Videomicroscopia microscopia del sistema vascolare del tumore-associati utilizzando avanzate dorsale dello Skinfold finestra Chambers su topi transgenici fluorescenti

Sommario

Questo protocollo descrive l'imaging videomicroscopia di topi transgenici che esprimono marcatori fluorescenti cellula-specifico. Videomicroscopia imaging fornisce un metodo non invasivo per osservazioni ad alta risoluzione in animali vivi utilizzando windows impiantabili attraverso il quale è possibile la visualizzazione microscopica dei processi. Questo metodo è particolarmente utile per studiare i processi longitudinali.

Abstract

Tumore e lo sviluppo dei vasi del tumore, come pure la risposta del tumore a terapeutica, è processi biologici altamente dinamici. L'istologia fornisce informazioni statiche e spesso non è sufficiente per una corretta interpretazione. Valutazione videomicroscopia, in cui un processo è seguito nel tempo, fornisce informazioni supplementari e spesso inaspettate. Con la creazione di animali transgenici che esprimono marcatori di cellula-specifico e rivelatori di tensione delle cellule, miglioramenti all'apparecchiatura di imaging e lo sviluppo di parecchi alloggiamenti imaging microscopia intravital è diventato uno strumento importante per capire meglio processi biologici. Questo articolo descrive un progetto sperimentale per lo studio di sviluppo di nave del tumore e degli effetti terapeutici in modo spaziale e temporale. Utilizzando questa configurazione, la fase di sviluppo del vaso, formazione di cella e lume di punta, flusso sanguigno, stravaso, stabilito letto vascolare e distruzione vascolare può essere visualizzata e seguita. Inoltre, gli effetti terapeutici, intratumoral destino e la localizzazione dei composti chemioterapici può inoltre essere seguiti.

Introduzione

Mentre gli studi in vitro attiva imaging ad alta risoluzione cinetica dei processi, sperimentazione in vitro non consente la valutazione nel contesto appropriato. Per esempio, l'interazione delle cellule del tumore con scomparti stromal o consegna della droga e la distribuzione all'interno di un tumore non può essere studiato in una piastra di coltura. Modelli animali vengono quindi utilizzati per imitare la fisiologia umana e patologia. Tuttavia, l'imaging longitudinale dei processi, soprattutto a una risoluzione subcellulare, è impegnativo. Metodi di imaging molecolare, quali la formazione immagine a risonanza magnetica (MRI), emissione di fotone singolo computato tomografia (SPECT) e tomografia a emissione di positroni (PET), hanno profondità di buona penetrazione ma risoluzione di mancanza o non riuscire a illustrare le strutture anatomiche. Imaging ottico fornisce ad alta risoluzione e consente l'imaging delle strutture, ma è accompagnata da una scarsa penetrazione minima¹. L'applicazione di microscopia intravital in combinazione con finestra sezione tecnologie, come una dorsale skinfold o finestra addominale, consente ad alta risoluzione imaging in vivo^2,3,4. Questa tecnologia ha vantaggi distinti, in quanto consente per l'imaging longitudinale sopra ore e persino giorni, per l'imaging dei processi nel contesto appropriato (ad es., interazioni cellula-cellula nel tessuto imaged) e per risoluzioni ai limiti ottici della microscopi confocale e multifotonica avanzati.

L'introduzione di animali transgenici con etichette fluorescenti specifici delle cellule o proteina apre una miriade di possibilità per sperimentazioni in vivo ed ex vivo . Per istanza, interazioni cellula-cellula, la produzione di proteine e la risposta alla terapia o di manipolazione può essere studiati in vivo usando questi modelli^5,6,7,8. D'importanza, posizionare luogo e l'ora può essere determinati con le apparecchiature di imaging corretta e metodologia. Qui, la microscopia intravital degli animali esprimenti un marker endoteliale in combinazione con agenti iniettabili in un tumore impiantato in una versione modificata dorsale dello skinfold camera di finestra è presentato.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati fatti in conformità con la legge olandese e protocolli sono stati approvati dal comitato di sperimentazione animale dell'Erasmus MC, Rotterdam, Paesi Bassi.

1. destinatario Mouse

1. Quando sono nati i topi transgenici, gli animali per il genotipo appropriato utilizzando le procedure standard⁹a schermo.
   Nota: In questo manoscritto, vengono presentati i dati ottenuti da un eNOStag-GFP linea⁹ sviluppato internamente e una linea di¹⁰ ROSA-mTmG (stock 007676) acquistata.
2. Utilizzare topi che sono 12 settimane di età e che sono sopra 20 g.

2. donatore Mouse

Nota: Un frammento del tumore per l'impianto nella finestra dorsale è ottenuto da un animale donatore non transgenica. A seconda del tipo di tumore, normale (con i tumori syngeneic) o topi immunodeficienti (xenotrapianti) sono usati.

1. Crescere le cellule del tumore in un mezzo con i supplementi appropriati in matracci di cultura a 37 ° C e 5% CO₂.
2. Rimuovere il supporto dai palloni cella, lavare una volta con PBS 1X e staccare le celle utilizzando 0,25% tripsina.
3. Inattivare la tripsina aggiungendo mezzo di coltura cellulare. Raccogliere le cellule, si sono fermati a 1.200 x g per 5 min e risospendere il pellet in 5 mL di PBS.
4. Diluire 20 µ l della sospensione delle cellule con 20 µ l di trypan blu, che colora le cellule morte. Contare il numero di cellule vive e morte utilizzando un emocitometro; il numero di cellule morte non deve superare il 10%.
5. Girare le cellule nuovamente a 1.200 x g per 5 min e risospendere il pellet cellulare in PBS ghiacciata, ottenendo 1 milione cellule per 100 µ l. trasporto le cellule sul ghiaccio per la sala operatoria.
6. Anestetizzare l'animale utilizzando isoflurano/O₂. Accendere l'ossigeno e regolare il flusso a 0,5 mL/min regolare il vaporizzatore di isoflurane al 3%. Dopo pochi minuti, posizionare il mouse nella camera di anestesia.
   Nota: Prefill della camera per assicurarsi che sia pronto per l'uso per ridurre al minimo lo stress.
7. Quando il mouse viene sedato, portare l'animale al tavolo operatorio riscaldamento, mantenuto a 37 ° C e posto il muso nel cono di naso dell'anestesia.
   1. Nota: L'animale viene sedato correttamente quando nessuna reazione a un pizzico di grassatore è notata.
8. La barba del mouse per visualizzare meglio il sito di iniezione. Inoculare usando una siringa da insulina 0,5 mL; iniettare 100 µ l di cellule nel versante del mouse e consentono di sviluppare un tumore.
9. Eutanasia animale di dislocazione cervicale in anestesia come approvato dal vostro uso Comitato e istituzionali Animal Care.  Utilizzando micro-forbici e pinze, tagliati la pelle nella posizione del tumore e sezionare il tumore. Mettere il tumore in una capsula di Petri con PBS. Utilizzando micro-forbici e pinze, tagliare il tumore in frammenti di circa 1 mm³ (fig. 1A-a).
   Nota: Il tumore del mouse donatore dovrebbe essere grande abbastanza per dare materiale sufficiente, ma grandi, necrotici tumori dovrebbero essere evitati. Per la maggior parte dei tumori, è sufficiente un diametro medio di 10 mm.

3. l'impianto della camera finestra

1. Eseguire tutte le procedure in condizioni asettiche. Autoclave la camera materiali (Figura 1B) e gli strumenti chirurgici (Figura 1A).
   Nota: L'alloggiamento di finestra usata qui, con un peso totale di 1,1 g, è fatto di polietere etere chetone (PEEK), un materiale leggero, sintetico che è MRI compatibile. PEEK è 3,4 più leggero del titanio, che è comunemente usato nella letteratura per queste finestre. Esso è resistente agli agenti chimici, è inerte, non provoca reazioni immunitarie e robusto. Questa finestra è anche più piccola nel design rispetto a windows precedentemente pubblicati. Topi con questo spettacolo finestra piena capacità di movimento, possono salire e aumento di peso in modo paragonabile ai topi senza una camera finestra. Perché l'animale può mordere sulla finestra, windows sintetico può durare un po' più breve rispetto a windows di titanio; Tuttavia, sono facili da fare e sono economici. Queste finestre specifiche sono fatti in casa e possono essere acquistate su richiesta.
2. Sedare il destinatario mouse utilizzando anestetici per inalazione (cioè, isoflurano/O₂) in una camera di anestesia. Portare il mouse al tavolo operatorio riscaldato mantenuto a 37 ° C e posto il muso nel cono di naso di anestesia (Vedi punto 2.6). Applicare l'unguento per evitare secchezza degli occhi.
3. Rimuovere i peli dall'intero indietro di rasatura e l'applicazione di gel per capelli rimozione. Fare attenzione che tutto il gel viene rimosso lavando l'animale con cura con acqua di rubinetto calda-la mano. Asciugare l'animale e pulire la pelle con etanolo al 70%.
   Nota: La procedura di rasatura può anche essere fatto il giorno prima dell'impianto finestra. La crema devono essere rimossi accuratamente con acqua calda-la mano come questo può causare irritazione cutanea.
4. Segna la linea di centro sul dorso del mouse con un pennarello per garantire il posizionamento simmetrico della camera. Riposizionare il mouse, tirare la pelle in una falda utilizzando la linea di centro come una posizione di chiusura e la parte centrale della falda. Posizionare la finestra in modo tale che la parte superiore del telaio è di almeno 2 mm sotto la linea centrale e il cerchio l'area di visualizzazione della finestra sulla pelle con un pennarello.
5. Utilizzando una dimensione di titolare/lama di bisturi di 15 e micro forbici, togliere la pelle lungo la linea circolare disegnata. Fare attenzione a non danneggiare la fascia sottostante.
   Nota: Questa crea l'area di visualizzazione della finestra della camera in cui il tumore viene trapiantato.
6. Tirare verso l'alto dello skinfold e utilizzare un puncher dell'orecchio fino a 1 mm di diametro attraverso la pelle, uno su entrambi i lati dell'area della vista (Figura 1A-b).
   Nota: Questi sono i fori per due bulloni fissare i telai delle finestre contemporaneamente.
7. Posizionare il telaio su misura camera anteriore con bulloni (figure 1B-a, 1B-c) e posizionare il telaio posteriore (Figura 1B-b) sui bulloni. Posizionare i dadi (Figura 1B-d) presso la struttura dello schienale sui bulloni.
   Nota: Questi bulloni sono utilizzati per fissare gli alloggiamenti insieme contro dello skinfold e vengono in seguito utilizzati per immobilizzare la camera durante la valutazione al microscopio.
8. Tirare la pelle 2-3 mm sopra la parte superiore dei telai e assicurarsi che l'area di visualizzazione della finestra transplantable corrisponda l'area della camera. Posto 23 G aghi attraverso i due fori di piccolo sutura (Figura 1B, freccia nera) nella parte superiore del telaio. Serrare i dadi sui bulloni con un micro cacciavite (Figura 1A-c) e un bloccaggio porta-aghi per immobilizzare i dadi.
   Nota: Prendere precauzioni per garantire che la pelle non gira intorno ai bulloni e non stringere troppo.
9. Sostituire gli aghi con suture, partendo dall'alto, per fissare i telai contro la pelle. Fare questo per le 5 coppie di fori di sutura (Figura 1B, freccia bianca) nel telaio.
10. Ruotare il mouse per rivelare la parte posteriore della camera finestra. Posizionare un pezzo di spesso di vetro di riempimento con un diametro di 10 mm e uno spessore di 0,55 mm (Figura 1B-e) e poi un bicchiere di copertura standard di 12 mm (Figura 1B-f). Fissare questi con un anello di ritegno (Figura 1B-g) nell'area di retro-camera.
    Nota: Il vetro di riempimento impedisce lo spazio per aprire tra la fascia e la finestra sul lato anteriore, che viene utilizzato per l'imaging.
11. Idratare l'area di visualizzazione della finestra in cui verrà inserito il tumore riempiendo una siringa da 1 mL con sterile 0,9% NaCl. Consentire poche gocce a cadere su questa area di visualizzazione. Rimuovere l'eccesso salino con una punta di cotone sterile.
12. Nella fascia, creare una tasca sufficientemente grande da contenere il 1 mm³ tumore frammento (Figura 1A-a) usando un ago 25 G con la sua punta è piegato ad un angolo di 90 ° (Figura 1A-d). Utilizzando un porta-aghi o una pinza di Kelly, inserire il frammento di tumore nel mezzo dell'area di visualizzazione finestra trapiantabili in questa tasca.
13. Chiudere l'area di visualizzazione della finestra con un vetro di copertura standard di 12 mm e un anello di ritegno.
    Nota: Può formare una bolla d'aria, ma scomparirà entro ore.

4. pre- e post-cura dell'animale

1. Somministrare farmaci per alleviare il dolore (cioè, buprenorfina 0,05 mg/kg) per via sottocutanea, come approvato dal vostro uso Comitato e istituzionali Animal Care. Consentire il mouse per recuperare dall'anestesia sotto una lampada di riscaldamento.
2. Inserire finestra-cuscinetto topi individualmente in una gabbia e in una sala climatizzata situati a 32 ° C, 50% di umidità. Assicurarsi che le bottiglie di acqua sono a temperatura ambiente prima di metterli sulla gabbia per evitare perdite. Utilizzare gabbie e arricchimento che consentono la libera circolazione e l'accesso a cibo e acqua.
   Nota: Come quest'Aula finestra è molto ben tollerato, topi mostrano un comportamento normale. Alloggi individuali previene danni alla camera finestra causata da altri topi, e l'alta temperatura/umidità impedisce il raffreddamento down e disidratazione della dello skinfold.
3. Controllare il mouse regolarmente per masticato-off suture, bulloni e dadi allentati o rotto vetro di copertura. Immediatamente riparare e sostituire quando questo accade. Una copertura fatta di materiale leggero può essere usata per proteggere la finestra.

5. videomicroscopia Imaging

Nota: In questa procedura vengono utilizzati un microscopio multifotonica e il software di controllo appropriato. Qui, vengono utilizzati pacchetti software che sono stati forniti con i microscopi. In linea di principio, qualsiasi pacchetto software che viene fornito con un microscopio ed è inteso per il controllo del microscopio e per la cattura delle immagini sarà suite questo scopo.

1. Accendere il sistema: PC/microscopio, alimentazione alla centralina confocale, potenza del laser e laser emissione. Ad esempio, con questo software, avviare il software e inizializzare il tavolino portaoggetti (fig. 1E-a e 1E-c) facendo clic su "inizializzare tabella." Accendere il sistema e impostarlo in modalità permettendo il PC controllare il microscopio, tavola xy, z-posizionamento e acquisizione di immagini.
2. Accendere la luce fluorescente (Figura 1E-b).
   Nota: Questo viene utilizzato per valutare le immagini di fluorescenza attraverso l'oculare con campo chiaro.
3. Accendere la piattaforma su misura, temperatura controllata (Figura 1C-c; descritto nella discussione più dettagliatamente) impostato a 37 ° C.
4. Accendere l'apparecchio di anestesia con isoflurano/O₂ (Figura 1E-d). Montare il tubo di anestesia sul tavolino del microscopio (Figura 1C-e). Installare un morsetto sul palco-xy per fissare il pezzo di muso di anestesia.
5. Pre-valutare l'animale per stabilire la fase di sviluppo la nave del tumore; Questo dipende dalla velocità di crescita del tumore, ma può variare tra i topi individuali.
   1. Sedare il mouse utilizzando anestetici per inalazione (isoflurano/O₂) in una camera di anestesia (Vedi punto 2.6).
   2. Posizionare l'animale sulla piattaforma temperatura controllata montata sul tavolino del microscopio; Questo impedisce il raffreddamento dell'animale quando esso è anestetizzato. Assicurarsi che il muso del mouse si trova nel cono dell'anestesia e applicare unguento oculare se la valutazione richiede più di 5 min.
      Nota: Per una valutazione più di 1h, ridurre la portata di isoflurane al 2%.
   3. Utilizzare i bulloni alloggiamento per difficoltà (Figura 1C-b, freccia completa) della camera su un supporto su misura camera (fig. 1 C-a). Avvitare questo supporto (Figura 1 C-d, freccia tratteggiata) alla piattaforma riscaldata (Figura 1 C-c).
      Nota: Questa combinazione previene gli artefatti di movimento nell'area di visualizzazione della finestra consentendo comunque all'animale di respirare liberamente.
   4. Assicurarsi di pulire il vetro dell'area di visualizzazione della finestra con una punta di cotone immersa in acqua per evitare un'immagine sfocata e le interferenze provenienti da detriti sulla parte esterna del vetro. Posizionare la piattaforma e il mouse sul tavolino del microscopio (Figura 1).
      Nota: fare attenzione che la coda non rimanere bloccata tra la piattaforma e il tavolino del microscopio.
   5. Controllare visivamente la fase di sviluppo di nave del tumore usando una lente obiettiva X 10, campo chiaro e luce fluorescente.
      Nota: Fluorescente vasi devono essere a fuoco e il flusso di sangue deve essere visibile utilizzando il campo luminoso. Quando si vede chiaramente il sistema vascolare, valutare la fase di sviluppo la nave del tumore. Per esempio, di determinare se c'è l'angiogenesi precoce con la crescita di cellule di punta o di un sistema vascolare già consolidate per il drug delivery. Lo stesso animale può essere valutato nuovamente, e come tumore sviluppo è un processo continuo. Diverse fasi possono essere osservate in un singolo tumore allo stesso tempo.
      1. Quando non è possibile mettere a fuoco sul sistema vascolare, rimuovere l'animale da palco, lasciate il mouse recupera e posto l'animale torna in uno spazio climatizzato. Si verifica più tardi. Quando il mouse è pronto per la valutazione, continuare con il processo descritto di seguito.
6. Accendere il laser confocale e il pannello di controllo facendo clic su "Laser" e "Pannello di Ctrl" nella scheda configurazione
   Nota: È consigliabile impostare la potenza del laser basso, particolarmente per il laser di Argon, per evitare la decolorazione, il riscaldamento del tessuto e photodamage. Pannello di controllo può essere impostato le preferenze personali. Per l'imaging videomicroscopia utilizzando fluorofori più si raccomanda di applicare le seguenti impostazioni: "smart guadagno, 100 V per turno," "smart offset, 10% ogni turno," "zoom, media," "posizione X, media," "posizione Y, medium," e "Posizione Z, 100 µm per turno." Prima di formazione immagine, regolare l'offset per minimizzare il rumore e ottimizzare il rapporto segnale-rumore. La funzione zoom confocale consente un ingrandimento superiore senza cambiare le lenti dell'obiettivo. Controllo X, Y e Z è necessario individuare i campi di interesse. Per la microscopia intravital Z-posizionamento dovrebbe essere circa 100 µm per turno come tessuto di graduazione è valutato.
7. Clicca su "Acquisizione" nella scheda di acquisire e modificare l'impostazione per: "Modalità di acquisizione XYZ o XYZT," "Format (512 x 512 o 1024 x 1024)" e "Velocità (400 Hz o 200 Hz)." Fare clic su "Pinhole" e impostarlo su 1 unità arioso. Fare clic su "Bidirezionale X".
   Nota: Per ottimizzare le immagini, tra potenza laser, guadagno e pinhole dovrebbe trovare un equilibrio, che è accennato nella discussione.
8. Quando si valutano più fluorofori, selezionare "scansione sequenziale" e "tra i fotogrammi" per prevenire trapasso, che è menzionato nella discussione.  Scegliere "Linea media 4" per ottenere una buona riduzione del rumore.
   Nota: A seconda della fluorescenza intrinseca presente nell'animale transgenico, altri marcatori fluorescenti, come destrani, Hoechst, FITC-BSA, fluorescente chemioterapici e/o nanoparticelle diluite alla concentrazione desiderata nello 0,9% NaCl può essere somministrati e valutati nel tumore. Questi vengono iniettati attraverso la vena del pene o coda.
9. Clicca su "Esperimento" nella scheda Acquisisci e selezionare "Nuovo" per realizzare nuovi dati di base.
10. Valutare l'animale utilizzando, a seconda della domanda di ricerca, 10x, 20x o obiettivo 40x lenti. Attraverso l'oculare, trovare una posizione per valutare.
    Nota: Si consiglia di utilizzare lenti asciutti con un NA più in alto possibile, asciutte lenti hanno un lavoro relativamente lunga distanza e fare non bisogno liquido di immersione. Nella discussione, l'utilizzo di lenti obiettivo a immersione in acqua è menzionato.
11. Utilizzare una scansione veloce dal vivo per trovare il corretto guadagno e l'offset per evitare la sovraesposizione e per ottimizzare il rapporto segnale-rumore. Inoltre, mantenere stesse impostazioni imaging durante e tra esperimenti se confronto quantitativo è necessaria.
    Nota: Ulteriori considerazioni per l'imaging ottimale sono indicati nella discussione. Durante la scansione diretta utilizzando il pannello di controllo, si può decidere la posizione XYZ e lo zoom.
12. Per rendere uno Z-stack, selezionare "Z-stack" nella scheda di acquisizione assicurarsi una Z-scansione veloce utilizzando la Z-posizione nel pannello di controllo e impostare l'inizio e la fine della scansione facendo clic su "Begin µm µm" e "fine". Impostare la dimensione di Z-passo correlata alla dimensione del foro stenopeico.
13. Catturare le immagini facendo clic su "Avvia".
    Nota: Come microscopia intravital è tutto si osservano cinetica e processi dinamici di conseguenza, un compromesso tra il tempo necessario per acquisire un'immagine e la velocità dei processi biologici dovrà essere effettuata. In generale, maggiore è la risoluzione, i canali più fluorescenti sono analizzati e più grande la scansione del campo, il numero di pixel per immagine. Z-stack più spesso si traducono in un tempo più imaging. Un tempo più imaging aumenta la possibilità di artefatti di movimento e può causare danni al tessuto imaged. Inoltre, tenere presente che alcune etichette fluorescenti di scansione provoca candeggio e tossicità, che dipende dalla potenza del laser e la concentrazione del colorante accumulato.
14. Dopo la scansione il Z-stack può essere valutata rapidamente facendo clic su "massima proiezione". Lo Z-stack viene salvato automaticamente nella base di dati e possono essere rinominati.

6. analisi dei dati

1. A seconda della domanda di ricerca originale, utilizzare uno dei diversi programmi software, quali ImageJ⁵, Matlab¹¹o Amira, per l'analisi dei dati. Analisi corretta è cruciale.

Risultati

L'attributo principale di videomicroscopia imaging è la visualizzazione longitudinale dei processi cellulari senza intervento invasivo. Per questo, vengono utilizzati gli animali transgenici esprimenti un marker fluorescente costitutivi o inducibili in celle di interesse. La figura 2 illustra l'espressione di etichette fluorescenti della proteina fluorescente eNOStag-verde (GFP)⁹ e Rosa-mTmG mouse linee¹⁰. La eNOStag-GFP è una linea di mouse che è prodotta internamente utilizzando un gene eNOS troncato come tag per GFP. D'importanza, eNOS è altamente espresso in cellule endoteliali, e il segnale GFP è chiaramente visibile in th eGolgi e membrana cellulare (Figura 2A). Rosa-mTmG topi hanno un allele di reporter Cre membrana-mirati di fluorescenza di due colori. Questa linea esprime mTomato fluorescenza in cellule diffuse ed EGFP in cellule che esprimono ricombinasi Cre ed è ampiamente utilizzata per l'analisi di lignaggio. Come un pezzo di tumore viene trapiantato da un donatore non transgenici, fluorescenza rossa è espresso principalmente dalle parti stromal nel tumore (ad esempio, nella membrana delle cellule vascolari, cellule di circolazione, infiltrato di cellule del sangue e tumore-collegati fibroblasti (Figura 2B)).

Formazione del vaso è strettamente regolata, e un eccellente modello per studiare questo è in via di sviluppo retina^12,13. Inoltre, la crescita del tumore del vaso è un processo cinetico che è simile in linea di principio lo sviluppo dei vasi retinici. Tuttavia, i vasi del tumore mancano di organizzazione e, come un tumore è continuo rimodellamento, così è il sistema vascolare del tumore-associati. Questo può avere i suoi vantaggi quando si utilizza il tumore come un modello di angiogenesi, come tutte le fasi di sviluppo del vaso possono essere trovate spesso nel tumore stesso allo stesso tempo. Questi includono un fronte di germogliatura endoteliale crescendo in una parte non-vascularized del tumore (Figura 2); vasi sanguigni danneggiati (Figura 2D); e un letto vascolare stabilito (Figura 2E-io) con maturo, ramificata vasi (Figura 2E-II). Tuttavia, le cellule endoteliali angiogeniche reperibile anche in queste aree. Quando sono stimolati da stimoli angiogenici, una cellula endoteliale sporge filopodi (Figura 2E-III) e può avanzare in una cella di punta, usando questi filopodi per scansione e direzionale migrazione (Figura 2E-IV). Questa cella di punta migra nell'interstizio del tumore ed è seguita da divisione delle cellule del gambo. Una cella singola punta endoteliale ha parecchi filopodi espansione, di ritrazione e rinnovare in qualsiasi momento e possa essere rilevata tramite microscopia intravital (Figura 2F).

In secondo luogo, microscopia intravital può essere utilizzata per determinare la formazione di lumen a un fronte angiogenici, flusso di tutto il tumore e lo stravaso di sangue. A seconda dei segnali fluorescenti intrinsechi di già presente nell'animale, si possono somministrare diversi composti fluorescenti. Stravaso e flusso sanguigno possono essere visualizzati usando Hoechst, destrani fluorescente o FITC-BSA. Per gli studi estesi sullo stravaso di flusso e delle particelle di sangue, lunga durata di circolazione fluorescente etichettati pegilato nanoparticelle di 100 nm può essere utilizzato. Per informazioni dettagliate sulla preparazione di queste nanoparticelle, vedere una pubblicazione precedente⁵. L'occupazione di questi composti è illustrata nella Figura 3. Le cellule endoteliali punta in un mouse Rosa-mTmG possono essere visto chiaramente invadendo il tessuto del tumore. Flusso sanguigno funzionale è dimostrato dalla fluorescenza viola delle nanoparticelle sistemica iniettate nel lume vascolare tubi (Figura 3A-io). Le nanoparticelle raggiungono strettamente le cellule endoteliali suggerimento che illustrano la formazione di un lume nell'area di cella gambo (Figura 3A-II). La consegna di chemioterapia sistemica somministrata dipende da un funzionale sistema vascolare al fine di raggiungere l'interstizio di tumore, e come illustrato in figura 3B, agenti iniettabili, indipendentemente dalle loro dimensioni, non penetrare in aree con vasi distrutti, compresse navi o imbarcazioni con stasi del sangue.

Nella maggior parte degli organi, il rivestimento endoteliale costituisce una barriera funzionale tra il sangue e il tessuto sottostante, e il passaggio delle molecole è strettamente regolato. Sistema vascolare del tumore-collegati, tuttavia, è noto per essere che perde, e dimensioni dei pori cut-off dipende in gran parte il tipo di tumore¹⁴. Destrani coniugato fluorescente con dimensioni diverse possono essere iniettati per valutare il flusso sanguigno e la permeabilità dello stravaso. Hoechst (Da 615) si diffonde rapidamente nel tessuto del tumore ed è preso dalle cellule circostanti (Figura 3-io). Poco dopo l'iniezione, destrano di 10 KDa (figura 3CII) e 2 MDa (Figura 3C-III) si trovano nel sangue. Tuttavia, destrano che 10 KDa è visto anche nell'interstizio del tumore, che indica la permeabilità del rivestimento endoteliale di molecole più piccole, che è una caratteristica attribuita ai vasi del tumore. 40 min dopo l'iniezione (Figura 3C-IV), destrano 10 KDa viene cancellato dal flusso di sangue (Figura 3C-V) e l'intensità di fluorescenza di destrano 2MDa è diminuito pure (Figura 3C-VI). Tuttavia, grande destrani non si trovano nell'interstizio del tumore, dimostrando una mancanza di permeabilità ai grandi molecole entro questo lasso di tempo.

Patofisiologia del tumore, con le sue aree altamente proliferanti, necrotiche e ONU-vascolarizzati, può essere abbastanza informativo quando si utilizza il tumore come un modello di angiogenesi. Tuttavia, questo presenta un problema per una terapia efficace e di indagine. L'eterogeneità del sistema vascolare del tumore-associati provoca una distribuzione eterogenea dei farmaci somministrati, lasciando intere aree droga-libero¹⁵. Per migliorare la consegna della droga, diverse strategie possono essere applicata^15,16,17, e progressione terapeutica può essere esaminato tramite questo disegno videomicroscopia. Il sistema vascolare del tumore-collegati possa essere manipolato usando agenti vasoattivi per migliorare droga consegna¹⁷. I risultati della manipolazione di nave del tumore usando alfa di necrosi del tumore (TNF) come agente vasoattivo in combinazione con Doxil, la formulazione liposomiale incapsulata di doxorubicina, come agente chemioterapeutico sono presentati in questo manoscritto^{5, 18 , 19}. in contrasto con i destrani, pegilato nanoparticelle sono fatta circolare per diverse ore, se non giorni, nella circolazione sanguigna²⁰.

Come accennato in precedenza, l'area del tumore può essere pre-scansione per identificare le aree di tumore corretta a seconda della domanda di ricerca. Destino di droga possa essere valutata in aree con un funzionale sistema vascolare contro aree con un letto vascolare già danneggiato (dati non mostrati). Per indagare sulla sorte degli agenti chemioterapeutici senza interferenze citotossici, nanoparticelle con la stessa composizione come agente terapeutico possono essere utilizzate come una droga di modello. Un animale eNOStag-GFP è stata trattata i.v. con queste nanoparticelle ed imaged 24 h più tardi. Le nanoparticelle erano ancora presenti nel sistema vascolare, con stravaso minimal nell'interstizio del tumore (Figura 4A-io). Tuttavia, quando le nanoparticelle sono state somministrate in combinazione con TNF, stravaso è stato osservato dal flusso sanguigno nell'interstizio del tumore (Figura 4A-II), aumentando la somministrazione di farmaci intratumoral. Utilizzando lenti obiettivo ad alta risoluzione, la localizzazione intracellulare di un composto può essere riconosciuta, come illustrato di seguito dalla posizione nucleare della Hoechst nel verde cellule endoteliali e cellule dell'interstizio del tumore (Figura 4B). Inoltre, come molti agenti chemioterapeutici, come doxorubicina, intercalano con il DNA, la localizzazione di questi composti può essere valutata. Doxorubicina ha proprietà fluorescente rosso, e il nanocarrier possono essere etichettati con, per esempio, perclorato di tetramethylindotricarbocyanine (fatto). Un animale eNOStag-GFP è stato iniettato i.v. con Doxil-fatto in combinazione con TNF e immagini sono state scattate 24 h dopo il trattamento. Doxil-extravasated fuori i vasi sanguigni ed è stato portato fino che circonda il tessuto del tumore (Figura 4-io). Una valutazione più dettagliata delle singole celle (Figura 4c-II) ha mostrato che il vettore può essere trovato nel citoplasma, mentre rilasciato doxorubicina è stata osservata nel nucleo cellulare.

Figura 1: strumenti, dorsali dello skinfold camera e installazione dell'apparecchiatura necessaria per la procedura. (A) frammenti di tumore (a) e gli strumenti chirurgici necessari per l'impianto. Gli strumenti non standard sono un orecchio puncher (b), un micro cacciavite (c) e un ago piegato (d). (B) dorsale dello skinfold camera di finestra. Anteriore (a) e (b) lunotto posteriore (freccia: fori per suture; arrowhead: fori per i bulloni), 2 bulloni (c), 2 dadi (d), 1 riempitore di vetro (e), 2 vetri di coperchio (f) e 2 mantenendo anelli (g). Inoltre, il anelli elastici senza ganci (freccia bianca) può essere utilizzato quando necessario. Piattaforma di controllo della temperatura (C) su misura camera titolare (A), bulloni per il titolare da camera a camera (b), (c), bulloni per fissare il supporto di camera alla piattaforma (d) e il titolare con l'anestesia del tubo (e). (D) animale montato nel supporto per alloggiamento sulla piattaforma. Un tumore B16BL6 (freccia) è visibile nell'area di visualizzazione della finestra. (E) apparecchiature necessarie per la valutazione intravital. Computer con formazione immagine e microscopio controllo software (un), standard fluorescente luce (b) e al microscopio. Un multifotonica confocale è stato usato (c) con un'unità di anestesia (d). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: fluorescenza intrinseca di animali transgenici. Tutte le immagini qui riportate sono proiezioni dello stack Z tra 50 e 70 µm di spessore. (A) In linea di eNOSGFP-tag, GFP è espressa nel Golgi (asterisco) e della membrana cellulare (freccia) delle cellule endoteliali. Barra della scala = 100 µm. (B) Intratumoral espressione dei mTomato nella linea Rosa-mTmG si trova soprattutto nella membrana cellulare di cellule vascolari (freccia) e cellule del sangue (asterisco). Barra della scala = 100 µm. (C) una proiezione di una crescente parte anteriore angiogenico in tumore non-vascularized. Barra della scala = 100 µm. (D) una proiezione di una parte del tumore con i vasi stabiliti e danneggiati (asterisco). (E) una proiezione del sistema vascolare del tumore stabilita (EI) mostrando maturo tick vasi (EII); cellule endoteliali punta angiogenici con filopodi (EIII, punta di freccia); e una nave matura, da cui una singola cellula endoteliale si estende un filopodium (EIV, punta di freccia) nell'interstizio. Barra della scala = 100 µm. (F) movimento di filopodi, seguita per 1 h. Ogni 15 min, uno Z-stack è stato prelevato; una proiezione massima è presentata qui. I filopodi estendono (freccia bianca), stagnante (=), retrattile (freccia rossa), o persino completamente scomparsa (-). Barra della scala = 25 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: amministrazione delle etichette iniettabili per illustrare il flusso sanguigno e dello stravaso. (A), A mouse di mTmG Rosa è stato iniettato con nanoparticelle fluorescenti viola, e uno Z-stack di un invasore fronte cella suggerimento è stato preso 10 minuti più tardi (AI). Una proiezione che risultati più endoteliale germogli hanno un lume funzionale (AII, freccia). Solo raramente i germogli endoteliali possono essere visto senza flusso (AII, punta di freccia). Barra della scala = 250 µm. (B), questa proiezione dello stack Z Mostra un'area di nave distrutta del tumore in un animale eNOStag-GFP prima del trattamento (BI). L'animale è stato iniettato con nanoparticelle (viola, BII) e Hoechst (blu, BIII). Nanoparticelle e Hoechst non raggiungono aree distrutte, indicati da detriti cellulari granulato ancora che esprimono GFP. Barra della scala = 250 µm. (C) un mouse eNOStag-GFP è stato iniettato con due destrani di diverse dimensioni (rosso = destrano 2 MDa; viola = destrano 10 KDa) e Hoechst (blu = Da 615), e piano singolo immagini sono presentati qui. 10 min dopo l'iniezione, la presenza nel sangue e lo stravaso sono visti nella stessa immagine. Hoechst extravasates quasi subito fuori i vasi sanguigni ed è preso dalle cellule circostanti (CI). Destrano 10 KDa (CII) può essere visto nei vasi e nell'interstizio del tumore. Destrano 2 MDa (CIII) può essere trovato nei vasi. 40 min dopo l'iniezione (CIV), destrano 10 KDa scomparirà dal sangue (CV), e l'intensità di fluorescenza di destrano 2 MDa è stato anche diminuito (CVI). Barra della scala = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: indagando il destino degli agenti chemioterapeutici. (A) un animale eNOStag-GFP è stata trattata i.v. con nanoparticelle ed imaged 24 h più tardi. Le nanoparticelle sono ancora presenti nei vasi, con stravaso minimal nell'interstizio del tumore (AI). Quando le nanoparticelle vengono combinate con TNF, stravaso è osservato dal flusso sanguigno nell'interstizio del tumore (AII). Barra della scala = 250 µm. (B) utilizzo di lenti ad alta risoluzione, il citoplasma endoteliale (verde) e nucleo (blu) di una singola cella può essere riconosciuti. Barra della scala = 50 µm. (C), un animale eNOStag-GFP è stato iniettato i.v. con Doxil-fatto in combinazione con TNF e immagini sono state scattate dopo 24 h. Qui, lo stravaso di Doxil-ha fatto fuori i vasi sanguigni nel tumore interstizio è ovvio (CI). Una valutazione più dettagliata delle singole celle (CII) dimostra che il vettore viola può essere trovato nel citoplasma (freccia), mentre la doxorubicina rilasciata (rossa) si osserva nel nucleo cellulare (punta di freccia). Barra della scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Come tumore e lo sviluppo dei vasi del tumore, così come gli effetti terapeutici del tumore, sono processi altamente dinamici, videomicroscopia valutazione è uno strumento elegante per fare una corretta valutazione di questi processi in maniera temporale e spaziale. Con la crescente disponibilità di marcatori di cellule vive, la creazione di animali transgenici e la promozione di modalità di imaging, imaging videomicroscopia sta diventando sempre più popolare. Anche se l'istologia è ancora abitualmente utilizzato, e una moltitudine di indicatori può essere utilizzata per identificare le cellule e strutture, tessuto di sezionamento ha svantaggi quando studia i processi dinamici. Dissezione del tessuto è richiesta, fornendo solo informazioni statiche; fissazione influisce sulla qualità del tessuto; e affettare danneggia interazioni cellulari. Inoltre, durante l'analisi di processi dinamici, dissezione del tessuto agli intervalli di tempo differenti e spesso presunti, richiede una grande quantità di animali. Con videomicroscopia imaging, le dimensioni spaziali XYZ e la dimensione extra di tempo possono essere valutate nello stesso animale, permettendo il corretto posizionamento dei giocatori differenti nello spazio e nel tempo. Pertanto, non sono mancati momenti ottimali ed è ridotto significativamente il numero degli animali utilizzato per esperimento. In secondo luogo, l'intervallo di tempo stabilito con videomicroscopia valutazione possa essere estrapolato per ottimizzare l'estrazione del tessuto. In terzo luogo, la fase desiderata della crescita dei vasi può essere identificata intravitally e macchiata come un tessuto intero-monta.

Il design intravital citato in questo manoscritto utilizza una combinazione di animali transgenici che esprimono un'etichetta fluorescente in cellule endoteliali, una versione modificate dorsale dello skinfold camera modello e un microscopio confocale multifotonica dedicato.

Cellule endoteliali passare attraverso una serie di fasi^21,22 durante l'angiogenesi, e queste fasi possono essere spesso visto contemporaneamente in un tumore. Utilizzando la linea di mouse eNOSTag-GFP, singole cellule endoteliali possono essere seguite, e anche filopodi dinamiche possono essere rintracciati. È quindi un buon modello per studiare lo sviluppo dei vasi intravitally. A seconda le etichette intrinseche già presente, iniettabili agenti fluorescenti possono essere utilizzati per valutare il lume, flusso sanguigno, stravaso e sangue clearance. Il mouse è imaged continuamente per fino a 5 h. La valutazione a lungo termine di un animale è fattibile quando sono prese alcune precauzioni per quanto riguarda l'anestesia dell'animale, che è stato descritto in precedenza²³. Come questa ricerca si concentra sul cancro, tumori tessuto o le cellule sono state impiantate. Tuttavia, abbiamo anche sperimentato con metatarsi e polmoni embrionali. Tuttavia, il tasso di crescita del tessuto in fase di studio è limitante, come dopo un paio di settimane, la pelle inizia a ricrescere, che può essere un problema con i tumori a crescita lenta o tessuti.

Durante la fase di convalida, la dorsale che dello skinfold camera finestra era notevolmente modificato rispetto al modello classico⁴. I telai sono costruiti con materiale sintetico autoclavabile e sono leggeri e piccoli, con una zona di grande finestra vista. Il gancio dell'anello di tenuta (figura 1Bg, punta di freccia bianca) viene utilizzato solo per la facile rimozione dell'anello. Anelli di fermo senza ganci possono essere utilizzati quando questi interferiscono con la formazione immagine. La pelle non è allungata troppo, allentamento non si verifica in questo modello, e le infezioni sono solo raramente. Queste modifiche riducono il disagio dell'animale e perfezionare la procedura animale significativamente. Inoltre, le parti metalliche possono esser facilmente rimosso quando il tumore usando MRI²⁴di imaging.

Qualsiasi microscopio può essere adottata per intravitally immagine dorsale dello skinfold chambers. Il requisito principale è lo spazio disponibile tra il tavolino del microscopio e la lente dell'obiettivo. Un aspetto importante che riguarda la formazione immagine è movimento. Per evitare artefatti da movimento, una piattaforma che si inserisce nella tabella microscopio (dopo la rimozione di tutti gli inserti) e supporta il mouse deve essere utilizzata. Non è necessaria a trattenere il mouse quando è sotto anestesia, ed è meglio lasciare che il respiro del mouse liberamente. Tuttavia, la finestra è imbullonata sulla piattaforma, dando il fissaggio ottimale del campo visivo (cioè, il tumore è visibile attraverso la camera di finestra). La piattaforma è riscaldata utilizzando un rilievo di riscaldamento elettronico, come usato per il riscaldamento degli animali. Questa piattaforma è stata fatta in casa, e specifiche possono essere ottenute su richiesta. Un obiettivo ad alta risoluzione è una necessità quando valutare processi intracellulari e permette di discriminare tra il citoplasma e il nucleo. L'uso di una lente conica con una buona risoluzione ottica (alta NA) ma una relativamente lunga distanza di lavoro (preferibilmente 2 mm o superiore) è raccomandato. La limitazione nell'imaging è la profondità di penetrazione e l'intensità di fluorescenza delle etichette. Inoltre, photobleaching, fototossicità e saturazione deve essere evitate durante la formazione immagine.

Qui, sono stati utilizzati un confocal-multifotonica integrato e un microscopio confocale. Il multifotonica è in posizione verticale, mentre il confocale è un microscopio invertito. Il vantaggio di un microscopio verticale è la facilità d'uso di lenti di immersione in acqua. Queste lenti hanno un alta NA e una lunga distanza di lavoro, anche a un ingrandimento di alta (per esempio, 20 o 40 X). In particolare, si consiglia di ottenere un obiettivo di immersione in acqua X NA 1.0 20, che è venduto da parecchie società. Essere consapevoli del fatto che, quando vengono utilizzate lenti ad immersione, l'obiettivo e il liquido di immersione bisogno di essere riscaldata a 37 ° C. Per le immagini migliori, si consiglia di utilizzare le impostazioni ottimali confocale (cioè, pinhole a 1 unità arioso, laser di potenza più basso guadagno possibile, non troppo alta (soprattutto se il guadagno introduce rumore), velocità al massimo e non con una media di scansioni di linea). Sovraesposizione, saturazione e la differenza di intensità tra immagini compromettere la qualità dei dati. Si raccomanda di evitare la saturazione e la sovraesposizione. Questo può essere aggirato con l'acquisizione di immagini impostazioni diverse di guadagno. Cambiare il guadagno è il modo più semplice per modificare la luminosità dell'immagine. Se necessario, la potenza del laser può essere regolata. Per standardizzare la qualità delle immagini, diapositive con un'intensità di fluorescenza fisso possono essere utilizzati. Si deve tenere a mente che, anche quando il microscopio è impostato in modo ottimale, qualità dell'immagine è determinata in larga misura dalla qualità della camera di finestra e del tessuto

Quando la scansione simultanea di più marcatori fluorescenti, trapasso, in cui viene rilevato un fluoroforo nel canale di un altro, deve essere evitato. Evitare di trapasso utilizzando una combinazione di fluorofori con minimi spettri sovrapposti e sequenziale di scansione tra i fotogrammi. Le immagini presentate qui sono state scannerizzate usando 3 scansioni sequenziali (traccia 1: GFP, DID o fluor647 con il laser 488 e 633; traccia 2: rodamina, Doxil o mTomato con il laser 543; e track 3: Hoechst con il laser 405).

La possibilità di valutare le diverse fasi di sviluppo del vaso del tumore, punta cella dinamiche, formazione lumen, stravaso e danno vascolare è mostrata qui. Utilizzando la riga di eNOStag-GFP, zone del tumore con un letto vascolare distrutto sono facilmente rilevabili da granulato cellulari avanzi ancora che esprimono GFP. Nessun agente iniettabile è stato rilevato in questi settori, che indica la mancanza di flusso. Ciò significa che somministrati agenti chemioterapeutici non raggiungerà neanche queste aree. Tuttavia, distruzione del vaso può anche essere un risultato terapeutico. Pre-valutazione del tumore, per verificare la distruzione del vaso di pre-trattamento, è un prerequisito per l'accurata valutazione terapeutica e può essere facilmente eseguita utilizzando questo disegno sperimentale.

C'è una pletora di possibilità per cui microscopia intravital può essere utilizzata, e discussione dettagliata esula dall'ambito della presente pubblicazione. Per dare una breve panoramica, possibili applicazioni includono studi sull'accumulo di chemioterapici nel tessuto del tumore, lo sviluppo dei vasi (ad esempio, il numero di vasi, rami e intersezioni) e del flusso sanguigno, interazioni cellula-cellula, cella di destinazione e processamento intracellulare, nonché esempi di cui sopra e mostrato qui. Analisi si basa sulla fluorescenza, tenere conto delle fluttuazioni di intensità a causa della qualità della finestra o del tessuto. Inoltre, come il tessuto del tumore è relativamente spesso, fluorescenza da sopra o sotto il piano della vista ha un impatto sul segnale nell'immagine. È meglio combinare l'analisi di immagine quantitativa con misurazioni oggettive. Per esempio, se siete interessati nelle concentrazioni nella droga, rimuovere il tessuto del tumore dalla finestra dopo microscopia intravital e determinare il farmaco contenuto utilizzando con HPLC da confrontare con le immagini confocale.

La valutazione della risposta tumorale può essere eseguita anche utilizzando questo modello, ma con alcune precauzioni. Uno deve rendersi conto che i tumori si sviluppano anche verso l'interno, nella pelle. Misurazioni 3D possono essere fatto se la penetrazione è abbastanza profonda per coprire l'intero tumore. In tal caso, da' coloranti dovrebbero essere usati. La camera di finestra come descritto qui offerte con i tumori in un ambiente di pelle, ed è importante sottolineare che la finestra mantiene una temperatura leggermente inferiore rispetto alla temperatura corporea normale mouse. Pertanto, si consiglia di studiare i tumori in ambito ambientale in micro per confermare intravital studi con la dorsale dello skinfold camera di finestra. Soprattutto, la dorsale dello skinfold camera offre spaccato la cinetica dei processi e dei meccanismi, fornendo una base strumentale per il miglioramento della terapia. Inoltre, possono essere ottenuti informazioni extra sulla biodistribuzione e la farmacocinetica. Classicamente, questi studi di biodistribuzione sono eseguiti da trattare gli animali del tumore-cuscinetto e dissezione tumori/organi per misurare l'assorbimento del farmaco. Utilizzando questo modello videomicroscopia, la posizione di intratumoral di un farmaco (cioè, intravascolare, intratumoral, intracellulare, o nucleare) possa essere fornita^5,25,26. Non solo è la posizione della droga ha rivelata, ma anche il tempo finestra-di-opportunità per l'assorbimento ottima.

Utilizzando il disegno sperimentale descritto in questo articolo, una vasta gamma di parametri può essere valutata in un contesto temporale e spaziale. In particolare, qui vi mostriamo che quello Microscopia intravital fornisce importanti intuizioni le dinamiche di sviluppo del vaso del tumore e della risposta terapeutica.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM	Sigma	D1145	Integrato con il 10%
di FCS Tripsina-versene (EDTA)	Lonza	BE17-161E	Preparare una soluzione allo 0,1% in PBS,
sterile PBS
Telai per finestre	Costum made
Vetro di riempimento 10 mm, 0,55 mm	Abrisia technologies
Vetro di copertura 12 mm, spessore	#1Thermo Scientific/VWR	631-0713
Gel per la rimozione dell'udito (veet)			per pelli sensibili
Unguento
Buprenorfina cloridrato			uso 0,05 mg/kg
Unità			di anestesia Unità di inalazione O2/isoflurano con camera e tubo + siringa per insulina a cono
0,5 ml x 12,7 mm 29 g, verde	BD
aghi 23G 1 1/4"	Braun	4657640
aghi 25G 5/8"	Braun	4657853
suture silkan 0,7	Braun	1134019
dadi	Jeveka	934 A2 1
bulloni	Jeveka	84 A2 1 10
0,9% NaCl
microscopio + software			Lo spazio tra il tavolo e l'obiettivo deve essere sufficientemente ampio da contenere l'animale
Piattaforma riscaldata a temperatura controllata	Costum made Window holder
	Costum made
tetramethylrhodamine 2.000.000 MW destrano	Invitrogen	D7139	100 &; g/mouse
Alexa-fluor 647 10.000 MW destrano	Invitrogen	D22914	100 &; micro; g/mouse
Hoechst 33342	Invitrogen	H1399	25 µ g/mouse
Nanoparticelle			ref 5
LEICA TCS SP5 Microscopio multifotone	Leica
LAS AF Software	Leica