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Articolo metodologico

Un Cell Carcinoma Singenico modello murino di renale metastatico per quantitativo e longitudinale Valutazione della preclinici Terapie

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⸱

DOI:

10.3791/55080

⸱

12 aprile 2017

 ,  ,  , 
1Department of Urology, University of Minnesota, 2Masonic Cancer Center, University of Minnesota, 3Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, University of Minnesota, 4Department of Medical Microbiology, Immunology and Cell Biology, Southern Illinois University School of Medicine, 5Simmons Cancer Institute

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Attuazione di un modello ortotopico di carcinoma renale nei topi immunocompetenti offre al ricercatore un sistema clinicamente rilevante definito dalla presenza di un tumore e metastasi polmonari primarie renali nello stesso animale. Questo sistema può essere utilizzato per testare preclinica una varietà di trattamenti in vivo.

Abstract

Carcinoma a cellule renali (RCC) colpisce> 60.000 persone negli Stati Uniti ogni anno, e circa il 30% dei pazienti con RCC avere più metastasi al momento della diagnosi. Metastatico RCC (CRm) è incurabile, con un tempo di sopravvivenza media di soli 18 mesi. Interventi basati immunitario (ad esempio, interferone (IFN) e interleuchina (IL) -2) inducono risposte durature in una frazione di pazienti MRCC e inibitori multichinasi (ad esempio, sunitinib o sorafenib) o anti-recettore VEGF anticorpi monoclonali (mAb) sono in gran parte palliative, come remissioni complete sono rare. Tali carenze attuali terapie per i pazienti mRCC forniscono il razionale per lo sviluppo di nuovi protocolli di trattamento. Un componente chiave nella sperimentazione preclinica di nuove terapie per mRCC è un modello animale adatto. caratteristiche benefiche che ricapitolano la condizione umana includono un tumore primario renale, metastasi tumorali renali, e un sistema immunitario intatto per indagare su qualsiasi Effecto immunitario terapia-drivenr risposte e la formazione di fattori immunosoppressivi tumore-indotta. Questo rapporto descrive un modello di topo mRCC ortotopico che ha tutte queste caratteristiche. Descriviamo una tecnica di impiantazione intrarenali usando il mouse renale linea cellulare di adenocarcinoma Renca, seguita dalla valutazione della crescita del tumore nel rene (sito principale) e polmoni (sito metastatico).

Introduzione

Carcinoma a cellule renali (RCC) rappresenta la maggior parte delle neoplasie maligne del rene e circa il 3% di tutti i tumori maligni adulti in tutto il mondo 1, 2. A causa della mancanza di sintomi, diagnosi errata, e strumenti di screening insufficienti per RCC, quasi il 30% dei pazienti presenterà con metastatico RCC (CRm) al momento della diagnosi, con un ulteriore 20-30% dei pazienti con progressione di stadio metastatico 2. Questi casi si traducono in ~ 13.500 decessi ogni anno 1, 3. Anche se in precedenza il rilevamento e il trattamento di primaria RCC è migliorata, il tasso di morte RCC legati continua ad aumentare, il che suggerisce che la malattia metastatica è in gran parte responsabile per la mortalità 3. dello sviluppo di terapie per il carcinoma renale è progredita negli ultimi dieci anni con la scoperta e l'attuazione di terapie e immunoterapie mirate. Purtroppo, survivability libera da progressioneAl e sopravvivenza complessiva dei casi avanzati sono ancora ben inferiore a 2 anni per la maggior parte dei pazienti 4, 5, 6. Queste statistiche giustificano la necessità di ulteriori ricerche per l'individuazione e lo sviluppo di trattamenti efficaci per RCC. Per avanzare adeguatamente interventi terapeutici per il carcinoma renale metastatico, in primo luogo sono necessari translationally rilevanti modelli pre-clinici della malattia.

Sviluppo di un modello pertinente e coerente per ricapitolare la condizione umana di carcinoma renale avanzato dovrebbe affrontare diverse questioni chiave: 1) è il modello anatomicamente rilevanti; 2) Se lo stato di avanzamento del tumore in modo simile alla patologia umana; 3) fare metastasi derivano dal tumore primario; e 4) Può la progressione del tumore primario e metastasi essere monitorato nel tempo? A seconda del tipo di trattamento in fase di studio, linee topo RCC tumorali cellulari, linee cellulari tumorali umane RCC e RCC xenog paziente umano derivatozattere possono essere utilizzati in topi immunocompetenti e immunodeficienti. È necessaria una host con un sistema immunitario intatto e funzionale per quegli studi che valutano alcuni aspetti di immunoterapia, rendendo necessario l'uso della linea cellulare Renca ben descritto derivata da un adenocarcinoma renale spontanea di Balb topi / c 7. Molti studi iniettano cellule Renca sottocutanea (sc), che forma un tumore locale facile da misurare, o per via endovenosa (iv) in topi Balb / c per produrre sperimentali polmone "metastasi" 8, 9, 10, 11, 12. Uso di un tumore Renca sc-impiantato per modellare RCC umano ha un numero di limitazioni, tra cui innervazione imprecisa di vascolarizzazione 13, differenze di microambiente 14, 15, e la mancanza di organo / tumore communic cellularezione 13, 16. Inoltre, molti tumori sc (soprattutto Renca) non metastatizzano agli organi distali, inibendo lo studio di un evento che è una comune caratteristica clinica 17. Per studiare mRCC, cellule Renca possono essere iniettati iv stabilire carico tumorale nei polmoni, la località principale di metastasi nei pazienti RCC. Il metodo di iniezione iv di autoinnesco tumori metastatici, tuttavia, non consente lo studio di come, quando, o perché le cellule sono migrati dall'organo primaria (cioè, il rene) al sito distante. Un modello con entrambe le malattie primari e metastatici evidente nello stesso animale è fondamentale per studiare la progressione e trattamento della malattia avanzata, soprattutto se si considera che le metastasi sono tipicamente la causa di mortalità in questi pazienti.

Il nostro laboratorio ha sviluppato un modello murino di carcinoma renale metastatico che incorpora tutte le caratteristiche di cui sopra. Per stabilire primary, tumori ortotopico, cellule Renca vengono impiantate direttamente nel rene dell'animale attraverso il peritoneo traslucido. Una piccola incisione nel fianco sinistro permette la visualizzazione della milza (come punto di riferimento) e rene sinistro. Utilizzando un ago di piccolo calibro, le cellule tumorali Renca vengono iniettati direttamente nel rene attraverso il peritoneo per l'impianto ortotopico. Rispetto ad altri metodi di impiantare cellule Renca sotto la capsula renale 18, questo metodo di impiantazione consente una produttività più elevata, come è abbastanza non invasivo, non richiede sutura, è di una classe dolore bassa, ed è tempo efficiente quando praticata.

Questo ben caratterizzati risultati del modello a carico riproducibili primaria del tumore (~ 99% tasso di utilizzo) nel rene iniettato così come il carico tumorale metastatico nei polmoni. I vantaggi significativi di questo modello includono la sua natura singenici, permettendo per le indagini di immunoterapia; le sue metastasi spontanee, di studiare unmalattie dvanced; e il suo impianto ortotopico, per modellare l'impatto anatomica sulla progressione della malattia e il trattamento. Terapie mirate a colpire RCC sarebbe di grande beneficio dall'utilizzo di questo modello durante lo sviluppo preclinico.

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Protocollo

Il seguente protocollo descrive una procedura sperimentale per indurre e monitoraggio della crescita dei tumori renali ortotopiche sperimentali ed eventuali metastasi spontanee. Tutte le seguenti procedure vengono eseguite in conformità con le politiche istituzionali e le procedure approvate per quanto riguarda l'uso umano degli animali da esperimento.

1. Manutenzione di linee cellulari

  1. Mantenere murino linea cellulare di adenocarcinoma renale, Renca, in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 supplementato con 10% siero di vitello fetale (FCS), 1% di penicillina-streptomicina, e 1 mM ciascuno di non essenziali aminoacidi, L-glutammina , e piruvato di sodio (denominato RPMI completo). Cellule di coltura in un incubatore a 37 ° C e 5% CO 2.
    NOTA: Come con qualsiasi linea cellulare stabilita, si raccomanda di usare passaggio basso-numero cellule Renca per la trasfezione e successivo impianto per minimizzare eventuali fenotipiche o genetiche modifiche che potrebbero verificarsi dopo culto a lungo termineUre.
    1. Utilizzare un sistema di trasposoni per progettare cellule Renca per esprimere stabilmente la proteina fluorescente verde (GFP) e luciferasi di lucciola.
      1. Utilizzando un cationico a base di liposomi reagente di trasfezione, co-trasfezione le cellule Renca con un vettore di espressione trasposasi (pPGK-SB11) e una codifica trasposone vettore per l'espressione di luciferasi di lucciola, così come un gene codificante fusione GFP e il gene di resistenza zeocin , sia sotto il controllo trascrizionale di un promotore bidirezionale (pKT2 / Lubig) 19.
      2. Due giorni dopo, piastra cellule trasfettate a una diluizione limitante e permettono alle cellule di espandersi in RPMI completo integrato con zeocin (300 ug / mL). Confermare espressione GFP in ogni clone mediante citometria di flusso. Queste cellule sono chiamate Renca-GL.
        NOTA: Limitare-diluizione clonazione permetterà le celle selezionate per essere derivati ​​da una singola cellula.
  2. Per impiantare cellule Renca intrarenally, preparare le cellule Renca into una cella singola sospensione a 2 x 10 6 cellule / ml in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS).
    1. Rimuovere le cellule Renca aderenti dal pallone di coltura tissutale con 0,25% tripsina in HBSS. Dopo circa 5 minuti, aggiungere RPMI completo al pallone per neutralizzare la tripsina e trasferire le cellule in una provetta da centrifuga per il lavaggio. Centrifugare le cellule a 300 g relativa forza centrifuga (xg RCF) per 5 min a 25 ° C.
    2. Decantare il surnatante e risospendere le cellule in HBSS. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e regolare il volume con HBSS per produrre 2 x 10 6 cellule / ml.
    3. Disegnare le celle in una siringa da 1 ml con un ago calibro 18 per evitare sforzi di taglio sulle cellule. Sostituire l'ago calibro 18 con un ago 28-gauge prima dell'iniezione delle cellule tumorali. Un'iniezione di 0,1 ml batte 2 x 10 5 cellule nel rene.

2. chirurgica zona di preparazione

  1. Preparare una chirurgica sterilearea in un armadio biosicurezza mettendo un telo chirurgico sterile sopra una piastra elettrica. Raccogliere tutte le forniture, compresi pinze, bisturi, forbici, colliri, 5% garza con povidone-iodio antisettico e sterile. Autoclave tutti gli strumenti prima dell'uso.
  2. Eseguire l'intervento chirurgico con una tecnica asettica punta. risterilizzare gli strumenti tra animali con uno sterilizzatore tallone. Indossare guanti sterili, un camice da laboratorio e una maschera.

3. Preparazione animale

  1. Anestetizzare i topi con ketamina / xilazina (87,5 mg / kg e 12,5 mg / kg, rispettivamente, ip) secondo le linee guida istituzionali. Determinare profondità dell'anestesia eseguendo un dito del piede-pizzico.
  2. Quando l'animale è considerato non reattivo, preparare il sito di iniezione (es, fianco sinistro) su topi Balb / c pizzicando (con le dita) o la rasatura (utilizzando tagliaunghie) il pelo.
  3. Spostare i topi dalla zona di preparazione la chirurgia (per esempio, la gabbia custodia) per l'area chirurgica e applicare veterinario pomata alocchi per prevenire la secchezza. Liberamente tamponare il sito di incisione preparato con 5% iodopovidone antisettico.
  4. Iniettare bupivacaina cloridrato (0,1 mL di 2,5 mg / ml soluzione, sc) nella zona dove l'incisione sarà fatto come analgesia pre-operatoria.
  5. Effettuare una singola incisione (~ 1,0 - 1,5 cm) sul fianco sinistro dell'animale utilizzando un bisturi sterile o forbici, con attenzione in modo da non penetrare nel peritoneo. Separare il derma dal peritoneo con forbici sterili. Tamponare il sito di incisione con garza di cotone sterile per rimuovere il sangue.
  6. Tenere il mouse con entrambe le mani, usando la mano sinistra per tenere la testa e la mano destra per sostenere il fianco.
  7. Identificare la milza attraverso il peritoneo e, con un dito della mano destra, palpate il mouse da sotto; il rene dovrebbe essere visibile attraverso il peritoneo. Mantenere una stretta costante dell'animale per fornire la tensione in tutto il peritoneo e del rene.
  8. Avere una seconda persona iniettare il tumore ceLLS (preparato nella sezione 1.2.) attraverso il peritoneo intatto nel centro del rene utilizzando una siringa da 1 ml con ago 28-gauge. Lentamente consegnare 0,1 ml (2 x 10 5) di cellule. Una volta che le cellule vengono iniettate, tenere l'ago in posizione per 5 - 10 s per ridurre il riflusso di cellule. È importante notare la necessità di estrema cautela durante questa fase, come la persona iniettando le cellule saranno portare l'ago in prossimità delle dita della persona che tiene il mouse.
  9. Rimuovere l'ago e chiudere l'incisione con un sottile strato di adesivo tissutale cianoacrilato.
  10. Posto l'animale di nuovo in una gabbia pulita con un tovagliolo di carta sterile. Consentire agli animali di recuperare su una piastra elettrica. Non lasciare gli animali incustoditi durante il periodo di recupero. Non restituire gli animali alle condizioni abitative normali fino a quando sono in posizione verticale e sternale. Seguire le linee guida istituzionali in tutte le procedure che utilizzano animali da laboratorio.

4. BioImaging luminescenti

  1. Monitorare la crescita tumorale mediante imaging bioluminescente.
    NOTA: dettagli procedurali per eseguire l'imaging bioluminescente possono essere ottenuti da Lim et al. 20 Il segnale luciferasi può essere rilevato già nelle prime 24 ore dopo l'impianto delle cellule tumorali. Poiché non v'è nessun tumore esternamente visibili in questo modello, è essenziale monitorare periodicamente la crescita tumorale. A seconda del esperimento progettato, la crescita del tumore ortotopico può procedere per periodi variabili. Uno dei vantaggi di utilizzare le cellule Renca luciferasi che esprimono è che la crescita del tumore può essere più volte monitorato nello stesso animale ad intervalli regolari per tutta la durata dell'esperimento, e un'interrogazione specifica di tumore-cuscinetto e organi privi di tumore può essere fatto in un endpoint definito.
    1. Iniettare luciferina (0,1 mL di una soluzione 15 mg / ml in PBS sterile) ip e farlo circolare per 10 min prima di posizionare il mouse nel sistema di imaging bioluminescenza. Posizionare il mo utilizzare con il suo lato dorsale up, laminati leggermente su un lato, in modo da avere rene iniettato rivolto verso l'alto.
    2. Misurare il carico tumorale in fotoni di luce emessi al secondo (flusso di fotoni) in una regione definita di interesse (ROI) utilizzando il software di analisi di immagine.
  2. La quantificazione del carico tumorale nei singoli organi.
    NOTA: La quantificazione può essere eseguita in momenti definiti in singoli organi dopo la loro rimozione dai topi eutanasia.
    1. Iniettare i topi con luciferina, come al punto 4.1.
    2. Dopo 10 minuti, eutanasia i topi utilizzando una procedura approvata.
    3. Sezionare gli organi di interesse (ad esempio, i reni e polmoni, vedi sezione 5). Trasferire il tessuto a 35 x 10 mm di Petri e collocarle nel sistema di imaging bioluminescenza.
    4. Misurare il carico tumorale in fotoni di luce emessi al secondo (flusso di fotoni) entro ROI definiti utilizzando software di analisi di immagine.
e_title "> 5. Organ Harvest

  1. A un endpoint definito per il singolo esperimento, eutanasia topi portatori di tumore secondo le linee guida istituzionali preferite (ad esempio, CO 2, dislocazione cervicale, overdose anestesia). Tuttavia, evitare dislocazione cervicale se i polmoni devono essere raccolte dopo l'inflazione inchiostro di china.
  2. Eseguire una valutazione lorda di crescita del tumore primario renale nel rene iniettato misurando il peso dell'organo bagnato.
    1. Per determinare la massa tumorale (in g), isolare 21 e pesare il rene tumore-cuscinetto e il rene controlaterale dallo stesso animale, dove la differenza di peso dei reni definisce la massa tumorale. sezionare attentamente tutta tessuto connettivo estranea dai reni asportati prima di misurare il loro peso.
  3. Valutare il grado di tumore metastasi ai polmoni gonfiando i polmoni con inchiostro di china prima di escissione e subito che fissa i polmoni in soluzione di Feketelass = "xref"> 22. calcolo manuale delle lesioni metastatiche sulla superficie del polmone può essere eseguita.
    1. Effettuare un'incisione sulla linea mediana con le forbici a partire da metà-addome, attraverso la cassa toracica, e attraverso le ghiandole del collo / salivari. Rimuovere con attenzione la gabbia toracica con le forbici e pinze, senza compromettere il tessuto polmonare.
    2. Esporre la trachea rimuovendo il tessuto connettivo.
    3. Preparare una siringa da 3 ml con un ago calibro 18 riempito di soluzione di inchiostro di china il 10% in HBSS.
    4. Utilizzando pinze, infilare con attenzione una sutura di seta sotto la trachea. Questo verrà utilizzato per legare la trachea volta gonfiato.
    5. Inserire con cautela l'ago verso il basso la trachea e premere lentamente la siringa per gonfiare i polmoni con la soluzione di inchiostro di china. Circa 1 - 1,5 ml di soluzione di inchiostro India saranno gonfiare completamente i polmoni.
    6. Pizzicare la trachea chiusa legando diversi nodi, con la sutura sotto l'ago di inibire il riflusso dell'inchiostro.
    7. Remove l'ago e con attenzione tagliare via il tessuto connettivo per rimuovere i polmoni gonfiati.
    8. In una cappa, posizionare i polmoni in un tubo conico da 15 ml contenenti 5 ml di soluzione di Fekete (35 mL di EtOH al 95%, 15 ml di dH 2 O, 5 mL di formaldeide e 2,5 mL di acido acido glaciale una bottiglia di vetro da 100 mL) 23.
    9. Lasciare i polmoni per fissare / Decolorare per 24 - 48 ore a temperatura ambiente prima di contare manualmente i noduli tumorali decolorato.
    10. Rimuovere i polmoni intatti dopo decolorazione e sezionare accuratamente polmoni fissati dal lobo in una capsula di Petri 35 x 10 mm. Contare il numero di noduli tumorali (noduli bianchi) su ciascun lobo sotto un microscopio da dissezione.

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Risultati

L'impianto di successo delle cellule Renca si tradurrà nello sviluppo del tumore nel rene e metastasi ai polmoni dei topi. Dopo l'asportazione del tumore-cuscinetto e reni controlaterali, pesi tessuto bagnato (g) sono stati misurati per dimostrare la massa tumorale basata su un maggior peso (Figura 1). Tumori Renca possono essere identificati mediante immunoistochimica attraverso citocheratina 8 e 18 colorazione (Figura 2). Per gli studi lo...

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Discussione

Vi presentiamo un protocollo per un modello di topo RCC ortotopico. L'impianto di cellule tumorali adenocarcinoma renale del mouse nel rene del mouse fornisce un modello clinicamente rilevanti di carcinoma renale metastatico. Questo modello si traduce in un tumore primario all'interno del rene e metastasi a distanza nei polmoni, che sono entrambi tratti distintivi di carcinoma renale avanzato. La descrizione qui presentata è specifico per la linea cellulare Renca nel immunocompetenti topi BALB / c. Utilizzando q...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Cancer Institute (R15CA173657 AW e R01CA109446 a TSG), la Simmons Cancer Institute (AW), e l'Università di Minnestoa salire 4 Kidney Cancer Foundation (TSG). Ringraziamo il Dott Kristin Anderson per l'assistenza con l'immunofluorescenza.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Unguento oftalmico per lacrime artificialiAkornNDC 17478-162-35
Vetbond Adesivo per tessuti3MCBGBIW011019
Soluzione di Betadine (iodio povidone, 5%)Purdue Products, L.P.NDC 67618-155-32
0,25% Marcaina (iniezione di bupivavaina HCl)Hospira0409-1587-50 
Cuscinetto riscaldanteSunbeam
BD309659
GarzaVenture908291
ketaminaPhoenix PharmaceuticalsNDC 57319-609-02
xilazina AkornNDC 59399-111
Hank' s Sali bilanciatiSigma-AldrichH2387
IVISCalibro
D-Luciferina, Sale di potassio GoldBioLUCK-1G
India InkChartpak Inc44201
Forbice Forcipe
Sleeping Beauty (SB) sistema di trasposoniNeuromics
RencaATCCCRL-2947
Siringhe SBT0200

Riferimenti

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