillari Standard	NanoTemper Technologies, Monaco di Baviera, Germania	MO-K002
Provette Eppendorf PCR	Eppendorf, Germania	30124537
Software di controllo Monolith. 2.1.33, preinstallato su il dispositivo	NanoTemper Technologies, Monaco di Baviera, Germania
MO.affinity analysis v2.1.1	NanoTemper Technologies, Monaco di Baviera, Germania
Kaleidagraph 4.5.2	Synergy Software

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