Qui, presentiamo un protocollo completo di elettroforesi della zona capillare per la valutazione dell'eterogeneità fisico-chimica intrinseca degli anticorpi monoclonali come attributo di qualità.
Articolo metodologico
Elettroforesi capillare Separazione di anticorpo monoclonale Isoforme Utilizzando un capillare Neutral
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le proteine bioterapeutiche, come gli anticorpi monoclonali (mAb), sono alternative fattibili per il trattamento delle malattie cronico-degenerative. L'attività biologica di queste proteine dipende dalle loro proprietà fisico-chimiche. L'uso di tecniche ad alte prestazioni come la cromatografia e l'elettroforesi capillare è stato descritto per l'analisi dell'eterogeneità fisico-chimica degli anticorpi monoclonali. Al giorno d'oggi, la tecnica dell'elettroforesi a zona capillare (CZE) costituisce uno dei saggi più risolutivi e sensibili per l'analisi di biomolecole. Inoltre, la separazione elettro-guidata in CZE è governata da ampie proprietà della materia e offre il vantaggio di analizzare le proteine vicino al loro stato nativo. Tuttavia, il successo dell'implementazione di questa tecnica per l'analisi di routine dipende dalle capacità dell'analista nelle fasi critiche durante la preparazione del campione e del sistema. Lo scopo di questo tutorial è quello di dettagliare i passaggi per avere successo nell'analisi CZE degli anticorpi monoclonali. Inoltre, questo protocollo può essere utilizzato per lo sviluppo e il miglioramento delle competenze del personale coinvolto nei laboratori di chimica analitica delle proteine.
Introduzione
Gli anticorpi monoclonali (MAK, MAB) sono proteine bioterapeutici con crescente interesse a causa della loro capacità di agire contro diverse malattie croniche e degenerative 1. Come altre biomolecole, mAbs sono inclini a subire numerose modifiche fisico in tutte le fasi del ciclo di vita (cioè dal biosintesi al prodotto finale). Tali modifiche includono, ma non sono limitati a: deamidation, glicosilazione, ossidazione, ciclizzazione, isomerizzazione, aggregazione e taglio proteolitico 2. Quindi, sono necessarie tecniche analitiche in grado di risolvere isoforme intrinseche per monitorare mAbs eterogeneità e stabilità per stabilire specifiche di qualità.
Elettroforesi capillare (CE) è una tecnologia di separazione ad elevate prestazioni realizzato OutInside di un tubo di silice fusa stretto (gamma micron) riempita con uno sfondo elettrolita (DTF). In seguito all'applicazione di un campo elettrico (fino a 30.000 V), molecola caricas migrano verso l'elettrodo con carica opposta (cioè la separazione elettro-driven). L'uso di alte tensioni in CE permette analisi veloci e maggiore efficienza, che sono superiori a elettroforesi su gel classica. Zona di elettroforesi capillare (CZE) è una tecnica basata CE-abitualmente utilizzati nel settore biofarmaceutico per la valutazione della qualità del prodotto 3-9. A differenza di altri modi di CE (ad esempio, gel elettroforesi capillare, capillare focalizzazione isoelettrica) o metodi di cromatografia basati, CZE può essere condotta senza utilizzare denaturanti o interfacce fase solida, permettendo l'analisi della eterogeneità dei mAbs vicino al loro stato nativo 10 . CZE separazione delle isoforme mAb verifica all'interno di un capillare in silice fusa coperta con un polimero idrofilo (capillare neutro) e si basa sulla diversa mobilità elettroforetica, che è governato dalla carica, massa, dimensioni e forma (o volume idrodinamico) 11. frazioni mAb vengono rilevati quandosono mobilizzati e passano attraverso la finestra di rilevamento, che è rilevato da un rivelatore ultravioletto (UV) assorbanza a 214 nm 4.
Il successo di questa tecnica analitica dipenderà la giusta attenzione ai dettagli, prima e durante l'esperimento. Agire altrimenti aumenterà il costo e il tempo per condurre l'analisi, in ultima analisi, che porta al fallimento costante e frustrazione.
Qui vi presentiamo una guida passo-passo per condurre un'analisi di successo di mAb eterogeneità CZE attraverso la spiegazione dettagliata della preparazione di soluzioni e campioni, la preparazione del sistema CE, i metodi dello strumento istituito, l'acquisizione dei dati, e l'elaborazione. Ai fini di questa esercitazione, un anti-fattore di necrosi tumorale alfa ricombinante completamente umano (anti-TNF) mAb è usato come proteina modello; Tuttavia, questo protocollo può essere facilmente adattato per l'analisi di altre proteine considerando brevi modifiche. UNdditionally, diverse raccomandazioni per mitigare sono proposti potenziali problemi. Il lettore è incoraggiato a seguire rigorosamente il protocollo proposto, come la probabilità di successo aumenteranno.
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Protocollo
1. preparazione di soluzioni
- Preparare la soluzione BGE.
- Preparare 100 ml di una soluzione costituita da 0,05% (m / v) di cellulosa idrossi propil metil (HPMC), 200 mM ε-ammino n-caproico (EACA) e 30 mM acetato di litio.
NOTA: Come HPMC è un polimero viscoelastico, versare la polvere in un bicchiere di vetro, aggiungere 80 ml di acqua ed infine aggiungere la barra di agitazione. Continuare ad aggiungere i restanti reagenti come normalmente. Indossare occhiali di sicurezza durante la manipolazione di acetato di litio in quanto può causare irritazione agli occhi. - Regolare pH 4,8 ± 0,1 con 50% (v / v) di acido acetico. Lasciare che la soluzione si stabilizzi per 5 minuti e regolare, se necessario.
- Aggiungere acqua fino ad un volume finale di 100 ml in pallone tarato.
- Filtrare attraverso una membrana idrofila con dimensione dei pori 0,2 micron.
- Conservare a 2-8 ° C per un massimo di 7 giorni.
- Preparare 100 ml di una soluzione costituita da 0,05% (m / v) di cellulosa idrossi propil metil (HPMC), 200 mM ε-ammino n-caproico (EACA) e 30 mM acetato di litio.
- Preparare lo standard interno.
- Preparare 1 mLdi una soluzione composta da 1% (m / v) di istamina.
- Filtrare attraverso una membrana idrofila con dimensione dei pori 0,2 micron.
- Conservare a 2-8 ° C per un massimo di 1 giorno.
Preparazione 2. campione
- Preparare 180 microlitri di campione mAb diluito con tampone Tris (50 mM tris (idrossimetil) amminometano, pH 8,0) ad una concentrazione finale di 1 mg / ml.
- Aggiungere 20 ml di 1% (m / v) di istamina.
- Mescolare e centrifugare a 1000 xg per 5 sec.
- Posizionare un micro fiala all'interno di una fiala universale.
- Trasferire il campione nel micro fiala e tappare la fiala universale. Versare il campione verso l'alto per non introdurre bolle.
- Conservare a 2-8 ° C per un massimo di 1 giorno.
- Posizionare la fiala universale (con micro flacone contenente la soluzione di esempio) nel vassoio di ingresso del campione.
3. Preparazione del sistema CE.
- Sistema CE di pulizia.
NOTA: Comportamento °è operazione almeno una volta alla settimana per evitare perdite di corrente elettrica derivata da accumulo di polvere e detriti. Tuttavia, a seconda dell'applicazione (per esempio, l'uso di un BGE con maggiore viscosità o ad alta concentrazione salina, campioni con un aumento di viscosità) elettrodi e leve di apertura può richiedere di essere pulito più frequentemente per evitare la contaminazione incrociata e trascinamento del campione.- Spegnere l'interruttore di alimentazione dello strumento CE e aprire lo sportello anteriore.
- Pulire la superficie della copertura del campione, campione tenendo sistema (campione e tampone vassoi), copertura della cartuccia, barra di bloccaggio, blocco dell'interfaccia e gli elettrodi con un inumidito con acqua non tessuto wipe. Ripetere la procedura con un etanolo-inumidito pulire e asciutto prima dell'uso.
- Lavare le leve di apertura a fondo con acqua. Pulire la superficie con un tessuto non tessuto pulire. Ripetere la procedura con un etanolo-inumidito pulire ed asciugare prima dell'installazione.
- Pulire le due estremità del cavo in fibra ottica attentamente con un panno in microfibra inumidito con acqua. Ripetere la procedura con un panno inumidito etanolo.
- Cartuccia.
- Rimuovere un nuovo capillare neutra (50 micron di diametro interno) dalla confezione.
- Nastro giù una estremità del capillare tubo protettivo al banco da lavoro. Srotolare, raddrizzare e tirare il capillare fuori il tubo.
- Attaccare un pezzo di nastro o di carta al banco da lavoro e aggiungere contrassegni di misura come segue: lunghezza al rivelatore (30 cm), la finestra capillare (0,2 cm) e lunghezza all'estremità di uscita (10 cm) (cioè, lunghezza 40,2 cm totale, 30.0 cm di lunghezza efficace).
- Allineare la finestra capillare per il marchio di misura 0,2 centimetri nel documento di riferimento. Fissare il capillare con nastro e segnare l'estremità del capillare 2 mm al di fuori delle marche di stazza.
- Tagliare il cappuccio protettivo all'estremità di entrata capillare (l'estremità più lontana dalla finestra) in un unico movimento rettilineo utilizzando il bordo a filo della pietra scissione.
- Immergere l'estremità capillare in una fiala universale ricoperto riempita con acqua al fine di evitare danni permanenti al rivestimento interno capillare. Ripetere questa procedura ogni volta che l'estremità capillare è esposto al ambiente per più di 1 min.
- Inserire l'estremità di ingresso capillare sul lato di uscita della cartuccia.
- Premere e tirare il capillare attraverso la cartuccia necessaria fino a quando la finestra capillare è centrato alla finestra cartuccia.
- Inserire la spina di apertura (100 micron x 200 micron) nella finestra cartuccia.
NOTA: Verificare che la luce bianca passa attraverso la finestra quando esposti ad una sorgente di luce bianca. Se la luce che passa attraverso ha un aspetto brunastro, regolare come necessario. - Inserire il capillare nel tubo del liquido di raffreddamento preformato per una lunghezza totale capillare di 40,2 cm (con dado tubi pre-installato, puntale e O-ring ad entrambe le estremità in questo ordine).
- Spingere il capillare attraverso il coolantubazione t necessaria fino a quando il capillare appare all'altro lato del tubo.
- Inserire l'estremità del tubo refrigerante nel lato di uscita della cartuccia e serrare il dado tubo.
- Inserire l'estremità di ingresso capillare nel lato di ingresso della cartuccia.
- Premere e tirare il capillare attraverso la cartuccia necessaria fino a quando il capillare appare al lato ingresso della cartuccia.
- Inserire l'estremità del tubo del refrigerante nel lato di entrata della cartuccia e serrare il dado tubo.
- Tagliare il cappuccio protettivo sulla estremità di uscita capillare (l'estremità più vicina dalla finestra) in un unico movimento rettilineo utilizzando il bordo a filo della pietra scissione.
- Inserire le clip di tenuta-fermo sulle estremità dei capillari e premere per scattare in posizione. Effettuare il controllo visivo termina la capillare. Se non lo sono nemmeno, ripetere la procedura.
- Posizionare il modello capillare lunghezza sul bordo del banco di lavoro.
- Posizionare la cartuccia rivolta verso il basso against il modello capillare di lunghezza e allineare l'estremità del capillare con le linee di riferimento sul modello. Se i segni di misura capillare (vedi 3.2.4) non si allineano con le linee di riferimento, regolare come necessario.
- Mantenere il capillare contro il modello capillare di lunghezza e tagliare entrambe le estremità del capillare utilizzando il bordo a filo della scissione pietre 2 mm al di sotto delle linee di riferimento del modello.
- Controllare visivamente il capillare si conclude con una lente di ingrandimento. Se estremità capillari non sono uniformi, lustrare utilizzando il volto morbido della pietra scissione.
- Inserire l'O-ring di apertura nel foro del tappo apertura utilizzando lo strumento di inserimento O-ring.
- Installare fiale universali ricoperti pieni d'acqua nel bossolo e la cartuccia posto in caso immediatamente con le estremità dei capillari inserite in fiale. Per la conservazione a breve e lungo termine, tenere a 2-8 ° C.
- Preparazione dei vassoi tampone.
- Riempire e mettere univers innevateAl fiale in ingresso del buffer e vassoi di uscita (figura 1). le posizioni delle fiale si ripetono in corsie 2, 3, 4 e 5 secondo con il numero di campioni da analizzare, ponendo una corsia per ogni sei iniezioni di campione.
NOTA: evitare di bagnare i tappi dei flaconi al fine di evitare la dispersione di corrente.
- Riempire e mettere univers innevateAl fiale in ingresso del buffer e vassoi di uscita (figura 1). le posizioni delle fiale si ripetono in corsie 2, 3, 4 e 5 secondo con il numero di campioni da analizzare, ponendo una corsia per ogni sei iniezioni di campione.
Figura 1: Posizione e livello di riempimento di fiale universali nei vassoi di entrata e uscita del buffer. Riempire i livelli: 1/1 = 1400 ml, 3/4 = 1300 ml e 1/2 = 1000 ml. Abbreviazioni: W = acqua, HCl = 0,1 M di acido cloridrico. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
- Sistema CE componenti di assemblaggio.
- Installare il rivelatore UV.
- Installare le leve di aperturapremendo fino al blocco di interfaccia.
- Installare il cavo in fibra ottica. Inserire l'estremità corrispondente alla barra di bloccaggio e, tenendo entrambe le estremità, ruotare in senso orario. Collegare l'altra estremità al rivelatore UV.
NOTA: Maneggiare il cavo in fibra ottica con cura durante questa procedura poiché flessione potrebbe causare la sua frattura. - Collocare il campione e vassoi di buffer nel sistema di campionamento detenzione e scattano in posizione.
- Posizionare la cartuccia capillare nel blocco di interfaccia e, mentre premendo la barra di serraggio a entrambe le estremità, serrare le manopole.
4. Metodi Instrument Set-up
- Creare il condizionamento, esecuzione e metodi strumentali arresto secondo i seguenti parametri e Tabella 1: Tensione, max: 30,0 kV; Corrente, max: 300.0 μA; Temperatura di cartuccia: 20.0 ° C; temperatura di conservazione del campione: 10,0 ° C; rivelatore UV condizioni iniziali: Lunghezza d'onda: 214 nm; Velocità dati: 4 Hz; Filtro: Normal; Larghezza di picco (punti): 16-25; Segnale di assorbanza: Direct.
NOTA: tasso di acquisizione dei dati può essere aumentata fino a 25 Hz per migliorare la copertura di zone di separazione strette.
| Condizionata programma orario metodo | |||||||
| Tempo (min) | Evento | Valore | Durata | fiala di ingresso | fiala outlet | sommario | Commenti |
| - | Risciacquare - Pressione | 2068 mbar | 1.0 min | BI: C1 | BO: C1 | Inoltrare | HCl 0,1 M |
| - | Risciacquare - Pressione | 2068 mbar | 2.0 min | BI: B1 | BO: C1 | Inoltrare | Acqua |
| - | Risciacquare - Pressione | 2068 mbar | 10.0 min | BI: E1 | BO: C1 | Inoltrare | BGE |
| 0.00 | Indipendente - Tensione | 15,0 KV | 10.0 min | BI: D1 | BO: D1 | 0,17 rampa Min, polarità normale | Separato |
| 10.00 | Risciacquare - Pressione | 2758 mbar | 10.0 min | BI: E1 | BO: C1 | Inoltrare | BGE |
| 20.01 | Aspetta | - | 0,0 min | BI: A1 | BO: A1 | - | punte di risciacquo |
| L'esecuzione del programma di tempo metodo | |||||||
| Tempo (min) | Evento | Valore | Durata | fiala di ingresso | fiala di uscita | sommario | Commenti |
| - | Risciacquare - Pressione | 2068 mbar | 1.0 min | BI: C1 | BO: C1 | Avanti, In / Out inc vial 6 | HCl 0,1 M |
| - | Risciacquare - Pressione | 2068 mbar | 2.0 min | BI: B1 | BO: C1 | Avanti, In / Out inc vial 6 | acqua |
| - | Risciacquare - Pressione | 2068 mbar | 4,0 min | BI: E1 | BO: C1 | Avanti, In / Out inc vial 6 | BGE |
| - | Iniettare - Pressione | 34 mbar | 20,0 sec | SI: A1 | BO: B1 | Override, Forward | iniezione del campione |
| - | Aspetta | - | 0,4 min | BI: A1 | BO: A1 | In / Out inc vial 6 | LAVAGGIO |
| 0 | Indipendente - Tensione | 15,0 KV | 30.0 min | BI: D1 | BO: D1 | 0,17 rampa Min, polarità normale, In / Out inc vial 6 | Separazione del campione |
| 0.5 | Autozero | - | - | - | - | - | - |
| 30.01 | smettere di dati | - | - | - | - | - | - |
| 30.02 | Risciacquare - Pressione | 2068 mbar | 2.0 min | BI: B1 | BO: C1 | Avanti, In / Out inc vial 6 | acqua |
| 32.03 | Aspetta | - | 0,0 min | BI: A1 | BO: A1 | In / Out inc vial 6 | punte di risciacquo |
| 32.04 | Fine | - | - | - | - | - | Fine |
| Shutdown programma orario metodo | |||||||
| Tempo (min) | Evento | Valore | Durata | fiala di ingresso | fiala outlet | sommario | Commenti |
| - | Risciacquare - Pressione | 2068 mbar | 1.0 min | BI: E6 | BO: E6 | Inoltrare | HCl 0,1 M |
| - | Risciacquare - Pressione | 2068 mbar | 6.0 min | BI: F6 | BO: F6 | Inoltrare | acqua |
| - | Lamp - Spento | - | - | - | - | - | - |
| - | Aspetta | - | 0,0 min | BI: A1 | BO: A1 | - | punte di risciacquo |
Tabella 1: condizionamento, esecuzione e programmi orari di spegnimento.
5. acquisizione ed elaborazione dati
- Programmare il campionario.
- Programmare il capillare per condizionare utilizzando il metodo dello strumento condizionata. Quando si utilizza il capillare per la prima volta, il programma quattro ripetizioni; altrimenti programmare solo due ripetizioni del metodo di condizionamento.
- Programmare i campioni da analizzare con il metodo dello strumento in esecuzione.
- Programmare il capillare per la memorizzazione utilizzando il metodo dello strumento di arresto e ripetere la procedura indicata nella sezione 3.2.22.
- Simula.
- Esportare i elettroferogrammi.
- Calcolare il tempo di migrazione ed il contenuto percentuale di base, un principaleisoforme acidi nd utilizzando l'integrazione linea dislivello del profilo dell'elettroferogramma.
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Risultati
La Figura 2 mostra il profilo corrente elettrica tipica di 200 mM EACA, 30 mM acetato di litio, pH 4.8 BGE con il campione anti-TNFa mAb diluito con tampone Tris (50 mM, pH 8,0). Come si può osservare, la corrente è stabile durante l'analisi e può oscillare tra i valori di 30 a 35 μA. La Figura 3 mostra l'elettroferogramma CZE di un campione in bianco dove il picco rilevato corrisponde allo standard interno istamina. Si prevede di istamina per av...
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Discussione
In questo tutorial, si evidenzia l'importanza di pratiche corrette per lo svolgimento di analisi CZE di anticorpi monoclonali, al fine di aumentare la probabilità di avere successo. Tuttavia, quando CZE viene utilizzato su una base di routine, i problemi sorgono inevitabilmente 12.
Per ottenere i migliori risultati, è importante seguire le note che sono stati inclusi in tutto il protocollo, in quanto vi aiuterà l'analista a superare e risolvere i problemi passaggi difficil...
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Dichiarazioni
Gli autori Carlos E. Espinosa-de la Garza, Rodolfo D. Salazar-Flores, Néstor O. Pérez, Luis F. Flores-Ortiz e Emilio Medina-Rivero sono dipendenti di Probiomed S.A. de C.V., che sviluppa, produce e commercializza prodotti biosimilari. Tutti gli autori sono coinvolti nello sviluppo di prodotti biosimilari per Probiomed.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Wiley per il permesso concesso di utilizzare i concetti della seguente pubblicazione per questo tutorial. Carlos E. Espinosa-de la Garza, Francisco C. Perdomo-Abúndez, Jesús Padilla-Calderón, Jaime M. Uribe-Wiechers, Néstor O. Pérez, Luis F. Flores-Ortiz, Emilio Medina-Rivero: Analisi di anticorpi monoclonali ricombinanti mediante elettroforesi della zona capillare. Elettroforesi. 2013. 34. 1133-1140. Diritti d'autore Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Questo lavoro è stato sostenuto da CONACyT, Messico, sovvenzione 230551.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acido acetico glaciale | Tecsiquim | AT0035-7 | |
| Acido cloridrico di grado ACS | J.T. Baker | 9535-05 | |
| Istamina dicloridrato | Fluka | 53300 | |
| (idrossipropil) metilcellulosa | Fluka | 09963 | |
| Acetato di litio | Sigma-Aldrich | 517992 | |
| Acido 6-aminocaproico | Sigma-Aldrich | A2504 | |
| eCAP Tris Buffer, 50,0 mM, pH 8 | Beckman Coulter | 477427 | |
| PA 800 Plus Sistema di analisi farmaceutica | Beckman Coulter | A66528 | |
| eCAP Capillare neutro | Beckman Coulter | 477441 | |
| Fiale, Micro, 200 &Micro; l | Beckman Coulter | 144709 | |
| Tappi universali per fiale | Beckman Coulter | A62250 | |
| Fiale universali | Beckman Coulter | A62251 | |
| Cavo, ottica, UV/VIS | Beckman Coulter | 144093 | |
| Modulo rivelatore UV/VIS | Beckman Coulter | 144733 | |
| Kit di montaggio cartuccia, | Beckman Coulter |
Riferimenti
- Bruno, V., Battaglia, G., Nicoletti, F. The advent of monoclonal antibodies in the treatment of chronic autoimmune diseases. Neurol. Sci. 31, 283-288 (2011).
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