Il potenziale terapeutico delle cellule staminali/stromali mesenchimali (MSC) è ben documentato, tuttavia il metodo migliore per preparare le cellule per i pazienti rimane controverso. In questo articolo, comunichiamo i protocolli per generare e somministrare in modo efficiente aggregati sferici terapeutici o "sferoidi" di MSC innescati in condizioni prive di xeno per applicazioni sperimentali e cliniche.
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Articolo metodologico
Produzione e somministrazione di Therapeutic staminali mesenchimali / stromali cellulare (MSC) Spheroids innescato in Culture 3-D, in condizioni Xeno-free
In questo articolo
Sommario
Abstract
Mesenchimali staminali / cellule stromali (MSC) sono molto promettenti in bioingegneria e medicina rigenerativa. MSC possono essere isolate da più tessuti adulti attraverso la loro forte aderenza alla plastica coltura dei tessuti e poi ulteriormente espanse in vitro, più comunemente utilizzando siero fetale bovino (FBS). Poiché FBS può causare MSC diventare immunogeno, la sua presenza nelle culture MSC limita sia applicazioni cliniche e sperimentali delle cellule. (XF) media liberi-xeno Pertanto, gli studi impiegando chimicamente definiti per le culture MSC sono estremamente preziose. Molti effetti benefici di cellule staminali mesenchimali sono state attribuite alla loro capacità di regolare l'infiammazione e l'immunità, soprattutto attraverso la secrezione di fattori immunomodulatori come fattore di necrosi tumorale-stimolata gene 6 (TSG6) e prostaglandina E2 (PGE2). Tuttavia, MSC richiedono l'attivazione per la produzione di questi fattori e dal momento che l'effetto di MSC è spesso transitoria, grande interesse è emerso per scoprire modi di pre-attivando le cellule prior per il loro utilizzo, eliminando così il tempo di ritardo per l'attivazione in vivo. Qui vi presentiamo i protocolli per attivare in modo efficiente o MSC primi tridimensionale culture (3D) in condizioni XF chimicamente definite e per amministrare questi MSC pre-attivati in vivo. In particolare, abbiamo prima descritto metodi per generare MSC sferica micro-tessuti o "sferoidi" in gocce appesi utilizzando media XF e dimostrare come le sfere e mezzo condizionato (CM) possono essere raccolte per varie applicazioni. In secondo luogo, descriviamo schermi di espressione genica e saggi in vitro funzionali di valutare rapidamente il livello di attivazione MSC in sferoidi, sottolineando il potenziale anti-infiammatori e anti-cancro delle cellule. In terzo luogo, si descrive un nuovo metodo per iniettare sferoidi MSC intatti nel mouse cavità peritoneale in vivo prove di efficacia. Nel complesso, i protocolli qui superare le grandi sfide di ottenere cellule staminali mesenchimali pre-attivato in chimica definita XF concondizioni e offrono un sistema flessibile per amministrare sferoidi MSC per le terapie.
Introduzione
Staminali mesenchimali / cellule stromali (MSC) hanno mostrato un grande potenziale di vari approcci medicina rigenerativa. MSC sono stati inizialmente isolato come componente stromale del midollo osseo, ma da allora sono stati ottenuti da numerosi altri tessuti adulti, tra tessuto adiposo 1, 2, 3. È interessante notare che il metodo di isolamento principale abbraccia la notevole proprietà di MSC di aderire saldamente plastica coltura tissutale in presenza di siero fetale bovino (FBS). Sebbene questa tecnica tradizionale isolamento consente una facile e rapida espansione del....
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Protocollo
1. Isolamento MSC ed espansione
- Ottenere MSC passaggio primi dal Centro per la preparazione e distribuzione di cellule staminali adulte ( http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html~~number=plural ) 15 fiale come congelati. In alternativa, isolare cellule staminali mesenchimali da aspirati midollari a seguito di un protocollo di routine 14 e memorizzare fiale come congelati.
- Preparare terreno di coltura completo (CCM), che è minima alpha mezzo essenziale (αMEM) integrato con premium 15-20% selezionare FBS, 2 ....
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Risultati
Nel lavoro attuale, appesi culture goccia sono stati impiegati per generare compatte micro-tessuti sferiche o "sferoidi" di MSC attivati in condizioni XF. La tabella di marcia in fase di sperimentazione in figura 1 illustra che le MSC sono incoraggiati a auto-assemblarsi in sferoidi quando sospeso in appeso gocce per 72 ore, dopo di che gli sferoidi, o la CM carichi di fattori terapeutici sfera-derivati, possono essere raccolti e potenzialmente utilizzati in .......
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Discussione
La MSC ottimale per l'uso in alcune applicazioni di ricerca e clinica deve essere altamente attivato per massimizzare il loro vantaggio, e preferibilmente prodotta in condizioni XF chimicamente definite per ridurre al minimo la consegna dei potenziali antigeni dai componenti di media xenogene quali FBS. Nei protocolli descritti qui, abbiamo dimostrato metodi a 1) attivare MSC nella cultura 3D dalla formazione di sferoidi, 2) ottenere l'attivazione 3D di cellule staminali mesenchimali in condizioni XF, 3) valutar.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato in parte da sovvenzioni P40RR17447 dal National Institute of Health e da RP150637 premio dal Cancer Prevention and Research Institute of Texas. Ringraziamo il Dr. Darwin J. Prockop per il suo sostegno al progetto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| MEM-&alfa; (minimo essenziale medio alfa) | ThermoFisher/Gibco | 12561049; 12561056; 12561072 | terreno minimo essenziale per la preparazione del terreno di crescita MSC (CCM) |
| FBS (siero fetale bovino), selezione premium | Atlanta Biologicals | S11595; S11510; S11550; S11595-24 | componente di terreni di coltura completi per tutti i tipi di cellule |
| L-glutammina | ThermoFisher/Gibco | 25030081; 25030149; 25030164 | componente di terreni di coltura completi per tutti i tipi di cellule |
| Penicillina/Streptomicina | ThermoFisher/Gibco | 15070063 | componente di terreni di coltura completi per tutti i tipi di cellule |
| Unità filtranti di sterilizzazione, 0,22 e micro; m membrana PES | MilliporeSigma | SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE | terreno di sterilizzazione |
| 150 mm piatto per coltura cellulare | Nunc | D8554 Coltura cellulare SIGMA | |
| Incubatore umidificato CO2 con camicia d'acqua | Thermo Fisher | Modello 3110 | Incubazione di cellule in coltura |
| MCS a passaggio precoce | Centro per la preparazione e la distribuzione di cellule staminali adulte presso il Texas A& M Health Science Center College of Medicine Istituto di Medicina Rigenerativa presso Scott & Preparazione NA bianca | di colture 2D e 3D di MSC | |
| bagnomaria | VWR | 89501-468 | mezzi riscaldanti a 37 gradi C |
| Pipette | Eppendorf | 492000904 | manipolazione manuale di liquidi |
| Pipete-Aid | Drummond Scientific Company | 4-000-300 | pipette sereologiche |
| per manipolazione Costar pipetta sierologica sterile (5, 10, 25 e 50 ml) | Corning | 4487; 4101; 4251; 4490 | manipolazione di liquidi |
| PBS (soluzione salina tamponata con fosfato), pH 7,4 | ThermoFisher/Gibco | 10010023; 10010072; 10010031; 10010049 | per la lavorazione di colture cellulari |
| tripsina/EDTA allo 0,25% | ThermoFisher/Gibco | 25200056; 25200072; 25200114 | sollevamento di cellule aderenti e aggregati cellulari disperdenti |
| Provetta conica da 15 ml | Centrifugazione cellulare | Corning/BD Falcon | 352097 |
| Provetta conica da 50 ml | Corning/BD | Falcon 352098 | Centrifugazione refrigerata |
| Eppendor | Ependorf/Fisher Scientific | Modello 5810R | |
| Emocitometro | Fisher Scientific | 26716 | Conteggio delle cellule |
| blu di tripano | Sigma-Aldrich | T8154 Esclusione | delle cellule morte SIGMA durante il conteggio delle cellule nell'ematocitometro |
| Definito xenofree MSC medium-1 (XFM-1) | ThermoFisher/Gibco | A1067501 | Terreni privi di xeno specificamente formulati per la crescita e l'espansione di cellule staminali mesenchimali umane |
| Definito xenofree MSC medium-2 (XFM-2) | Stem Cell Technologies | 5420 | Terreno definito e privo di xeno per cellule staminali mesenchimali umane |
| HSA (Human serum albumin) | Gemini | 800-120 | Componente di terreni MSC privi di xeno |
| rHSA (albumina sierica umana ricombinante) | Sigma-Aldrich | A9731 SIGMA | Componente di terreni MSC privi di xeno |
| Isolamento dell'RNA totale Mini Kit | Qiagen | 74104 | Estrazione dell'RNA totale |
| Qiashredder | Qiagen | 79654 | Omogeneizzazione del campione prima dell'estrazione dell'RNA totale |
| Set di DNasi senza RNAsi | Qiagen | 79254 | Eliminazione del DNA su colonna durante l'estrazione dell'RNA totale |
| β-mercaptoetanolo | Sigma-Aldrich | M6250 | Inibizione ALDRICH delle RNAsi nel tampone RLT |
| Vortex | VWR | 97043-562 | miscelazione |
| Spettrofotometro | Biorad | NA | RNA Concentrazione e qualità dell'RNA |
| Kit di trascrizione inversa di cDNA ad alta capacità | ThermoFisher/Applied Biosystems | 4368814 | trascrizione dell'RNA totale in cDNA |
| Saggi di espressione genica | ThermoFisher/Applied Biosystems | varia la | combinazione primer/sonda per la PCR in tempo reale |
| Fast Universal PCR Master Mix | ThermoFisher/Applied Biosystems | 4352042; 4364103; 4366073; 4367846 | Mix per la reazione alla PCR in tempo reale |
| Sistema di PCR in tempo reale (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System) | ABI Prizm | NA | PCR in tempo reale |
| Provetta da centrifuga da 1,5 ml | Eppendorf | 22364111 | centrifugazione cellulare, raccolta e conservazione dei campioni |
| (-80 ° C) congelatore | Thermo Fisher | Modello Thermo Forma 8695 | conservazione campioni |
| PGE2 (Prostaglandina E2) Kit ELISA | R& D Sistemi | KGE004B | stima della concentrazione di citochine nel campione |
| DMEM (Dulbecco' s modificato Eagle medium) | ThermoFisher/Gibco | 10566-016; 10566-024; 10566-032 | terreni di coltura di macrofagi |
| J774 macrofagi di topo | ATCC | TIB-67 | linea cellulare di macrofagi di topo |
| 12 pozzetti | Corning | 3513 | in vitro stimolazione dei macrofagi |
| LPS (lipopolisaccaride) | Sigma-aldrich | L4130 | in vitro stimolazione dei macrofagi |
| Kit ELISA TNF-a di topo | R& D Systems | MTA00B | stima della concentrazione di citochine nel campione |
| di topo IL-10 (interleuchina 10) Kit ELISA | R& D Systems | M1000B | Stima della concentrazione di citochine nel campione |
| Terreno RPMI-1640 | ThermoFisher/Gibco | 11875-085 | terreno di coltura di splenociti |
| Topi BALB/c | The Jackson Laboratory | 651 | in vivo consegna di sferoidi; preparazione di splenociti |
| Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified | eBioscience | 145-2C11 | in vitro stimolazione splenocitaria |
| 70 μ m filtro | Corning | 352350 | Preparazione degli splenociti |
| Soluzione di lisi dei globuli rossi (1x) | Affymetrix eBioscience | 00-4333 | rimozione dei globuli rossi durante l'isolamento degli splenociti |
| Mouse IFN-γ (interferone gamma) Kit ELISA | R& Sistemi D | MIF 00 | stima della concentrazione di citochine nel campione |
| di cellule di cancro alla prostata LNCaP. | ATCC | CRL-1740 | studia l'effetto delle MSC 3D sulle linee cellulari tumorali in vitro |
| Kit di analisi della proliferazione cellulare basato sul DNA | ThermoFisher | C7026 | Misurazione del numero di cellule in base al contenuto di DNA |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5150 | componente del reagente di lisi |
| EDTA (acido etilendiamminotetraacetico) | FERR1021 | ThermoFisher | componente del reagente di lisi |
| Rnase A | Qiagen | 19101 | Degradazione dell'RNA per la misurazione del DNA |
| Lettore di micropiastre multimodale basato su filtro | Tecnologia BMG | Saggi per micropiastre NA (ELISA, quantificazione cellulare, ecc.) | |
| HBSS (soluzione salina bilanciata di Hanks), senza calcio, senza magnesio, senza rosso fenolo | ThermoFisher/Gibco | 14175079 | risorsione degli sferoidi MSC prima delle iniezioni in vivo |
| Isoflurane | MWI Vet Supply | 502017 | Anestesia per iniezioni in vivo |
| Ossigeno, gas compresso | Praxair | NA | Per l'uso con l'isoflurano |
| Thermo Forma BSL-2 armadio | Thermo Fisher | Modello 1385 | |
| Catetere/ago per via endovenosa di sicurezza per coltura cellulare, 20 G, 1 pollice | Terumo | SR*FNP2025 | Erogazione di shperoid nella cavità peritoneale |
| Puntali per micropipette sterili | Eppendorf | varia la | gestione di liquidi/cellule |
Riferimenti
- Keating, A. Mesenchymal stromal cells: New directions. Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).
- English, K., Wood, K. J. Mesenchymal stromal cells in transplantation rejection and tolerance. Cold Spring Harb Perspect.Med. 3 (5), a015560(2013).
- Le Bl....
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Ristampe e permessi
