Un sistema Microfluidic con Patterning superficie per indagare cavitazione Bubble (s) Interazione -cell e gli effetti biologici risultante nel livello di singola cellula

Summary

Un chip microfluidico è stato fabbricato per produrre coppie di punti d'oro per la generazione di bolle tandem e isole rivestite di fibronectina per il patterning di singole cellule nelle vicinanze. Il campo di flusso risultante è stato caratterizzato dalla velocimetria dell'immagine delle particelle ed è stato impiegato per studiare vari bioeffetti, tra cui la porzione della membrana cellulare, la deformazione della membrana e la risposta intracellulare del calcio.

Abstract

In questo manoscritto, abbiamo prima descriviamo il protocollo fabbricazione di un chip microfluidico, con punti d'oro e regioni fibronectina rivestite sullo stesso substrato di vetro, che controlla appunto la generazione di bolle tandem e cellule individuali modellata nelle vicinanze con sedi e forme ben definite. Abbiamo poi dimostrare la generazione di bolle tandem utilizzando due laser pulsati illuminanti un paio di punti d'oro con un ritardo di tempo alcuni microsecondi. Visualizziamo l'interazione bolla-bolla e la formazione di jet da immagini ad alta velocità e caratterizzano il campo di moto risultante utilizzando l'immagine di particelle velocimetria (PIV). Infine, vi presentiamo alcune applicazioni di questa tecnica per l'analisi singola cellula, tra cui poration cella a membrana con l'assorbimento macromolecola, deformazioni della membrana localizzata determinato dagli spostamenti di perline integrine vincolante attaccati, e la risposta di calcio intracellulare dalle immagini raziometrico. I nostri risultati mostrano che un flusso di getto veloce e direzionale è proprodotta dall'interazione bolla tandem, che può imporre una sollecitazione di taglio altamente localizzata sulla superficie di una cellula coltivata in prossimità. Inoltre, diversi effetti biologici possono essere indotti alterando la forza del flusso di getto regolando la distanza standoff dalla cella alle bolle tandem.

Introduction

Vi è una crescente consapevolezza che eterogeneità cellulare, derivanti dall'espressione stocastico di geni, proteine e metaboliti, esiste all'interno di una vasta popolazione cellulare e serve come un principio fondamentale in biologia per consentire l'adattamento delle cellule ed evoluzione ^1. Pertanto, è spesso imprecisi e inaffidabili utilizzare misurazioni di massa di popolazione comprendere la funzione delle singole cellule e le loro interazioni. Lo sviluppo di nuove tecnologie per l'analisi singola cellula è pertanto di grande interesse nella ricerca biologica e farmacologica, e può essere utilizzato, ad esempio, per meglio comprendere le vie di segnalazione e processi chiave in biologia delle cellule staminali e la terapia del cancro ^2-4. Negli ultimi anni, l'emergere di piattaforme microfluidici ha notevolmente facilitato l'analisi singola cellula, in cui il posizionamento, il trattamento, e l'osservazione della risposta da singole cellule sono state eseguite con strategie analitiche innovative ^5.

La cavitazione svolge un ruolo importante in una vasta gamma di applicazioni biomediche, compreso il trattamento di tumori di High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) ^6, la frammentazione non invasivo di calcoli renali con onda d'urto litotripsia (SWL) ^7, droga o gene consegna da sonoporazione ^8, e la distruzione recentemente riportato di cellule o tessuti da idrodinamica ^9,10 bolla di cavitazione. Nonostante ciò, i processi dinamici della bolla di cavitazione (s) interazioni con tessuti e le cellule biologiche non sono state ben comprese. Ciò è dovuto alla casualità in cavitazione iniziazione e bolle dinamiche prodotte dagli ultrasuoni, onde d'urto, e la pressione idraulica locale; Inoltre, vi è una mancanza di permettere tecniche per risolvere le risposte intrinsecamente complesse e veloci di cellule biologiche, in particolare a livello di singola cellula.

A causa di queste sfide, non è sorprendente che pochissimi studi hanno apen segnalato per indagare le interazioni bolla-cellula in condizioni sperimentali ben controllate. Ad esempio, poration membrana delle cellule individuali intrappolato in sospensione ¹¹ e la grande deformazione impulsiva di globuli rossi umani ¹² è stata dimostrata utilizzando laser generato singole bolle in canali microfluidica. Quest'ultima tecnica, tuttavia, può produrre solo molto piccola deformazione in cellule eucariotiche per la presenza del nucleo ^13. Inoltre, è difficile controllare bioeffetti valle quando trattando le cellule in sospensione. In altri studi, gli ultrasuoni l'eccitazione di un (o mezzo di contrasto ecografico) microbolle cellule-bound per la produzione di membrane poration e / o risposte intracellulari di calcio in singole cellule aderenti stato segnalato ^8. All'incorporazione membrana di singole cellule aderenti può essere prodotto utilizzando bolle tandem laser generato in un sottile strato liquido contenente Trypan blue soluzione che assorbe la luce ^14, oda una bolla di gas oscillante generato da impulsi laser microsecondo che irradiano attraverso un substrato otticamente assorbente in microchambers ^15. Rispetto, il substrato otticamente assorbente ha un vantaggio rispetto alla soluzione Trypan blu laser assorbente perché quest'ultimo è tossico per le cellule. Ancora più importante, le bolle laser generati sono più controllabili in termini di dimensioni e la posizione della bolla di bolle acusticamente eccitati. Tuttavia, in tutti questi studi precedenti, la forma delle cellule, l'orientamento e condizioni di aderenza non erano controllati, che possono influenzare sostanzialmente la risposta cellulare e effetti biologici prodotti dalle sollecitazioni meccaniche ^16.

Per ovviare a questi inconvenienti in studi precedenti, abbiamo recentemente sviluppato un sistema sperimentale per la generazione di bolle, patterning cella, interazioni bubble-bubble-cellulari, e in tempo reale biosaggi di risposta delle cellule in un chip microfluidico costruita utilizzando una combinazione unica di microfabbricazione tecniques. Tre caratteristiche principali che contraddistinguono il nostro sistema sperimentale da altri nel campo sono: 1) il patterning di punti d'oro micron dimensioni sul substrato di vetro per consentire l'assorbimento laser localizzato per la generazione della bolla ^17; 2) il patterning di isole micron di dimensioni di matrice extracellulare (ECM) per l'adesione cellulare sullo stesso substrato di controllare sia la posizione e geometria delle singole celle; e 3) la compressione della dimensione del dominio di interazione bubble-bubble-cellulare da 3D a uno spazio quasi-2D per facilitare la visualizzazione nel piano di interazioni bolla bolle, getto campi di flusso, deformazioni cella, e bioeffetti, tutti catturati in una sequenza di immagini snella (Figura 1d).

Figura 1: Il chip microfluidica e schemi di saggi differenti. a) Un chip microfluidica assemblato con canali riempito con inchiostro blu per la visualizzazione. b) Una regione all'interno del chip microfluidico con celle motivi geometrici e punti d'oro (la distanza tra i due punti d'oro in prossimità è 40 micron). Molte coppie di unità di lavoro possono essere disposti in un canale. c) Immagine del primo piano di una singola unità di lavoro costituito da una coppia di punti d'oro e una cellula HeLa aderito alla regione cellula-patterning. d) Schema del funzionamento del dispositivo. Una singola cellula aderisce e si diffonde sulla "H" isola a forma rivestito con fibronectina. Un paio di bolle di cavitazione (bolle tandem) con oscillazione anti-fase viene prodotta illuminando raggi laser pulsati sui punti d'oro (vedi figura 4a), che porta alla generazione di un getto veloce e localizzato muovendo verso la cellula bersaglio vicina. La cella può essere deformata, porata per l'assorbimento macromolecolare, e / o stimolato con una risposta di calcio, a seconda della distanza distanziatore (S _d) della cella alla bolla tandem.f = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig1large.jpg" target = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Questa piattaforma può essere ulteriormente combinato con saggi di fluorescenza e perline funzionalizzati attaccati alla superficie cellulare per bioeffetti cavitazione indotta. In particolare, questa piattaforma apre la strada a test affidabili e quantificabili a livello di singola cellula. Fino ad ora, abbiamo utilizzato il dispositivo per l'analisi di tandem bolla indotta deformazione della membrana cellulare, poration cellulare e captazione intracellulare, la vitalità, apoptosi, e la risposta del calcio intracellulare. Nella seguente protocollo, si descrive il processo di fabbricazione di chip e la procedura per analizzare i vari effetti biologici sopra menzionati. Inoltre, sono anche descritti operazioni del chip.

Protocol

1. Microfabbricazione

NOTA: Tutte le procedure di microfabbricazione vengono eseguite in una camera sterile. Una maschera di cromo è progettato prima della microfabbricazione, vedi Figura 2.

Figura 2: Schema del disegno di canale nel chip microfluidica e le dimensioni delle unità di lavoro. a) progettazione maschera del PDMS microcanali allineati (verde) e i modelli sul substrato di vetro (blu e rosso). b) l'immagine ingrandita del disegno maschera in una sezione rappresentativa degli array di unità di lavoro. c) Schema di una unità di lavoro che mostra un modello di cellule (blu) e una coppia di punti d'oro (rosso). Tutte le scale di lunghezza sono mostrati in basso a destra. Clicca qui per visualizzare un larVersione ger di questa figura.

1. Patterning dot oro
   NOTA: L'area di ogni punto oro è progettato per essere entro 25-30 micron ^2, in modo che sia sufficientemente grande da assorbire energia laser per la generazione di bolle, ma abbastanza piccolo per evitare singole cellule aderenti ad essa. Un diagramma schematico per il punto dell'oro fabbricazione è mostrato in figura 3a.
   1. Vetrino pulizia (in una cappa chimica)
      1. Lavare il vetrino con acetone seguito da alcol isopropilico (IPA), e poi asciugare con il flusso di N _2.
      2. Bagnare il vetrino in soluzione Piranha (H ₂ SO _4: H ₂ O ₂ = 4: 1) per 10 min.
      3. Estrarre la slitta, sciacquarlo con acqua deionizzata, e poi asciugare con il flusso di N _2.
      4. Cuocere il vetrino su una piastra riscaldante a 120 ° C per 10 min.
      5. Trattare il vetrino in un Asher al plasma a 100 W per 90 s.
   2. Spin-rivestimento (Cappuccio spin-coating)
      1. Accendere una piastra riscaldante e attendere che la temperatura è stabile a 95 ° C.
      2. Seguire la procedura di rivestimento:
         1.000 rpm per 5 s con a / s rampa di 500 giri al minuto;
         poi 3.000 rpm per 30 s con / s rampa 1.000 rpm.
      3. Fissare il vetrino pulito sul dispositivo a induzione rotazione mediante l'applicazione di un vuoto.
      4. Coprire la superficie di scorrimento con P-20 e inizia la ricetta rivestimento.
      5. Ripetere il processo di rivestimento per photoresist NFR-negativo.
      6. Cuocere la diapositiva a 95 ° C per 60 s e attendere che si raffreddi fino a temperatura ambiente.
   3. fotolitografia
      1. Montare la maschera cromata sul allineatore maschera e fare in modo che il lato modello sia rivolto verso lo scivolo.
      2. Impostare la ricetta fotolitografia al modo di esposizione disco con 9 s di esposizione UV e rapidamente allineare il substrato di vetro con la maschera.
      3. Dopo aver effettuato l'esposizione UV, cuocere la diapositiva a 956; C per 1 minuto, e poi lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente.
   4. Sviluppo
      1. Sviluppare il modello sul vetrino in soluzione di sviluppo per 60 s.
      2. Rimuovere il vetrino da parte dello sviluppatore, lavare con acqua deionizzata e asciugarlo con il flusso di N _2.
      3. Controllare la geometria modello sotto un microscopio, e misurare e registrare la dimensione del tratto.
   5. Deposizione di oro (e-beam evaporazione) e decollo
      1. Cuocere la diapositiva a 120 ° C per 5 minuti, e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente.
      2. Pulire il vetrino con il plasma nella macchina reattiva attacco con ioni (RIE) per 90 s a 500 Torr e 100 W.
      3. Deposito 5 nm di Ti e 15 nm di Au sul vetrino utilizzando un evaporatore a fascio ^17.
      4. Immergere il vetrino notte in un bicchiere di vetro contenente rimozione fotoresist solvente per rimuovere l'appoggio oro sulla parte superiore della NFR resistere.
      5. Recuperare la slitta, i flusht con acetone seguito da IPA, e asciugare con il flusso di N _2.
      6. Asciugare il vetrino su una piastra calda a 115 ° C prima di pulirlo nel Asher plasma di ossigeno a 100 W per 90 s.
2. Molecular-assemblaggio patterning dal lift-off (MAPL)
   Nota: L'area di ogni isola fibronectina rivestite è impostato per essere all'interno di 700-900 micron ² per facilitare un adeguato cellule HeLa diffondendo in una regione quadrata, riducendo al minimo le probabilità di più celle aggregano sull'isola. Un diagramma schematico per la preparazione di isole cell-patterning è mostrato in Figura 3b.
   1. spin coating
      1. Ripetere passaggio 1.1.2, ma utilizzare photoresist S1813-positivi e una temperatura di 115 ° C.
   2. fotolitografia allineato
      1. Montare la maschera cromata sul allineatore maschera e fare in modo che il lato con il modello sia rivolta verso lo scivolo con ilpunti d'oro.
      2. Impostare la ricetta fotolitografia per modalità di esposizione duro con 9 s di esposizione ai raggi UV.
      3. Allineare la maschera superiore con la slitta inferiore utilizzando segni di allineamento, situati intorno al bordo della maschera, come riferimento spaziale.
      4. Controllare la porzione centrale della maschera e verificare che le funzioni di ripetizione sono allineate.
      5. Completa l'esposizione ai raggi UV, senza un post-cottura.
   3. Sviluppo
      1. Ripetere il passaggio 1.1.3, ma con 45 s di sviluppo prima di asciugare su una piastra e la conservazione in N ₂ di stoccaggio.
3. trattamento chimico
   1. Preparare la soluzione passivante: 0,5 mg / mL PLL-g-PEG in 10 tampone HEPES mM.
   2. Recuperare il vetrino da N ₂ stoccaggio e pulirlo con RIE con l'impostazione del parametro: 500 Torr pressione, potenza 100-W, e 90-s durata.
   3. Pipettare una goccia di passivazione soluzione su una porzione di pellicola di paraffina.
   4. Sandwich la soluzione con il film e la slitta, assicurandosi che il lato con il modello caratteristiche sia rivolta verso il film; evitare la formazione di bolle.
   5. Attendere 45 minuti prima di rimuovere il vetrino dal film.
   6. Immergere il vetrino consecutivamente in rimozione fotoresist, rimozione fotoresist e acqua deionizzata (1: 1), e acqua deionizzata, e agitarsi in un bagno a ultrasuoni per 90 s per ogni ammollo.
   7. Essiccare il vetrino su una piastra per rimuovere l'umidità prima di sigillare in un essiccatore e riporlo in frigorifero.
4. assemblaggio di chip
   1. Ripetere i passaggi 1.1.1-1.1.4, ma con photoresist SU8-2025-negativo e l'impostazione dei parametri di cui ha chiamato il protocollo Microchem ^18, per preparare uno stampo in silicone con un fotomaschere.
   2. Realizzare un microchannel PDMS (40 mm x 25 mm x 5 mm L x P x A) e una lastra PDMS piccola (800 micron a livello di struttura di scanalatura) utilizzando la litografia soffice.
   3. Punch il microchannel per porte di accesso fluido e pulirlo con del nastro adesivo e poi con IPA.
   4. Schermare la zona modellata del substrato di vetro con la lastra PDMS, e applicare RIE (100 W, 500 mTorr, 60 s) per rimuovere PLL-g-PEG dalla zona periferica.
   5. Trattare il microcanali con una dose ridotta di RIE (25 W, 500 mTorr, 25 s) e quindi allinearla al substrato di vetro modellata (con la piccola lastra PDMS rimossa); portare il microcanali e il substrato di vetro modellato a contatto conformazionale sotto uno stereoscopio.

Figura 3: Schemi di microfabbricazione e chip di assemblaggio. a) Modello di punti d'oro sul substrato di vetro. b) Preparazione del substrato di vetro per patterning cellulare tramite MAPL. c) Montaggio del canale microfluidica con incollaggio al plasma. Vedere l'elenco dei materiali per le definizioni of le abbreviazioni. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

5. adesione cellulare
   NOTA: cellule HeLa sono normalmente mantenute in DMEM supplementato con 10% FBS e 1% di antibiotici soluzione / antimitotici in un incubatore di coltura cellulare. Un diagramma schematico per il fissaggio assemblaggio di chip e la cella è mostrato in figura 3c.
   1. Prime il chip con PBS per 30 minuti a 1 ml / min, e quindi infusione soluzione fibronectina (50 mg / ml in PBS, 1 ml / min) per 45 min.
   2. Durante l'attesa, trypsinize coltura cellulare con 0,25% tripsina-EDTA, lavarli in terreno di coltura, le cellule individuali centrifuga, e ricostituire la sospensione cellulare in pre-riscaldato (37 ° C) al mezzo di coltura 5x10 ⁶ cellule / ml.
   3. Sostituire la soluzione fibronectina con PBS e lavare il chip a 10 microlitri / min per 5 min.
   4. Iniettarela sospensione cellulare preparata nel chip, fermare il flusso, morsetto presa, e mantenere il chip in un incubatore di coltura cellulare per 30 min.
   5. Rilasciare la presa e lavare il chip con mezzo di coltura cellulare a 10 microlitri / min per 5 min. Ridurre la portata perfusione del mezzo di coltura a 0,75 ml / min e mantenere la coltura cellulare per 2 ore in incubatore.

2. Generazione Bubble e visualizzazione del flusso

NOTA: Uno schema del setup sperimentale è mostrato in figura 4a per la generazione di bolle tandem e l'interazione flusso risultante con una singola cellula coltivata vicino in un canale microfluidico.

1. Generazione di tandem bolle con due laser e di controllo di temporizzazione
   1. Posizionare il chip microfluidica sul palcoscenico di un microscopio invertito e allineare il foci di due Nd pulsati: YAG (λ = 532 nm, 5 ns durata impulso) su un paio di punti d'oro fantasia separati By 40 micron.
   2. Utilizzare un generatore di ritardo digitale per far scattare i due laser con un ritardo di circa 2,5 ms per la produzione di due bolle avviate presso i punti d'oro.
   3. Regolare l'energia di uscita del laser (~ 10 μJ) per produrre un diametro massimo delle bolle a meno di 50 ± 2 micron.
   4. Sincronizzare una macchina fotografica ad alta velocità (esposizione di 200 ns e 2 milioni di fotogrammi al secondo (fps)) per i laser e catturare le dinamiche di espansione della bolla, il collasso, l'interazione bolla-bolla, e la formazione del getto.
2. La quantificazione della velocità del getto
   1. Registrare la posizione della punta jet (J ₁₎ all'estremità prossimale della prima bolla (B ₁₎ e l'estremità distale di B _1, a partire dalla generazione della bolla secondo (B ₂₎ e termina con l'atterraggio di J ₁ verso l'estremità distale del B _1; vedi lo schema in figura 5a.
   2. Linearmente adattare il periodo di tempo della posizione per Both prossimale (jet punta) e le estremità distali. Calcolare la pendenza della posizione della punta rispetto alla curva tempo per l'estremità prossimale per determinare la velocità del getto. L'intersezione delle due linee indica il tempo jet atterraggio. Maggiori dettagli possono essere trovati in riferimento 19.
3. Visualizzazione del campo di moto bolla indotta tandem
   1. Preparare 1 micron di polistirolo (PS) la sospensione delle sferette in acqua deionizzata (2,6% w / v) e iniettare le perline nel chip microfluidica.
   2. Genera bolle tandem come descritto al punto 2.1.1-2.1.3.
   3. Registrare le dinamiche bolle in tandem con una videocamera ad alta velocità ad una velocità di 5 fps M con un tempo di esposizione di 100 ns.
   4. Carica la sequenza di immagini acquisite in un software PIV commerciale.
   5. Dividere ogni immagine in piccole finestre di interrogatorio di 16 x 16 pixel (px) con una sovrapposizione del 75%.
   6. Applicare iterazione multi-pass e filtri regionali di ridurre gli errori in campo di velocità di calcolo, euscita i risultati in una mappa vettore velocità.

Figura 4: Schema del setup sperimentale e registrazione delle immagini. a) messa a punto sperimentale per la generazione di bolle in tandem. b) Sequenza temporale utilizzata per diversi tipi di acquisizioni di imaging. FL: microscopia a fluorescenza, BF: campo chiaro, IFT: tempo di interframe. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

3. Single-cella di analisi e di effetti biologici

NOTA: La bolla tandem è prodotto vicino alle cellule bersaglio, e gli effetti biologici risultanti sono studiati in maniera distanza dipendente dalla situazione di stallo. La sequenza temporale per i diversi tipi di acquisizioni d'immagine è mostrata in Figura 4b.

1. Poration membrana e l'assorbimento macromolecolare
   NOTA: L'assorbimento di macromolecole extracellulari nella cellula bersaglio è caratterizzata dalla progressiva diffusione di membrana impermeant ioduro di propidio (PI) attraverso il sito tion sulla membrana cellulare.
   1. Seguendo passo 1.5, sostituire il terreno di coltura regolare (cioè, DMEM) con la soluzione PI (100 mg / ml in DMEM) con almeno una portata di perfusione di 0,5 microlitri / min per tutto l'esperimento.
   2. Programmare il software di controllo del microscopio per selezionare automaticamente il cubo fluorescente PI sulla torretta girevole e sincronizzare la temporizzazione della camera CCD con l'eccitazione di fluorescenza PI per catturare immagini di fluorescenza con un tempo di esposizione di 200 ms.
   3. Dopo i due fuochi laser sono allineati ad una coppia di punti d'oro accanto a una cellula bersaglio, registrare sia in campo chiaro (BF) e le immagini di fluorescenza (FL) prima del trattamento bolla tandem.
   4. Utilizzare un software di controllo del microscopio a subitoavviare un time-lapse registrazione delle immagini di fluorescenza della cellula bersaglio subito dopo la fase 2.1 per catturare la storia del PI assorbimento.
2. deformazione Membrane
   1. Preparare 1-micron perline (1% w / v, attivati ​​con carbodiimide solubile in acqua) e funzionalizzare con Peptide-2000 (100 mg / ml in PBS).
   2. Seguendo passo 1.5, incubare le cellule attaccate con le perline funzionalizzati ad una densità di 1x10 ⁹ perline / ml a 37 ° C per 30 min.
   3. Ripetere il passaggio da 2.1 a produrre le bolle tandem accanto alla cella di destinazione e registrare la deformazione cellulare con una fotocamera ultra-alta velocità in esecuzione a una velocità di 5 milioni di fps.
   4. Identificare una triade di 3 perline che rimangono sul piano di imaging tutto l'esperimento e compilare le loro posizioni come (x _1, y ₁₎ (x _2, y ₂₎ e ₍₃ x, y ₃₎ nell'esperimento coordinate.
   5. Calcolare l'area della triade prima e afIl TER trattamento bolla tandem con la formula:
      
   6. Calcolare il ceppo zona come:
      
   7. Sulla base delle coordinate dei tre vertici prima e dopo il trattamento bolla tandem, calcolare il principale sforzo e deformazione locale zona seguendo protocolli stabiliti ^20,21.
3. Viabilità e apoptosi
   NOTA: FITC annessina V etichette cellule, comprese quelle apoptotico, attraverso l'esternalizzazione della fosfatidilserina (fluorescenza verde). PI etichette nuclei delle cellule necrotiche (fluorescenza rossa). immagini campo luminoso è usato per documentare la morfologia cellulare e per aiutare con l'identificazione di vitalità cellulare e apoptosi.
   1. Registrare la posizione di ciascuna cella trattata nel canale microfluidica (facilitata dalle etichette di indirizzo del canale, vedere figura 2b
   2. Incubare le cellule trattate nel mezzo di coltura cellulare per altre 2 h prima di perfusione del chip con soluzione FITC annessina V per 15 min. cellule positive mostrano fluorescenza verde.
   3. Ripetere il punto 3.3.2 24 ore dopo il trattamento bolla tandem per studiare le bioeffetti a lungo termine delle cellule bersaglio.
4. risposta di calcio
   1. Mescolare 3 ml di Fura-2 Am stock soluzione (1 mg / ml in DMSO) con 3 ml di 10% w / v Pluronic F-127 in 500 ml di mezzo di siero ridotta per preparare la soluzione di etichettatura finale (6 mM).
   2. Seguendo passo 1.5, sostituire il mezzo di coltura cellulare con la soluzione di etichettatura e incubare a temperatura ambiente al buio per 40 minuti (1 ml / min di perfusione).
   3. Riempire il canale con il mezzo di siero ridotto (0,75 ml / min di perfusione) prima di iniziare l'esperimento cella.
   4. Inizia l'imaging raziometrico (lunghezza d'onda: 340/380 nm, l'esposizione di 50 ms)della cellula bersaglio utilizzando il sistema PTI commerciale.
   5. Dopo 10 s dell'imaging raziometrica della cella a livello di riposo, produrre le bolle tandem come al punto 2.1; primo record con un tempo interframe (IFT) di 0,1 s per 1 minuto, quindi aumentare l'IFT di 1 s per un altro minuto, e l'ulteriore incremento di 5 s dopo 2 min.
   6. Utilizzare il software PTI per calcolare il rapporto R = F340 / F380 nella regione di interesse (ROI), che è proporzionale alla concentrazione di calcio intracellulare.

Results

La piattaforma microfluidica descritto in questo lavoro può essere usato per studiare le interazioni bolla-bolla e per analizzare una varietà di effetti biologici cavitazione indotta a livello di singola cellula. Qui, presentiamo alcuni esempi per dimostrare una varietà di studi sperimentali e saggi biologici che possono essere eseguite nel nostro sistema sperimentale. Per prima illustrare le interazioni transienti di bolle tandem con la formazione del getto, la visualizzazione del campo...

Discussion

Analisi cella singola, in combinazione con il live-cell imaging, ha notevolmente migliorato la nostra comprensione dei processi dinamici e spesso variabile in singole cellule, come lo sviluppo del fenotipo e la risposta immunitaria ^23. In contrasto con la coltura cellulare convenzionale piatti o flaconi, sistemi microfluidici permettono un controllo preciso del microambiente, fino al livello di singola cellula, in tempo reale. Di conseguenza, i progressi nella tecnologia microfluidica e tecniche sono in gran ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagente/Materiali
75 mm x 38 mm Vetrini per microscopio semplici	Corning	2947-75X38
Acetone	Sigma Aldrich, Co.	320110	Reagente ACS, ≥ 99,5%
di alcol isopropilico	Sigma Aldrich, Co.	W292907	≥ 99,7%, FCC, FG
Acido solforico	Sigma Aldrich, Co.	320501	Reagente ACS, 95,0-98,0%
Perossido di idrogeno	Sigma Aldrich, Co.	216763	30% in peso in H2O
Primer P-20	Microchem	MCC Primer 80/20
NFR Photoresist	JSR	NFR016D2
	Photomask Photoplotstore	N/A	4x4 Maschera a scrittura diretta
MF-319 Sviluppatore	Shipley (Rohm and Haas)	Microposit MF-319
1165 Photoresist Remover	Dow Chemical, Co.	DEM-10018073	a base di 1-metil-2-pirrolidinone
	Shipley (Rohm and Haas)	S1813
PLL-g-PEG	SuSoS	PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)
HEPES	ThermoFisher Scientific	15630080
Film di paraffina	HACH	251764
SU-2025 fotoresist	Microchem	SU-2025
PDMS	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0,5 kg
Microbore Tubo	Saint-Gobain PPL Corp.	S-54-HL
Perni in metallo	New England Small Tube	NE-1300-01	Tubo tagliato (dritto), 0,025 " OD x 0,017" ID x 0,50" Celle HeLa lunghe
	Duke Cell Culture Facility	(307-CCL-2) HeLa, p.148
DPBS (1x) tampone	ThermoFisher Scientific	14190144
Terreno di coltura DMEM	ThermoFisher Scientific	11995065
Fibronectina Proteina bovina, plasma	ThermoFisher Scientific	33010018
0,25% Tripsina-EDTA (1x)	ThermoFisher Scientific	25200056
Ioduro di propidio	ThermoFisher Scientific	P21493
Microsfere carbossilate 1.00  μ m	Polysciences, Inc	08226-15
Microsfere carbossilate 2.00  μ m	Polysciences, Inc	18327-10
EDC (1-etil-3-(3-dimetilamminopropil)carbodiimmide cloridrato)	ThermoFisher Scientific	22980
Sulfo-NHS	Sulfo-NHS (N-idrossisulfosuccinimide)	24510
Peptite-2000	Advanced BioMatrix	5020-5MG
FITC Annexin V	ThermoFisher Scientific	A13199
Fura-2, AM	ThermoFisher Scientific	F1221
DMSO	Sigma Aldrich, Co.	D2650
F-127	invitrogen	P6866	0.2 µ m filtrato (soluzione al 10% in acqua)
Terreni sierici ridotti	ThermoFisher Scientific	11058021
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Comments
>Equipment
Plasma asher	Emitech	K-1050X	O2 / Ar incenerimento al plasma di fotoresist e altri materiali organici
Allineatore maschera	SUSS MicroTec	Karl Suss MA6 / BA6
Evaporatore a fascio di energia CHA	Industries CHA Industries	Soluzione E-Beam
RIE	Trion Technology	Trion Technology Phantom II	(ossido/nitruro/polimero) etching
Stereoscopio	AmScope	American Scope SM-4TZ-FRL	Stereomicroscopio
Pompa a siringa	Chemyx Inc	NanoJet
Incubatore per colture cellulari	NuAire	AutoFlow NU-8500 Camicia d'acqua CO2 Incubatore
Armadi di sicurezza biologica	NuAire	NU-425-400
Bagno d'acqua	VWR	1122s
Centrifuga	IEC	Centra CL2
Microscopio	Zeiss	Axio Observer Z1
Nd:YAG laser  (laser 1)	Laser New Wave Research	Tempest
Nd:YAG (laser 2)	New Wave Research	Orion
Generatore di ritardo	Berkeley Nucleonics	BNC 565-8c
Lampada flash	Dyna-Lite	ML1000 tubo flash
a fibra fotocamera ad alta velocità	DRS Hadland	Telecamera ad alta velocità Imacon 200
	Shimadzu	HPV-X
	Vision Research	Phantom V7.3
Software PIV	LaVision	DaVis 7.2
Telecamera	Zeiss	AxioCam MRc 5
Software	Zeiss	AxioVision
PTI System	Horiba	S/N: 1705 RAM-X
EasyRatio software	Horiba	Easy Ratio Pro 2	versione 2.3.125.86
63&volte; obiettivo	Zeiss	LD Plan Neofluar