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Articolo metodologico

Attivazione di autofagia per esercizio aerobico nei topi

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DOI:

10.3791/55099

⸱

3 febbraio 2017

 , 
1Department of Cell and Molecular Biology, Northwestern University

In questo articolo

Sommario

attivazione autofagia è utile nella prevenzione di varie malattie. Uno degli approcci fisiologiche per indurre autofagia in vivo è l'esercizio fisico. Qui mostriamo come attivare l'autofagia da esercizi aerobici e misurare i livelli di autofagia nei topi.

Abstract

L'autofagia è una via di degradazione lisosomiale essenziale per l'omeostasi, la funzione e la differenziazione cellulare. In condizioni di stress, l'autofagia è indotta e prende di mira vari carichi, come citosol di massa, organelli danneggiati e proteine mal ripiegate, per la degradazione nei lisosomi. Le molecole nutritive risultanti vengono riciclate nel citosol per una nuova sintesi proteica e la produzione di ATP. L'upregolazione dell'autofagia ha effetti benefici contro la patogenesi di molte malattie e sono state riportate strategie farmacologiche e fisiologiche per attivare l'autofagia. L'esercizio aerobico è stato recentemente identificato come un efficiente induttore dell'autofagia in più organi nei topi, tra cui muscoli, fegato, cuore e cervello. Qui mostriamo le procedure per indurre l'autofagia in vivo mediante esercizio forzato sul tapis roulant o corsa volontaria sulla ruota. Dimostriamo anche metodi microscopici e biochimici per analizzare quantitativamente i livelli di autofagia nei tessuti di topo, utilizzando le proteine marcatrici LC3 e p62 che vengono trasportate e degradate nei lisosomi insieme agli autofagosomi.

Introduzione

Autofagia è un percorso di degradazione evolutivamente conservato, che viene indotta in risposta a varie condizioni di stress come la fame e ipossia 1, 2. Durante l'autofagia, vescicole a doppia membrana, chiamato autofagosomi, incorporano componenti subcellulari inutili o danneggiati e trasportarli nei lisosomi per la degradazione 3. Autofagia basale è essenziale per la funzione cellulare e lo sviluppo dell'organismo, e alterata autofagia basale è implicato in molti disturbi, tra cui neurodegenerazione, tumorigenesi e diabete di tipo 2 4, 5, 6.

Il più noto autofagia induttore fisiologico è fame. Tuttavia, ha due limitazioni principali. In primo luogo, la fame richiede un lungo periodo di indurre l'autofagia in modo efficace negli animali, ad esempio, 48 ore di restrizione alimentare nei topinella maggior parte degli organi. In secondo luogo, la fame induce a malapena autofagia cervello, a causa di un apporto di sostanze nutritive relativamente stabile nel cervello. In realtà, è anche difficile da rilevare induzione autofagia dagli induttori di piccole molecole, come molti farmaci non possono passare la barriera emato-encefalica. Così, per analizzare meglio la funzione di attivazione dell'autofagia nella patogenesi della malattia, abbiamo recentemente scoperto che l'esercizio fisico è più potente metodo fisiologico per indurre autofagia in un breve periodo di tempo 7, 8, 9. Rispetto fame, autofagia è effettivamente indotta da tapis roulant in esecuzione veloce come 30 min. Pertanto, l'esercizio fisico è un approccio fisiologico comodo e potente per studiare il meccanismo di autofagia nel mediare benefici per la salute e la prevenzione delle malattie.

Ci sono diversi marcatori proteici per la rilevazione di attività autofagia, tra cui LC3 e P62. LC3 (associata ai microtubuli proteina 1A / 1B-luce cHain 3) è una proteina citoplasmatica (LC3-formo) che viene coniugato con PE (fosfatidiletanolamina) su induzione autofagia. LC3 PE-lipidated (modulo LC3-II) viene reclutato su membrane autophagosomal e può essere utilizzato per visualizzare autophagosomes quando etichettati con GFP. La sua traslocazione dal citosol puntata strutture di autophagosomes al microscopio è un'indicazione di induzione autofagia. p62 è un recettore di carico per supporti autofagia (come proteine ​​ubiquitinazione), ed è incorporato autophagosomes pure. Poiché la proteina è degradata in lisosomi insieme autophagosomes, i suoi livelli possono essere usati per misurare il flusso autofagia. Qui mostriamo come utilizzare questi marcatori di quantificare l'autofagia in diversi tessuti di topo indotte da esercizio aerobico, compreso l'esercizio forzato (tapis roulant) e esercizio volontario (in esecuzione ruote). Le stesse procedure possono essere applicate anche alla misurazione in vivo dell'autofagia dopo il trattamento di altri induttori.

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Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida approvate dal Comitato Northwestern University istituzionale cura degli animali e Usa (IACUC).

1. modelli murini

  1. Utilizzare 8-12 settimane di età topi nella formazione esercizio. Per rilevare l'autofagia esercitato indotta in vivo, utilizzare il topi transgenici GFP-LC3 (C57BL / 6 di fondo) per studi di imaging e C57BL / 6 topi per le analisi biochimiche.

2. L'autofagia indotta da esercizio

  1. Messa a punto Treadmill - esercizio forzata
    1. Acclimatarsi e formare i topi in un 10 ° in salita tapis roulant aperto per 2 giorni. Il giorno 1, esercitare i topi per 5 min a 8 m / min, e il giorno 2, esercitare i topi per 5 min a 8 m / min seguito da un altro 5 min a 10 m / min 10. Incoraggiare i topi per eseguire delicatamente gomitata mano.
    2. Il giorno 3 °, lasciare che i topi sottoposti a un singolo attacco di corsa per 90 minuti a 10 ° in salita tapis roulant, starting alla velocità di 10 m / min. Dopo 40 min, aumentare la velocità treadmill ad una velocità di 1 m / min ogni 10 min per un totale di 30 min, e quindi aumentare la velocità alla velocità di 1 m / min ogni 5 min fino a raggiungere 17 m / min, per un totale di 90 minuti di tempo di esercizio e 1.070 metri di corsa a distanza.
    3. Impostare lo stimolo elettrico ad una gamma bassa intensità (1,2 Hz), e incoraggiare i topi a correre per evitare scosse piede ripetuto.
    4. Per la raccolta dei tessuti, eutanasia i topi per inalazione isoflurano, seguita da dislocazione cervicale immediatamente dopo l'esercizio. Altri metodi approvati eutanasia possono anche essere utilizzati, come CO2 o iniezione IP di altri anestetici. Il livello di autofagia non sembra essere influenzata da metodi di eutanasia.
  2. Messa a punto della ruota Running - esercizio volontario
    1. Posizionare una rotella del mouse-esecuzione (11,4 cm) all'interno di una gabbia con un mouse a singolo alloggiati.
    2. Verificare la capacità corrente con una contachilometri bicicletta.Impostare il parametro della ruota [distanza (in mm) per ogni rotazione completa della ruota] a 358 (11.4 * π). Misurare la distanza in esecuzione dopo 24 ore.
    3. Lasciate il mouse correre volontariamente per 2 settimane con la ruota in esecuzione. Per la raccolta dei tessuti, sacrificare il mouse al mattino dopo il periodo di esecuzione.

3. L'autofagia Flux valutazione

  1. Per misurare il flusso autofagica in condizioni di riposo e di esercizio, trattare i topi con la clorochina inibitore autofagia per tre giorni e confrontarle con topi trattati con PBS.
    1. Sciogliere clorochina in PBS (5 mg / ml), e iniettare clorochina in topi per via intraperitoneale alla dose di 50 mg / kg / giorno per tre giorni consecutivi. Sacrificio topi e raccogliere i tessuti 3 ore dopo l'ultima iniezione.
    2. Per i topi esercitati, li pretrattare con clorochina per due giorni consecutivi alla dose di 50 mg / kg / giorno. Il terzo giorno, iniettare i topi con la stessa concentrazione di clorochina, e dopo90 min li fanno correre sul tapis roulant per altri 90 min.
    3. Euthanize topi per inalazione isoflurano, seguita da dislocazione cervicale. Raccogliere tessuti immediatamente dopo l'esecuzione, in modo che il tempo totale di incubazione della clorochina è la stessa di controllo (a riposo) topi (3 ore).
      NOTA: In alternativa, utilizzare una singola iniezione di clorochina per determinare il flusso autofagia nei tessuti di topo.

4. Tessuto Raccolta e Fixation

  1. Prima della raccolta dei tessuti preparare tampone fosfato salino (PBS) e fresca 4% paraformaldeide (PFA, attenzione: dispositivi di protezione individuale richiesto) in PBS a un pH finale di 7,4. Conservare entrambe le soluzioni a 4 ° C.
  2. Riempire 30 ml siringa con 15 - 20 ml di PFA 4% (per i topi GFP-LC3). Collegare la siringa con un ago G 20 del catetere.
  3. Dopo l'esercizio, eutanasia i topi per inalazione isoflurano, seguita da dislocazione cervicale.
  4. Posto l'animale su una superficie di lavoro pulita sul suo back. Tagliare e aprire la cavità toracica tagliando il diaframma per esporre il cuore.
  5. Effettuare una piccola incisione sul fegato per lasciare il sangue uscire, e iniettare un totale di 15 ml 4% PFA lentamente nel ventricolo destro del cuore attraverso il catetere, fino al polmone e fegato girare completamente pallido. Profumato il mouse immediatamente dopo la sessione di esercizio, utilizzando una pompa a siringa con una portata costante di 90 ml / h.
  6. Dopo la perfusione, rimuovere l'ago e raccogliere i tessuti di interesse (ad esempio, del cervello 11 e muscolo scheletrico). Per muscolo scheletrico, sezionare vasto laterale. Brevemente, tirare la pelle della gamba all'indietro per esporre i muscoli, localizzare il quadricipite femorale 12 e sezionare vasto laterale, che è il muscolo esterno collegato alla parte superiore dell'osso femorale.
  7. Per ulteriori fissazione e disidratazione, posizionare i tessuti di topi GFP-LC3 in 4% PFA per 24 ore a 4 ° C, e poi trasferirli al 15%saccarosio-PBS a 4 ° C durante la notte o fino a quando i tessuti sono stabiliti, e quindi al 30% di saccarosio-PBS a 4 ° C durante la notte o per più lunghi periodi. Conservare i campioni al buio per quanto possibile in quanto possono essere sensibili a luce intensa.
  8. Per l'analisi Western Blot scatto congelare i tessuti da C57BL / 6 topi direttamente in azoto liquido, e conservare a -80 ° C.

5. Analisi Imaging di GFP-LC3 Puncta

  1. processo Tissue
    1. Pre-trattare i tessuti (precedentemente fissate in PFA e conservati nel 30% di saccarosio) nel mezzo di inclusione come "ottimali di taglio composto temperatura" (OCT) per pochi minuti in una piccola capsula di Petri etichettati.
    2. Trasferire il tessuto in una cryomold l'etichetta che contiene abbastanza fresco di Office per coprire il tessuto. Orient superficie sezionamento verso il fondo della cryomold (sezione per il muscolo vasto laterale e sezione sagittale per la emi-cervello). Evitare la formazione di bolle.
    3. freÈze campioni ponendo il cryomold per pochi minuti in un dispositivo di raffreddamento di schiuma coperto riempito con ghiaccio secco, fino PTOM diventa bianco. Avvolgere singoli campioni in fogli etichettati, chiuderli in un sacchetto di plastica, e conservarli a -80 ° C durante la notte o più a lungo.
    4. Utilizzare un criostato per tagliare le sezioni di esempio con uno spessore di 10 micron, e montare le sezioni sulle slitte. Conservare i vetrini a -20 ° C, e sempre tenere i vetrini al riparo dalla luce, quando possibile.
  2. preparazione del vetrino
    1. Estrarre i vetrini dal congelatore e scongelare a temperatura ambiente. Coprire la sezione di tessuto con una goccia di mezzo di montaggio con DAPI. Collocare un vetrino di dimensioni adeguate in cima ed evitare la formazione di bolle.
    2. Utilizzare smalto per sigillare i bordi del vetrino, consentire smalto si asciughi al buio a temperatura ambiente, e quindi memorizzare le diapositive in un contenitore a tenuta di luce a 4 ° C, o procedere con l'imaging cattura di GFP-LC3 puncta.
  3. La quantificazione di GFP - LC3 puncta al microscopio a fluorescenza
    1. Eseguire epifluorescenza, catturando le immagini nella stessa condizione (esposizione e le impostazioni) per tutti i campioni. Per GFP, utilizzare una lunghezza d'onda di emissione di 525 nm; per DAPI, usare 490 nm. Acquisire almeno dieci immagini al campione utilizzando un obiettivo 60X per vasto laterale e la regione della corteccia frontale del cervello.
    2. Quantificare il numero di GFP-LC3 puncta in una zona di tessuto di 2.500 micron 2 in ogni immagine per l'analisi statistica, accecato per gruppi sperimentali. Calcolare il numero medio di 10 immagini di ogni campione, utilizzando la funzione di misura automatica di "conteggio degli oggetti". Impostazioni per il muscolo vasto laterale sono: Soglia L = 10, H = 200; 2X liscia; 1X pulito, e le impostazioni per la corteccia frontale del cervello sono: Soglia L = 11, H = 200; 2X liscia; 1X pulito.

6. occidentale Analisi Blot su autofagia Marcatori

  1. processo Tissue
    1. Preparare il tampone di lisi: 50 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% Triton X-100; inibitore della proteasi e inibitori della fosfatasi (appena aggiunto).
    2. Rimuovere il tessuto di C57BL 6 topi / da -80 ° C di stoccaggio. Tagliare il tessuto muscolare in piccoli pezzi con una lama di rasoio prima il seguente processo. Aggiungere 800 ml (per emi-cervello) o 500 ml (per vasto laterale) di tampone di lisi freddo al campione. Omogeneizzare il campione a 4 ° C con un omogeneizzatore ad una velocità media.
    3. Completamente lisare la miscela omogeneizzata per altri 30 minuti per 1 ora a 4 ° C con rotazione.
    4. Centrifugare l'omogeneizzato a 12.000 xg per 10 min a 4 ° C, scartare il pellet, e raccogliere il surnatante in una nuova provetta.
  2. analisi autofagia
    1. Determinare la concentrazione di proteine ​​di lisati di tessuto utilizzando il kit di test BCA Protein in base alle specifiche del costruttore. Normalizzare ogni campionealla stessa concentrazione.
    2. Unire il campione con il tampone 2x Laemmli in un rapporto 1: 1, far bollire a 95 ° C per 5 - 10 minuti, e procedere con l'analisi Western Blot su autofagia marcatori 13, 14, come ad esempio P62 (anticorpo anti-P62, diluizione 1: 500) e LC3 (anticorpo anti-LC3, diluizione 1: 500). Lessare i campioni immediatamente dopo l'aggiunta del tampone, come più incubazione in ghiaccio può generare più bande degradate LC3.
    3. Quantificare P62 e LC3 bande di analisi densitometria utilizzando ImageJ, e normalizzare il valore al corrispondente banda di actina.

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Risultati

Questo protocollo descrive due diversi metodi per indurre l'autofagia nei tessuti di topo di esercizio aerobico: un totale di 90 minuti di esercizio fisico forzato su un tapis roulant a più corsie preceduto da due giorni di acclimatazione; o due settimane di esercizio volontario su una ruota in esecuzione usato dai topi alloggiati individualmente. In ogni protocollo di esercizio, siamo in grado di misurare il flusso autofagia da microscopia a fluorescenza e l'analisi Western Blot...

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Discussione

Autofagia è un processo catabolico che fornisce energia e riduce citotossicità dalla degradazione lisosomiale di anticitoplasma o organelli danneggiati. Studiare l'autofagia è importante capire la regolazione dell'omeostasi cellulare e meccanismi di risposta allo stress. Nuovi modelli e metodologie stanno emergendo nel campo della ricerca 15, per studiare come alterata autofagia contribuisce a numerosi processi patologici 16, 17. ...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Ringraziamo il Laboratorio di Istologia e Fenotipizzazione del Topo della Northwestern University per il supporto tecnico e l'assistenza, e Noboru Mizushima (Università di Tokyo) per aver fornito topi transgenici GFP-LC3. A. R. e C. H. sono stati supportati dai fondi di avvio della Northwestern University e dalla sovvenzione del National Institutes of Health (DK094980).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tapis roulantColumbus Instruments150-RM Exer 3/6
Ruota da corsa del mouseSuper Pet100079365diametro 11,4 cm
Campana del contachilometriDASHBOARD 100
Pompa a siringaKD ScientificKDS100
Microscopio a fluorescenzaNikonModello: microscopio invertito ECLIPSE
CryostatLeicaCM 1850UV
OmogeneizzatoreIKA003737001 / Modello: T10 Basic S1
ClorochinaCAYMAN CHEMICAL COMPANY14194
ParafolmaldehyeSIGMA-ALDRICHP6148Dispositivi di protezione individuale richiesti. Questo prodotto può rilasciare formaldeide gassosa, una sostanza chimica nota per causare il cancro.
Terreni di montaggioVector LaboratoriesH-1200
p62 anticorpoBD Biosciences610833
LC3 anticorpoNovus BiologicalsNB100-2220
2x Laemmli Sample BufferBio-Rad Laboratories161-0737
ImageJNIH

Riferimenti

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