La mappatura del sito di legame di un Aptamero su ATP Utilizzando MicroScale termoforesi

Summary

MicroScale Thermophoresis (MST) è una tecnologia sensibile per caratterizzare le interazioni aptamero-bersaglio. Questo manoscritto descrive un protocollo MST per caratterizzare le interazioni aptamero-piccola molecola.

Abstract

La caratterizzazione delle interazioni molecolari in termini di parametri di legame di base come l'affinità di legame, la stechiometria e la termodinamica è un passo essenziale nella scienza di base e applicata. La termoforesi su microscala (MST) è un metodo biofisico sensibile per ottenere queste importanti informazioni. Basandosi su un effetto fisico chiamato termoforesi, che descrive il movimento delle molecole attraverso gradienti di temperatura, questa tecnologia consente la determinazione rapida e precisa dei parametri di legame in soluzione e consente la libera scelta delle condizioni del tampone (dal tampone ai lisati/sieri). La MST utilizza il fatto che una molecola non legata mostra un movimento termoforetico diverso rispetto a una molecola che è in complesso con un partner di legame. Il movimento termoforetico è alterato nel momento dell'interazione molecolare a causa di cambiamenti nelle dimensioni, nella carica e nell'idratazione del guscio. Confrontando i profili di movimento di diversi rapporti molecolari dei due partner di legame, è possibile determinare informazioni quantitative come l'affinità di legame (da pM a mM). Anche le interazioni difficili tra molecole di piccole dimensioni, come aptameri e piccoli composti, possono essere studiate mediante MST. Utilizzando l'interazione del modello ben studiata tra l'aptamero di DNA DH25.42 e l'ATP, questo manoscritto fornisce un protocollo per caratterizzare le interazioni aptamero-piccola molecola. Questo studio dimostra che l'MST è altamente sensibile e permette la mappatura del sito di legame dell'aptamero del DNA da 7,9 kDa all'adenina dell'ATP.

Introduction

L'interazione tra le molecole è la base della natura. Quindi, gli scienziati in molti campi della ricerca di base e applicata cercano di capire i principi fondamentali delle interazioni molecolari di diversi tipi. MicroScale termoforesi (MST) consente agli scienziati di effettuare il veloce, preciso, caratterizzazione economicamente efficiente e di qualità controllata delle interazioni molecolari in soluzione, con una scelta di buffer. Ci sono già più di 1.000 pubblicazioni utilizzando MST, a partire dal 2016 da solo, che descrive i diversi tipi di analisi, tra cui proiezioni di libreria, convalide di eventi, analisi della concorrenza, e gli esperimenti di legame con partner multipli vincolanti ^1-8. In generale, MST consente lo studio dei parametri vincolanti classici, come affinità di legame (pM a mM), stechiometria e termodinamica, di qualsiasi tipo di interazione molecolare. Un grande vantaggio di MST è la capacità di studiare eventi di legame indipendenti dalla dimensione dei partner di interazione. anche Chalinterazioni lenging tra piccole aptameri di acidi nucleici (15-30 nt) e target, quali piccole molecole, farmaci, antibiotici, o metaboliti possono essere quantificati.

Le attuali tecnologie state-of-the-art di caratterizzare le interazioni aptamer bersaglio sono o laboratorio-intenso e molto complesso o non riescono a quantificare aptameri-piccola molecola Interazioni ^9,10. Risonanza plasmonica di superficie (SPR) a base di test di ^11,12 e approcci calorimetrica veramente libero-label, come Calorimetria isotermica di titolazione (ITC) ^13-15, eluizione isocratica ^16, equilibrio filtrazione ^17,18, in linea di sondaggio ^19, gel- spostare saggi, stopped- flusso fluorescenza spettroscopia ^20,21, anisotropia di fluorescenza (FA) ^22,23, singola molecola fluorescenza di imaging ^24,25, e Bio-strato di interferometria (BLI) ²⁶ siano anche imprecisi o incompatibile con la molecola aptameri-piccole interazioni. Altro Principal temi di questi metodi sono bassa sensibilità, elevato consumo di campione, l'immobilizzazione, limitazioni di trasporto di massa su superfici e / o limitazioni del buffer. Solo pochi di queste tecnologie forniscono controlli integrati per aggregazione e di adsorbimento effetti.

MST rappresenta un potente strumento per gli scienziati di superare questa limitazione per studiare le interazioni tra aptameri e piccole molecole ^27-29, nonché altri obiettivi come le proteine ^30-33. La tecnologia si basa sul movimento delle molecole attraverso gradienti di temperatura. Questo movimento diretto, chiamato "termoforesi," dipende dalle dimensioni, carica, e shell idratazione della molecola ^34,35. Il legame di un ligando alla molecola modificherà direttamente almeno uno di questi parametri, con un conseguente mobilità thermophoretic cambiato. Ligandi con le piccole dimensioni non possono avere un notevole impatto in termini di cambio formato dal non associata alla stato legato, ma possono avere dr effetti Amatic sul guscio di idratazione e / o carica. I cambiamenti nel movimento delle molecole thermophoretic dopo interazioni con il partner legante consente la quantificazione dei parametri vincolanti di base ^{2,7,34,36,37.}

Come illustrato in figura 1A, il dispositivo MST costituito da un laser a infrarossi focalizzato sul campione entro i capillari di vetro con la stessa ottica come per la rilevazione della fluorescenza. Il movimento thermophoretic delle proteine tramite fluorescenza intrinseca di triptofani ⁶ o di un ^3,8 socio interazione fluorescente può essere monitorato mentre il laser stabilisce un gradiente di temperatura (DT di 2-6 ° C). La differenza di temperatura risultante nello spazio, DT, porta alla deplezione o accumulo di molecole nella zona di temperatura elevata, che può essere quantificato dal Soret coefficiente (S _T):

g "/>

c rappresenta _caldo la concentrazione nella regione riscaldata, ec _freddo è la concentrazione nella regione fredda iniziale.

Come mostrato nella Figura 1B, un tipico esperimento MST ottiene un profilo di movimento MST (traccia temporale), costituito da diverse fasi, che possono essere separati dai rispettivi tempi. La fluorescenza iniziale è misurata nei primi 5 s in assenza del gradiente di temperatura per definire la precisione di fluorescenza iniziale e per controllare photobleaching o photoenhancement. Il salto di temperatura (T-Jump) rappresenta la fase in cui le variazioni di fluorescenza prima del movimento thermophoretic. Questa diminuzione iniziale della fluorescenza dipende da sbalzi termici-dipendente di fl uorophore resa quantica. La fase termoforesi segue, in cui diminuisce fluorescenza (o aumenta) dovuti al movimento thermophoretic delle molecole fino alla distribuzione dello stato stazionario viene raggiunto.Il tjump retromarcia e retrodiffusione concomitante di molecole fl uorescenti possono essere osservati come indicato in Figura 1B dopo il laser è spento. Per accedere ai parametri di base vincolanti, diversi rapporti molari dei partner di interazione sono analizzati e confrontati. Tipicamente, 16 differenti rapporti sono studiati in un esperimento MST, considerando che la molecola visibile ottica viene mantenuta costante ed è fornita con una quantità crescente di ligando non marcato. L'interazione tra i due partner di legame induce cambiamenti nella termoforesi, e quindi nella fluorescenza normalizzato, F _norma, che viene calcolato come segue:

F _calda e _fredda F rappresentano una media di fl intensità fluorescenza a de fi nite momenti delle tracce MST. Affinità di legame (K _D o valori di EC ₅₀₎ possono essere calcolati curve montaggio (Figura 1C).

Nel complesso, MST è un potente strumento per studiare le interazioni molecolari di qualsiasi tipo. Questo manoscritto offre un protocollo per caratterizzare l'interazione sfida tra la piccola molecola di adenosina trifosfato (ATP; 0,5 kDa) e il 25-nt breve ssDNA aptameri DH25.42 (7,9 kDa). Nel corso del manoscritto, il sito di legame del aptamer sulla molecola ATP viene mappato verso il gruppo adenina dell'ATP.

Protocol

1. Preparazione del lavoro Aptamero l'Archivio

1. Seguire le istruzioni del produttore e sciogliere il oligonucleotide (5-Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, la sequenza di riferimento ¹⁸⁾ in acqua, raggiungendo una concentrazione finale di 100 micron.
2. Preparare la soluzione aptameri di lavoro diluendo lo stock oligonucleotide a 200 Nm con tampone assorbente (20 mM Tris, pH 7,6; 300 mM NaCl, 5 mM MgCl _2; 0,01% Tween20).
3. Incubare la miscela per 2 minuti a 90 ° C, lasciate raffreddare il campione immediatamente sul ghiaccio, e utilizzare il campione a temperatura ambiente.

2. Preparazione del Ligand diluizione Series

1. Per ogni ligando (adenosina trifosfato (ATP), adenosina difosfato (ADP), adenosina monofosfato (AMP), adenina, guanosintrifosfato (GTP), citosintrifosfato (CTP), deossiadenosina trifosfato (dATP), e S-adenosilmetionina (SAM) ; 10 mM magazzino ciascuno), preparare un diluti di serie 16-stepsu in 200 provette micro microlitri.
   NOTA: centrifugazione delle scorte ligando per 5 minuti a 14000 g può aiutare a rimuovere gli aggregati. Basso volume, si raccomanda provette vincolante basso per evitare l'assorbimento delle molecole alle pareti del tubo.
2. Iniziare con una concentrazione massima di almeno 50 volte superiore all'affinità stimata e ridurre la concentrazione del ligando del 50% in ogni fase di diluizione.
   NOTA: Lo strumento concentrazione finder implementato nel software di controllo simula dati vincolanti e aiuta a trovare l'intervallo di concentrazione giusta per la serie di diluizioni.
3. Riempire 20 ml di legante magazzino (10 mm) in tubo 1. Aggiungere 10 ml di tampone di legame aptameri in tubi di reazione micro 2-16.
4. Trasferimento 10 ml di tubo da 1 a tubo 2 e miscelare correttamente pipettando su e giù parecchie volte. Trasferire 10 microlitri al tubo successivo e ripetere questa diluizione per i rimanenti tubi.
5. Eliminare l'eccesso di 10 ml dall'ultima provetta. Evitare qualsiasi Beffetti diluitivi Uffer. Il tampone nella provetta 1 e in tubi 2-16 deve essere identica.

3. Preparazione della miscela di reazione finale

1. Preparare le singole reazioni di legame con un volume di 20 microlitri (10 ml di soluzione di lavoro aptamer + 10 ml di rispettiva diluizione ligando) per minimizzare errori di pipettamento. Un volume di soli 4 microlitri è suf fi ciente per il riempimento capillare.
2. Aggiungere 10 ml di soluzione di lavoro 200 nM aptameri a 10 microlitri di ogni diluizione ligando e miscelare correttamente pipettando su e giù diverse volte.
3. Incubare i campioni per 5 min a temperatura ambiente e riempire i campioni nei capillari standard, immergendo i capillari nel campione. tempi di incubazione più lunghi possono essere necessari per alcune interazioni; Tuttavia, 5 min è adeguato per la maggior parte. Selezionare i capillari solo sui lati, NON sulla parte centrale, dove viene effettuata la misurazione ottica.
4. Posizionare i capillari si aVassoio capillare e ed avviare il dispositivo MST.

4. Avvio del dispositivo MST

NOTA: Il dispositivo fornisce due pacchetti software preinstallati, l ' "software per la messa a punto tecnica delle condizioni sperimentali e il controllo' 'analisi"' software per l'interpretazione dei dati prodotti.

1. Prima di effettuare il vassoio capillare nel dispositivo MST, avviare il software di controllo e regolare la temperatura complessiva desiderata selezionando '' attivare il controllo manuale della temperatura "del '' controllo della temperatura" menu a discesa. Regolare la temperatura a 25 ° C in questo modo.
   NOTA: Gli strumenti MST possono essere a temperatura controllati attraverso 22 a 45 ° C.
2. Attendere che la temperatura per raggiungere il livello previsto e quindi inserire il vassoio capillare nel dispositivo MST.
3. Impostare il canale LED per '' rosso "per le tinture Cy5 e regolare la potenza del LED per ottenere un fl uorescence segnale 300 a 1000 unità di fluorescenza del dispositivo MST con un sensore standard. potere LED 25% è utilizzato in questo studio.
   NOTA: 6.000 a 18.000 unità di fluorescenza sono raccomandati per il MST con un sensore ad alta sensibilità.

5. capillare Scan

1. Effettuare una scansione capillare per controllare diversi aspetti di qualità del campione, scegliendo la posizione capillare sul software "di controllo" e cliccando su "avviare la scansione cap" prima della misurazione MST.
2. Ispezionare la scansione capillare per la fluorescenza valorizzazione / tempra e gli effetti che attaccano (a forma di U o appiattita picchi) nel software.
   NOTA: Maggiori dettagli sul rilevamento e la gestione della fluorescenza e gli effetti che attaccano possono essere trovati nella discussione.

6. Misura MST

NOTA: Prima di iniziare la misura MST, assicurarsi di escludere attaccare effetti, valorizzazione / effetti tempra, oerrori di pipettamento, e garantire che la scansione capillare indica che il segnale fluorescenza è suf fi ciente. Per maggiori dettagli, vedere la discussione.

1. Assegnare le concentrazioni di ligando della serie di diluizione alla rispettiva posizione capillare nel software '' di controllo "consideri la fase di diluizione della miscelazione del aptamer e ligando. (1: 1).
2. Inserisci la più alta concentrazione di ligando (5 mm) per capillare # 1, selezionare il tipo di diluizione corretto (qui, 1: 1), cliccare sulla massima concentrazione, e utilizzare la funzione di trascinamento per assegnare automaticamente le restanti concentrazioni in capillari # 2 16. La concentrazione più bassa è 152,6 nM.
3. Inserire la concentrazione del aptamer uorescenti fl (qui, 100 nM) nella rispettiva sezione del software di controllo.
4. Utilizzare le impostazioni predefinite, che rilevano la fluorescenza fl per 5 secondi, registrare il MST per 30 secondi, e registrare la fluorescenza per altri 5 secondi dopo l'inattivazione del t laser o monitorare la diffusione posteriore delle molecole.
5. Regolare la potenza del laser al 20% nella rispettiva sezione del software di controllo.
   NOTA: per ricevere il miglior rapporto segnale-rumore e per evitare effetti non specifici, si consiglia una potenza laser di 20-40%. In casi specifici, una potenza del laser più elevato può essere richiesto per ottenere una buona separazione delle molecole non legati e legati.
6. Salvare l'esperimento dopo aver selezionato la cartella di destinazione e avviare la misura MST premendo il pulsante '' misura di inizio MST ".
   NOTA: Il file .ntp verrà generato nella cartella di destinazione. Usando questa configurazione, una misurazione dura 10-15 minuti.
7. Ripetere la procedura sperimentale almeno due volte per una determinazione più accurata del valore EC _50.
   NOTA: Al fine di testare la riproducibilità tecnica, gli stessi capillari possono essere acquisiti più volte (ripete tecnici).

7. Analisi dei dati MST

nt "> NOTA: Il software di analisi permette l'analisi dei dati sul fl y durante la misurazione Il software di analisi traccia le tracce del tempo MST e dei cambiamenti nel normalizzato fluorescenza (F _norma) contro la concentrazione del ligando ^37..

1. Avviare il software di analisi MST (Analisi MO.Affinity) e caricare il file .ntp dalla cartella di destinazione. Selezionare "MST" come tipo di analisi nel menu di selezione dei dati.
   NOTA: Nel caso di effetti di fluorescenza ligando-dipendente, la fluorescenza iniziale può essere scelto per l'analisi.
2. Aggiungere la rispettiva corsa (s) tecnico o biologico per una nuova analisi con il drag-and-drop o premendo il tasto "+" al di sotto del rispettivo periodo sperimentale.
3. Premere il pulsante di informazioni al di sotto del rispettivo periodo di sperimentazione per ottenere informazioni sulle proprietà di questo esperimento, tracce MST, scansione capillare, forma capillare, fluorescenza iniziale e tasso di sbiancamento.
   NOTA: I dati grezzi possono alcosì da ispezionare in fasi successive dell'analisi.
4. Visivamente le tracce MST per l'aggregazione e la precipitazione effetti, visibile come urti e picchi.
   NOTA: Per ulteriori informazioni sul rilevamento e la gestione degli effetti di aggregazione, leggere la discussione.
5. Ispezionare visivamente la scansione capillare e la capillare forma di sovrapposizione per gli effetti di adsorbimento, visibile come picchi o appiattite a forma di U. Ispezionare visivamente la scansione capillare e la fluorescenza iniziale per gli effetti di fluorescenza. Ispezionare visivamente il tasso sbiancante per photobleaching effetti.
6. Passare alla modalità dose-risposta e modificare l'impostazione di analisi in modalità "esperto" premendo il tasto corrispondente. Selezionare "T-Jump", come la strategia di valutazione MST.
7. Selezionare il modello di "Hill" per la curva fi tting. saranno automaticamente calcolati i parametri vincolanti. Normalizzare i dati scegliendo il rispettivo tipo di normalizzazione nel menu "confrontare i risultati". esportare ili dati sia come un file .xls o .pdf.
   Nota: La tabella sotto il grafico legame riassume i parametri vincolanti calcolati.

Results

In questo studio, MST è stato applicato per caratterizzare il sito di legame del DNA aptamer DH25.42 ¹⁸ ATP. A differenza di altri studi che caratterizzano l'interazione di ATP o ATP-mimando piccole molecole con proteine marcate casualmente con uno o più fluorofori ^38-40, questo studio include una etichetta versione del aptamer 7,9 kDa ssDNA con una molecola Cy5 sull'estremità 5' . Diversi derivati ​​ATP e molecole correlate, che differiscono da ATP in varie posizio...

Discussion

Controlli di qualità:

Aspecifico sticking / adsorbimento di materiale campione a superfici, così come gli effetti di aggregazione, hanno una influenza notevole sulla qualità dei dati di affinità. Tuttavia, solo un paio di tecnologie state-of-the-art offrono opzioni precise e rapide per monitorare ed evitare questi effetti. MST offre controlli di qualità integrati che consentono di rilevare e aiutano a superare questi problemi, consentendo l'ottimizzazione graduale della configurazione tecni...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
		legante aptamero	20 mM Tris pH 7,6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0,01% Tween-20
Aptamero ATP marcato in fluorescenza	IDT, Lovanio, Belgio		sequenza: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT- ATTGCGGAGGAAGG-3
ATP	Sigma Aldrich, Germania	A2383	10 mM di soluzioni stock conservate a - 20 gradi C
ADP	Sigma Aldrich, Germania	A2754	10 mM di soluzioni stock conservate a - 20 gradi C
AMP	Sigma Aldrich, Germania	A2252	10 mM di soluzioni stock conservate a - 20 gradi C
Adenina	Sigma Aldrich, Germania	A8626	10 mM di soluzioni stock conservate a - 20 gradi C
SAM	Sigma Aldrich, Germania	A7007	10 mM di soluzioni stock conservate a - 20 gradi C
dATP	Sigma Aldrich, Germania	11934511001	10 mM di soluzioni stock conservate a - 20 gradi C
CTP	Sigma Aldrich, Germania	C1506	10 mM di soluzioni stock conservate a - 20 gradi C
GTP	Sigma Aldrich, Germania	G8877	10 mM di soluzioni stock conservate a - 20 gradi C
Monolite NT.115	NanoTemper Technologies, Monaco di Baviera, Germania	MO-G008	Canale blu/rosso Dispositivo MST con rivelatore standard, Monolith NT115 pico è un dispositivo MST con rivelatore ad alta sensibilità
Monolith NT.115 capillari Standard	NanoTemper Technologies, Monaco di Baviera, Germania	MO-K002
Provette Eppendorf PCR	Eppendorf, Germania	30124537
Software di controllo Monolith. 2.1.33, preinstallato su il dispositivo	NanoTemper Technologies, Monaco di Baviera, Germania
MO.affinity analysis v2.1.1	NanoTemper Technologies, Monaco di Baviera, Germania
Kaleidagraph 4.5.2	Synergy Software