Sintonizzabile idrogel da polmonare matrice extracellulare per colture cellulari 3D

Sommario

Questo è un metodo per creare un 3-dimensionale scaffold coltura cellulare dalla matrice extracellulare polmonare. polmone Intact è trasformato in idrogel in grado di sostenere la crescita delle cellule in tre dimensioni.

Abstract

Qui vi presentiamo un metodo per stabilire più idrogel di coltura cellulare di componenti per vitro coltura cellulare del polmone in. Cominciando con sano en bloc tessuto polmonare da suini, ratti, o il mouse, il tessuto è perfuso e immerso in successive detergenti chimici per rimuovere i detriti cellulari. Confronto istologica del tessuto prima e dopo l'elaborazione conferma rimozione di oltre il 95% della doppia elica colorazione del DNA e alfa galattosidasi suggerisce la maggioranza dei detriti cellulari viene rimosso. Dopo decellularization, il tessuto è liofilizzata e quindi cryomilled in una polvere. La polvere matrice viene digerito per 48 ore in una soluzione di pepsina di digestione acida e quindi neutralizzato per formare la soluzione pregel. Gelificazione della soluzione pregel può essere indotta da incubazione a 37 ° C e può essere utilizzato immediatamente dopo neutralizzazione o conservato a 4 ° C per un massimo di due settimane. I rivestimenti possono essere formati usando la soluzione pregel su una lastra non trattata per cattaccamento ell. Le celle possono essere sospesi in pregel prima autoassemblaggio per ottenere una coltura 3D, placcato sulla superficie di un gel costituito da cui le cellule possono migrare attraverso il ponteggio, o placcato sui rivestimenti. Modifiche alla strategia presentati possono influenzare la temperatura di gelificazione, la forza, o taglie frammento di proteina. Al di là di formazione idrogel, la rigidità idrogel può essere aumentata mediante genipina.

Introduzione

Tradurre i risultati in vitro in clinica è uno dei problemi più impegnativi che i ricercatori biomedici devono affrontare. La ricerca in vitro sulla plastica per colture tissutali è più facile, più conveniente e mantiene un'elevata vitalità cellulare. ¹ Questo approccio è un punto di partenza ragionevole, ma i risultati hanno una traduzione clinica limitata. Sempre più spesso, i laboratori stanno incorporando costrutti tridimensionali per sostituire i tradizionali metodi bidimensionali. Sono disponibili revisioni per molti ambienti tridimensionali, dagli scaffold biologici agli scaffold polimerici. ^2,3

Le strutture biologiche possono imitare le caratteristiche degli ambienti in vivo poiché contengono molte delle proteine e dei glicosaminoglicani componenti della matrice nativa e forniscono siti di legame familiari a cui le cellule possono attaccarsi e riconoscere. È stato dimostrato che i materiali derivati dalla matrice extracellulare (ECM) sono scaffold capaci per l'adesione e la proliferazione cellulare. ⁴ Una sfida che limita l'applicazione delle piattaforme di idrogel ECM deriva dalle loro proprietà meccaniche intrinsecamente deboli dopo la gelificazione. Il tessuto nativo ha spesso proprietà meccaniche che sono di grandezza superiore a quelle degli idrogel. Gli agenti reticolanti non tossici possono aumentare le proprietà meccaniche degli idrogel per imitare meglio l'ambiente tissutale nativo. La genipina è un reticolante naturale non tossico derivato dalle piante di Gardenia con la capacità di adattare da vicino le proprietà meccaniche della ECM con variazioni della concentrazione di genipina^5,6.

Quasi tutte le cellule del corpo esistono e si organizzano su ECM che producono o mantengono. La nuova attenzione all'importanza universale della MEC nell'organizzazione, nelle condizioni e nella funzione di ogni organo o sistema ha stimolato la produzione di piattaforme basate su matrici per l'indagine in vitro. La sottomucosa dell'intestino tenue suino è l'impalcatura di derivazione naturale più studiata ed è stata utilizzata per rigenerare tendini, legamenti, muscolo scheletrico⁴ e persino osso⁷. Anche le matrici di altri organi e specie di donatori hanno dimostrato un buon potenziale di rigenerazione tissutale. L'uso di componenti ECM estranei causa problemi minimi con l'immunomodulazione. Dopo l'eliminazione della materia cellulare ospite, la ECM rimanente sarà simile nel contenuto di aminoacidi e nell'organizzazione a tutte le altre specie di mammiferi⁸. C'è una crescente linea di pensiero secondo cui il modo migliore per esaminare le interazioni cellula-ECM in vitro è quello di utilizzare scaffold ECM specifici per organo. Ogni organo fornisce una composizione unica di proteine e proteoglicani per creare nicchie cellulari. Le nicchie forniscono la rottura strutturale, funzionale e persino enzimatica della matrice extracellulare contribuendo alla segnalazione biofisica. Per ottenere un microambiente in vitro più simile al microambiente in vivo, l'uso di ECM tessuto-specifici ottimizzerebbe le nicchie cellulari per la ricerca.

L'obiettivo di questo protocollo è fornire un metodo per stabilire un'impalcatura di idrogel unica per la ECM polmonare. Questo metodo fornisce una piattaforma per la ricerca in vitro sulle interazioni cellula polmonare-ECM.

Protocollo

Soluzione	filtro sterile	Indicazioni
DIH 2 O	sì	DIH 2 O; sterile filtrato
0,1% soluzione di Triton X-100	sì	Sotto cappa aggiungere 100 ml Triton-X 100 Soluzione a 100 ml DIH 2 O e agitare fino alla dissoluzione; filtro sterile.
2% Desossicolato Soluzione	sì	Sotto cappa aggiungere 2 g di sodio soluzione Desossicolato per 100 ml DIH 2 O e agitare fino alla dissoluzione; filtro sterile
1 M NaCl	sì	Aggiungere 58,44 g di NaCl a 1 L di DIH 2 O; agitare fino a scioglimento; filtro sterile
soluzione DNasi	sì	Aggiungere 12.000unità di DNasi a 1 L DIH 2 O; Aggiungere 0,156 g MgSO 4 (Anidro), e 0,222 g CaCl 2; agitare fino a scioglimento; filtro sterile
PBS	sì	Unire 27,2 g di Na 2 HPO 4 · 7H 2 O (bibasico eptaidrato), 80 g di NaCl, e 2 g KCl con 10 L DIH 2 O; agitare fino a scioglimento; aggiustare il pH a 7,4; filtro sterile

Tabella 1: soluzioni necessarie per Tissue Decellularization. Effettuare le soluzioni di cui sopra per il processo di decellularization. Conservare a 4 ° C. Circa 2,5 L sarà necessario per un polmone suino.

1. Formazione Hydrogel

1. Suina Lung Decellularization (adattato da riferimenti ^9,10)
   1. Ottenere un blocco normale polmone suino, da un macello, con il cuore e Vasculature intatto.
   2. Utilizzare forbici di tessuto o un bisturi per sezionare il cuore, vasi più vicino possibile al cuore di taglio, la vascolarizzazione sarà utilizzato in fasi successive per perfusione.
   3. sezionare cura di collocare il tessuto connettivo circostante la trachea, bronchi e vasi con un bisturi o forbici.
      NOTA: determinare le migliori polmone da utilizzare per il resto della procedura con la scelta di un polmone, senza grandi tagli o punture attraverso la pleura e grandi quantità di atelettasia o occlusione vascolare che possono ostacolare l'efficacia del processo di decellularization.
   4. Tagliare il polmone non ottimale lasciando tanto bronchi attaccati alla trachea possibile (cuore, tessuto connettivo e i lobi del polmone rimosso può essere smaltito). Ci dovrebbe essere un polmone rimanendo attaccata alla trachea e vascolare.
      NOTA: Conservare sezioni per istologia se lo si desidera. ⁹
   5. Chiudere bronchi scollegati con pinze o sutura per prevent riflusso eccesso.
   6. Preparare le soluzioni decellularization e conservare in frigorifero a 4 ° C fino al momento (Tabella 1).
   7. Utilizzando una pompa a mano cannulata per adattare l'arteria polmonare, profumato il tessuto polmonare 3 volte con acqua deionizzata sia attraverso l'arteria polmonare e la trachea. Profumato vascolarizzazione prima volta in volta. Iniziare con circa 1 L nel sistema vascolare e 1,5 L in trachea per ogni perfusione, ma come detriti cellulari viene rimosso più liquido può essere perfusi attraverso il sistema.
   8. Profumato sia vascolarizzazione e la trachea con Triton X-100 soluzione.
   9. Immergere tessuto polmonare in Triton X-100 soluzione per 24 ore a 4 ° C.
   10. Perfuse vascolare e trachea 3 volte con acqua deionizzata per sciacquare.
   11. Profumato sia vascolarizzazione e la trachea con la soluzione desossicolato.
   12. Immergere le sezioni di tessuto in desossicolato per 24 ore a 4 ° C.
   13. Perfuse vascolare e trachea 3 volte con acqua deionizzata per sciacquare.
   14. Profumato sia vascolarizzazione e la trachea con soluzione di NaCl.
   15. Immergere il tessuto in soluzione NaCl filtrata per 1 ora a 4 ° C.
   16. Perfuse vascolare e trachea 3 volte con acqua deionizzata per sciacquare.
   17. Profumato sia vascolarizzazione e la trachea con una soluzione di DNasi.
   18. Immergere il tessuto in soluzione DNasi filtrata per 1 ora a 4 ° C.
   19. Profumato sia vascolare e la trachea 5 volte con PBS.
   20. Sezionare via tessuto cartilagineo evidente, trachea e tutto tubuli 2 mm o più di diametro (che si trova principalmente attorno l'ilo e porzioni mediali dei polmoni) di condurre le vie aeree, lasciando solo le zone respiratorie (soprattutto le aree periferiche).
   21. Sezionare il tessuto in 1 sezioni pollici o più piccoli. Orientamento del tessuto non ha importanza per questo passo.
   22. Eliminare il tessuto liquido in eccesso e in 50 ml provette coniche. Congelare il tessuto a -80 ° C.
       NOTA: Mantieni sezioni per l'esame istologico per garantire la rimozione di cellule e debri cellulares, se desiderato. Usiamo H & E, α-galattosidasi, PicoGreen, idrossiprolina, ninidrina, Alcian blu, SDS-PAGE, e spettrometria di massa per la caratterizzazione. ⁹
2. Lung Processing
   1. Rimuovere i coperchi da tubi congelati contenenti tessuto polmonare decellularized.
   2. Mettere carta da filtro sopra l'apertura del tubo e fissare con nastro di gomma.
      NOTA: Tube e contenuto deve ancora essere congelati comunque di trovarsi in -80 ° C fino congelati.
   3. Lyophilize il tessuto fino a quando tutto il liquido in eccesso è andato, utilizzando un liofilizzatore secondo le istruzioni del produttore. Conservare a -80 ° C fino al momento di mulino.
   4. Prima di iniziare aggiungere azoto liquido fresare freezer per raffreddare isolamento e componenti interni alle condizioni di lavoro.
   5. Rimuovere la barra mulino magnetica dal tubo di mulino e aggiungere il tessuto per coprire fondo.
   6. Sostituire bar mulino e aggiungere il tessuto poco compresso. La barra mulino deve ancora muoversi liberamente.
   7. Chiudere la provetta mulino e PLAce nel mulino congelatore.
   8. Riempire azoto liquido per la linea di riempimento massimo.
   9. Mulino Congelatore tutto il tessuto in polvere fine (circa 5 minuti, il tasso di compressione pari a ~ 600 min ^-1), in un cilindro di policarbonato con un dispositivo di simulazione in acciaio inox così come tappi terminali in acciaio inox con il mulino congelatore secondo le istruzioni del produttore. Conservare a -80 ° C fino al momento dell'uso.
3. Micro-porosa formazione di gel (8 mg / ml) (adattato da riferimenti ^9,11)
   1. Aggiungere 1% (w / v) di polvere decellularized e 0,1% (w / v) di pepsina per 0,01 M HCl, sotto costante agitazione (dovrebbe essere in grado di vedere il flusso a livello superiore del liquido), a temperatura ambiente, per 48 hr.
      NOTA: La polvere viene caricata staticamente, in modo da aggiungere il HCl dopo la polvere offre la possibilità di lavare l'eccesso al largo delle pareti del tubo.
   2. Dopo la digestione per 48 h, porre la soluzione e reagenti in ghiaccio per 5 min.
   3. Utilizzando refrigerato 10% (v / v) 0,1 M NaOH, und 11.11% (v / v) 10x PBS (per portare l'intera soluzione a 1x concentrazione), portare la soluzione proteica digerita a pH fisiologico di 7,4.
      NOTA: La soluzione può essere conservato a 4 ° C per una settimana. Eseguire la cinetica di gelificazione utilizzando reometria ⁹ se lo si desidera.

2. Cross-collega idrogeli per migliorare la resistenza meccanica

1. Soluzioni di 1%, 0,1% e 0,01% w / v soluzione genipina reticolazione sono state preparate sciogliendo la necessaria quantità di polvere genipina in 10% DMSO.
2. Agitare la soluzione ogni 15 min per 1 ora.
3. Aggiungere la soluzione genipina per coprire idrogel ECM (100 microlitri per ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti) che sono stati precedentemente assemblati in parte 1.3.4.
4. Lasciare ogni idrogel ECM per reticolare per 24 ore a 37 ° C.
5. Risciacquare l'idrogel ECM 3 volte con PBS fino a quando la soluzione di lavaggio non è più blu. Gli idrogel reticolati saranno quindi pronto per l'ulteriore caratterizzazione e cestudi su colture ll.

3. coltura cellulare con microporosa Gel

1. Rivestimento bidimensionale
   1. Utilizzando la soluzione dalla 1.3.3, aggiungere 20 ml di soluzione pregel a ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti non trattate.
   2. durante la notte in frigorifero a 4 ° C per consentire la proteina adsorbimento al piatto.
   3. Aspirare soluzione PreGel e risciacquare con PBS.
   4. Cellule Passage ^9.
   5. Aggiungere 10.000 cellule / cm ² per pozzi.
   6. Aumentare la media per 100 pl per pozzetto e incubare a 37 ° C.
2. Tre coltura cellulare dimensionale ⁹
   1. Utilizzando la soluzione da 1.3.3, risospendere le cellule pellet ad una concentrazione di 1.000.000 cellule / ml di soluzione pregel.
   2. erogare rapidamente 16 ml di sospensione PreGel cellule in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, in modo da formare un idrogel di spessore ~ ​​500 micron per la coltura delle cellule 3D.
   3. Incubare a 37 ° C per 30min per il gel per formare.
   4. Aggiungere 100 microlitri di media all'inizio idrogel formati e incubare a 37 ° C.
3. Tre coltura cellulare tridimensionale su gel di rigidità variabili
   1. Utilizzando la soluzione da 1.3.3, pipetta 100 ml di soluzione di PreGel in ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti.
   2. Incubare a 37 ° C per 30 minuti per gel di forma.
      Nota: Cross-collega passi dalla parte 2 può essere usato qui.
   3. Cellule Passage ^9.
   4. Aggiungere 10.000 cellule / cm ² per pozzi.
   5. Aumentare la media per 100 pl per pozzetto e incubare a 37 ° C.

Risultati

Utilizzando questo metodo, abbiamo prodotto idrogel di maiale normale, ratto, e polmoni del mouse (Figura 1). polmoni trasformati forniscono una stima rispettivamente 5 mg, 40 mg e 10 g di polvere di ECM. Una panoramica del processo è mostrato nella figura 2. visualizzazioni chiave durante il processo sono: l'aspetto bianco dei polmoni dopo il risciacquo desossicolato; dopo la formazione pregel, la soluzione deve essere opaco e la soluzione deve apparire...

Discussione

Uno degli aspetti integranti della biologia è l'auto-organizzazione di molecole in strutture gerarchiche che svolgono un compito specifico. ¹³ Nel laboratorio, auto-assemblaggio dipende da numerosi fattori quali la concentrazione di sale, il pH e la durata digestione. Come si vede, un auto-organizzazione forme idrogel quando le proteine ​​solubilizzati torna a una temperatura fisiologica. L'idrogel formatosi è in grado di promuovere l'attaccamento cellulare e la proliferazione in vitro. <...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100	Utilizzo in cappa aspirante con protezione per gli occhi e guanti.
Desossicolato di sodio	Sigma-Aldrich	D6750-100g	Utilizzare in cappuccio con protezione per gli occhi e guanti.
Solfato di magnesio	Sigma-Aldrich	M7506-500g	Nessuno
Cloruro di calcio	Sigma-Aldrich	C1016-500g	Nessuno
DNasi	Sigma-Aldrich	D5025-150KU	Nessuno
HCl	Sigma-Aldrich	258148-500ML	Utilizzare con protezione per gli occhi e guanti.
Pepsin	Sigma-Aldrich	P6887-5G	Utilizzare in cappa aspirante con protezione per gli occhi e guanti.
Idrossido di Sodio	Fisher Scientific	BP359-500	Utilizzare con protezione per gli occhi e guanti.
Genipin	Wako Chemicals	078-03021	Utilizzare in cappa aspirante con protezione per gli occhi e guanti.
PBS 10x	Qualità Biologica	119-069-151	Nessuno
PBS	VWR	45000-448	Nessuno
Carta da filtro	Whatman	8519	N/A
Pompa a mano	Fisher Scientific	10-239-1	N/A
Bicchiere graduato	VitLab	445941	N/A
Cryomill	SPEX	6700	Utilizzare cryogloves e occhio protezione.
Liofilizzatore	FTS FlexiDry		Utilizzare i guanti.
Reometro	Discovery	HR-2	Utilizzare guanti e protezione per gli occhi.