Temporale ordinazione di espressione Dynamic Data di espressione spaziale dettagliata Mappe

Sommario

L'orologio di segmentazione guida l'espressione genica oscillatoria attraverso il mesoderma pre-somitico (PSM). L'attività Dynamic Notch è fondamentale per questo processo. Utilizziamo l'imaging e le analisi computazionali per estrarre la dinamica temporale dai dati di espressione spaziale per dimostrare che l'espressione del ligando Delta e del recettore Notch oscilla nel PSM dei vertebrati.

Abstract

Durante la somitogenesi, coppie di somiti epiteliali si formano in modo progressivo, germogliando dall'estremità anteriore del mesoderma pre-somitico (PSM) con una rigorosa periodicità specie-specifica. La periodicità del processo è regolata da un oscillatore molecolare, noto come "orologio di segmentazione", che agisce nelle cellule PSM. Questo orologio guida i modelli oscillatori di espressione genica attraverso il PSM in direzione posteriore-anteriore. Questi cosiddetti geni orologio sono componenti chiave di tre vie di segnalazione: Wnt, Notch e fattore di crescita dei fibroblasti (FGF). Inoltre, la segnalazione Notch è essenziale per sincronizzare le oscillazioni intracellulari nelle cellule vicine. Di recente abbiamo acquisito informazioni su come questo possa essere regolato meccanicamente. Dopo l'attivazione del ligando, il recettore di Notch viene scisso, rilasciando il dominio intracellulare (NICD), che si sposta verso il nucleo e regola l'espressione genica. La NICD è altamente labile e il suo turnover dipendente dalla fosforilazione agisce per limitare la segnalazione di Notch. Il profilo della produzione (e degradazione) di NICD nel PSM è noto per essere oscillatorio e per assomigliare a quello di un gene orologio. Recentemente abbiamo riportato che sia il recettore Notch che il ligando Delta, che mediano l'accoppiamento intercellulare, mostrano essi stessi un'espressione dinamica sia a livello di mRNA che di proteina. In questo articolo, descriviamo i metodi di rilevamento sensibili e gli strumenti di analisi dettagliata delle immagini che abbiamo usato, in combinazione con la modellazione computazionale che abbiamo progettato, per estrarre e sovrapporre i dati di espressione da punti distinti nel ciclo di espressione. Questo ci ha permesso di costruire un quadro spazio-temporale del profilo di espressione dinamica per il recettore, il ligando e i geni dell'orologio bersaglio di Notch durante un ciclo di oscillazione. Qui, descriviamo i protocolli utilizzati per generare e coltivare gli espianti di PSM, nonché la procedura per colorare l'mRNA o la proteina. Spieghiamo anche come le immagini confocali sono state successivamente analizzate e ordinate temporalmente computazionalmente per generare sequenze ordinate di istantanee dell'espressione dell'orologio, d'ora in poi definite "chimografi", per la visualizzazione dell'espressione spazio-temporale di Delta-like1 (Dll1) e Notch1 in tutto il PSM.

Introduzione

Somiti sono i primi segmenti formati dell'asse del corpo allungando nello sviluppo specie di vertebrati e sono i precursori della colonna vertebrale, costole, e derma tessuti, nonché del muscolo e cellule endoteliali. Durante somitogenesis, somiti epiteliali formano dal mesoderma non segmentato presomitic (PSM) (rivisto in riferimento 1). Questo processo è regolato dal "orologio di segmentazione", che consiste in una rete di geni oscillatori e proteine, per lo più appartenenti al percorso di segnalazione Notch. L'orologio di segmentazione è costituito da vari anelli di retroazione negativa, che consentono la produzione di attività pulsatile Notch all'interno di una singola cella ² (recensione in riferimenti 3-6). Mentre il metodo intracellulare di oscillazione è ben caratterizzato, è ancora in gran parte sconosciuto come queste oscillazioni sono coordinati in tutto il tessuto PSM. Recentemente è stato dimostrato attraverso studi sperimentali e teorici, che queste oscillazioni sono essential al processo di somitogenesis e che il percorso Notch gioca un ruolo fondamentale nel processo di segmentazione e sia espressione genica oscillatorio ^{7, 8.} Tuttavia, è stato ampiamente riportato che il recettore Notch 1 (Notch1) e ligando Delta-like (Dll) -1 avere gradienti statiche nel PSM ^{9, 10, 11.}

Abbiamo ipotizzato che le oscillazioni Notch-dipendente dell'orologio PSM segmentazione dipendono l'attivazione periodica del principale recettore Notch percorso e ligando, Notch1 e DLL1 rispettivamente, attraverso il PSM mouse. Le conclusioni di studi precedenti che hanno riportato un gradiente rostrale-caudale statica di queste proteine ​​erano dovuti, si prevede, ad una mancanza di sensibilità nelle tecniche di immunoistochimica. Essi erano quindi in grado di rilevare le fluttuazioni di basso livello di DLL1 e Notch1 nel PSM caudale.

noi have messo a punto un metodo per esaminare più da vicino questi fattori, che combina i dati sperimentali con modellazione matematica per prevedere un meccanismo attraverso il quale le oscillazioni delle proteine dei componenti dell'orologio sono coordinate in tutto il PSM ^12.

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di rilevare e quantificare a basso livello, espressione di proteine dinamica del PSM e per mappare i profili di espressione di proteine di interesse secondo l'espressione del gene orologio noto, frangia estremista (Lfng). Dal momento che un ciclo di clock di segmentazione nell'embrione mouse prende 2 ore per completare, vari campioni sono necessari per costruire un profilo spazio-temporale completa di espressione della proteina DLL1 e Notch1 durante una oscillazione Lfng nel PSM. Abbiamo così sviluppato questo protocollo per poter rivelare un high-throughput di espressione della proteina a basso livello in tutto il montaggio, controlaterale espianti PSM. Tuttavia, questa tecnica può anche essere utile per studi tcappello lo scopo di caratterizzare la dinamica delle proteine ​​di basso livello all'interno di qualsiasi tessuto embrionale che può essere diviso in due metà controlaterale.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in progetto il numero di licenza 6.004.219 in stretta aderenza agli animali (procedure scientifiche) Act del 1986 ei codici del Regno Unito Ministero degli Interni di pratica per l'uso di animali nelle procedure scientifiche.

1. PSM Espianto Dissection

1. Ottenere il tessuto coda da embrioni prodotti dalla accoppiamento a tempo di wild-type (CD1) topo ^13. Brevemente, al giorno embrionale (E) 10.5, eutanasia il topo donatore incinta in una camera di anidride carbonica. Raccogliere il corno uterino e posizionarlo nella soluzione 1x sterile PBS (PBS), secondo le procedure di licenza del Ministero degli o norme locali equivalenti. Trasferire il corno uterino ad un piatto di coltura di tessuti contenenti fresco, PBS sterile. Eseguire tutte le successive fasi di dissezione in questa soluzione.
2. Sotto uno stereomicroscopio, tagliare la membrana muscolare spessore del corno uterino con le forbici curve ed estrarre ogni embrione con cura utilizzando una pinza sottile. Stai attentoper garantire che il tessuto coda non è danneggiato in questo processo. Utilizzando forbici curve e una pinza sottile, sezionare via il sacco amniotico da ogni embrione, facendo attenzione a non danneggiare l'embrione.
3. Utilizzare un ago chirurgico o forbici curve per raccogliere il tessuto coda di ogni embrione tagliando posteriore dell'embrione alle gemme degli arti posteriori.
4. Bilanciare il tessuto coda ventrale rivolto verso il basso con entrambe le pinze e un ago. Generare coppie di PSM espianti da ogni coda embrionale sezionando il tessuto coda in due metà lungo la linea mediana; eseguire un movimento oscillante gentile con un ago. Assicurarsi che il tubo neurale, notocorda, e il tessuto PSM sono equamente divisi tra le due espianti.
5. Pipettare ogni controlaterale espianto PSM sulla parte inferiore di un coperchio piatto cultura plastica 35 mm in un piccolo volume di pre-riscaldato (37 ° C) di coltura (DMEM-F12 + 0,1% di L-glutammina sostituto supplementato con 10% di siero fetale bovino , 10 nM bFGF umano, e l'1% di penicillina / streptomicina).
6. Posizionare il piatto sulla parte superiore del coperchio e rapidamente invertire in modo che il tessuto PSM è sospeso dal coperchio in una "goccia appeso" del mezzo. Cultura espianti PSM in una camera umidificata a 37 ° C per 1 - 2 h.
7. paia di trasferimento di espianti PSM ai singoli pozzetti di una piastra di coltura tissutale 24 pozzetti. Incubare in 4% paraformaldeide in PBS per 1 ora a temperatura ambiente (RT) o 4 ° C overnight (O / N). ATTENZIONE: Paraformaldeide è tossico, e deve essere preso adeguate misure di sicurezza quando si lavora con questa soluzione.
   NOTA: Eseguire tutte le successive di lavaggio e di incubazione passi in una piastra di coltura tissutale 24 pozzetti.
8. Lavare i pozzetti del campione in PBS a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante, con un bel pipetta di plastica Pasteur di scambiare la soluzione PBS sui campioni di PBS fresco 3 - 4 volte. Elaborare un espianto PSM da ciascuna coppia mediante immunoistochimica (fase 2) e l'altra con ibridazione in situ fluorescente per un gene orologio noto (vep 3).

2. L'immunoistochimica di PSM espianti

1. Lavare un espianto PSM da ciascuna coppia embrionale generato nel passaggio 1 in 2% Triton X-100 in PBS per 1 ora a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante, e quindi risciacquare campioni brevemente in PBS. Sostituire il PBS sui campioni con soluzione bloccante (albumina 2% di siero bovino (BSA) e 10% siero normale di capra (NGS) in PBS + 0,1% Tween-20) e incubare O / N a 4 ° C su una piattaforma oscillante.
   NOTA: Tutti i lavaggi successivi e le fasi di incubazione di questa sezione devono essere eseguite a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante, se non diversamente indicato. soluzioni di lavaggio possono essere facilmente modificati utilizzando una plastica o vetro pipetta Pasteur a punta fine.
2. Diluire le primarie anticorpi / anticorpi desiderati in tampone di lavoro (0,1% BSA, 0,3% NGS, e 0,2% Triton X-100 in PBS). In questo esempio, diluire gli anticorpi DLL1 e Notch1 1:25 in tampone di lavoro.
   NOTA: L'ottimizzazione sarà richiesto per determinare il fattore di diluizione appropriata richiesta in this passaggio se si utilizzano anticorpi alternativi.
3. Incubare espianti nella soluzione di anticorpi per 3 - 5 giorni a 4 ° C su una piattaforma oscillante. Assicurati di includere alcuni campioni con tampone di lavoro che non contengono l'anticorpo primario di agire come controlli anticorpo secondario.
4. Recupero soluzione di anticorpo primario in un tubo memoria 1,5 mL con una pipetta e conservarlo a 4 ° C.
   NOTA: Recuperato anticorpo primario può essere utilizzato più volte, a seconda del anticorpo utilizzato.
5. Eseguire 2 lavaggi dei campioni per 5 - 10 minuti ciascuno in PBS, seguito da 3 lavaggi per 10 minuti ciascuno in 2% Triton X-100 in PBS a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante.
6. Diluire fluorescente anticorpi / anticorpi secondari (epitopo-abbinato per l'anticorpo primario / anticorpi utilizzati) in tampone di lavoro. Facoltativamente, aggiungere 20 mg / ml Hoechst 33342 per questa soluzione per colorazione di contrasto nuclei.
   NOTA: L'ottimizzazione può essere richiesto per determinare il fattore di diluizione appropriata necessaria in questa fase. In questo example, un fattore di diluizione di 1: 400 è stato usato tipicamente.
7. Centrifugare la soluzione di anticorpo secondario per 10 min a 16 xg per impedire la formazione di aggregati di anticorpi. Aggiungere 250 - 500 microlitri della soluzione di anticorpo secondario a ciascun pozzetto, facendo attenzione a non utilizzare gli ultimi microlitri della soluzione, che può contenere aggregati anticorpali.
8. Coprire il piatto del campione con carta stagnola per minimizzare l'esposizione alla luce e incubare i campioni in soluzione di anticorpo secondario 3 - 5 giorni a 4 ° C al buio.
9. Prima di assaggiare il montaggio, lavare i campioni due volte per 10 minuti ciascuno in 0,1% Tween-20 in PBS (PBST) e una volta per 5 min in PBS a RT su una piattaforma oscillante (vedi punto 4).

3. ibridazione in situ fluorescente (FISH) di PSM espianti

1. Se conservato in un vaso alternativa, trasferire i restanti espianti PSM controlaterale ai singoli pozzetti di una piastra di coltura tissutale 24 pozzetti.
2. Lavare i campioni per10 min in etanolo al 50% in PBST e quindi eseguire 2 lavaggi per 10 min ciascuna in 100% di etanolo su una piattaforma oscillante a RT per disidratare il tessuto.
   NOTA: Tutti i lavaggi successivi e le fasi di incubazione di questa sezione devono essere eseguite a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante, se non diversamente indicato.
3. Reidratare il tessuto da lavaggio per 10 minuti in etanolo al 50% in PBST, seguita da lavaggio due volte per 5 minuti ciascuno in PBST.
   NOTA: i passaggi 3.2 e 3.3 sono necessari passaggi di fissaggio necessari per questo protocollo e non può essere omesso.
4. Incubare i campioni con 10 mg / ml proteinasi K in 0.1% Tween-20 in PBS (PBST) per 5 minuti senza agitazione. rimuovere rapidamente la proteinasi K e sciacquare i campioni brevemente con PBST prima del post-fissare il tessuto per 30 min a 4% di formaldeide + 0,1% glutaraldeide in PBST. ATTENZIONE: Sia formaldeide e glutaraldeide sono tossici, e devono essere adottate misure di sicurezza appropriate quando si lavora con queste soluzioni.
   NOTA: La seguente lavaggioe le fasi di incubazione che coinvolgono il 50% e il 100% miscele di ibridazione (passi 3,6-3,9) devono essere eseguiti senza agitazione.
5. Dopo aver lavato i campioni due volte per 10 minuti ciascuno in PBST, lavare i campioni una volta nella miscela di ibridazione 50% (adatto per le sonde intronic: 50% formammide, 5x salina-citrato di sodio (SSC), 5 mM EDTA, 50 mg / ml tRNA, 0.2% Tween-20, 0,1% SDS, e 100 mg / ml di eparina) in PBST preparati a RT. Incubare i campioni in questa soluzione per 10 min a 65 ° C senza agitazione.
6. Risciacquare i campioni due volte con pre-riscaldato (65 ° C) della miscela di ibridazione prima incubando i campioni in miscela di ibridazione per ≥ 2 h (fino a 48 ore) a 65 ° C (tempi di incubazione più lunghi migliorare il conseguente contrasto segnale-rumore) . Rimuovere la miscela di ibridazione dal passaggio precedente, e sostituirlo a 0,25 - 0,5 di pre-riscaldato (65 ° C) della miscela di ibridazione contenente un digossigenina (DIG) -labeled sonda RNA antisenso contro un noto componente orologio segmentazione.
   NONE: Per esempio, una frangia Lunatic intronic (Lfng (i)) sonda è stato utilizzato ad una concentrazione di 20 microlitri / ml per rilevare nascente Lfng mRNA. La diluizione utilizzata in questo step è probe-dipendente e richiederà ottimizzazione.
7. Sigillare la piastra con nastro adesivo per evitare l'evaporazione e incubare i campioni nella soluzione della sonda per due notti a 65 ° C.
8. Usando una pipetta Pasteur di plastica a punta fine, recuperare la sonda per il riutilizzo e conservarlo a 20 ° C. Risciacquare i campioni due volte con pre-riscaldato (65 ° C) post-ibridazione mix (50% formammide, 0.2% Tween-20, e 1x SSC) prima di lavare i campioni altre due volte per 20 minuti ciascuno a 65 ° C in pre- riscaldato mix post-ibridazione.
9. Lavare i campioni per 15 min a 65 ° C in miscela di ibridazione preriscaldata 50% in 0.1% Tween-20 in soluzione salina tamponata con Tris (TBST). Risciacquare i campioni due volte con TBST prima di lavare per 30 minuti a RT in TBST su una piattaforma oscillante.
10. Pre-incubare gli espianti in blosoluzione cking (TBST + 2% tampone bloccante reagente (BBR) + 20% siero di capra trattato termicamente) per almeno 2 h. Sostituire questa soluzione con la soluzione bloccante fresco contenente una diluizione 1: 200 di perossidasi di rafano (HRP) coniugata anticorpo anti-digossigenina. Incubare i campioni O / N a 4 ° C.
11. Dopo l'incubazione dell'anticorpo, lavare i campioni 3 volte con TBST a RT e trasferirli a singoli pozzetti di una nuova piastra di coltura tissutale da 24 pozzetti. Lavare gli espianti con TBST 3 volte per 1 ora ciascuno.
12. A questo punto, trasferire i campioni in 0,5 mL tubi memorizzazione oi singoli pozzetti di una piastra di coltura tissutale a 48 pozzetti per ridurre il volume di reagenti di rivelazione Tyramide amplificazione del segnale (TSA) nelle seguenti fasi.
13. Incubare campioni nel buffer di amplificazione TSA (vedi elenco reagenti) a temperatura ambiente per 1 min senza agitazione usando come piccolo volume possibile, assicurando che i campioni sono completamente immersi nella soluzione.
14. Aggiungere TSA reagente (vedere laLista reagenti) al buffer di amplificazione campione ad una diluizione 1:50. mescolare rapidamente la soluzione fino a quando il reagente TSA è uniformemente distribuita, coprire la piastra o tubi in carta stagnola, e incubare i campioni per 60 - 90 minuti al buio.
15. Rimuovere la soluzione di amplificazione TSA e lavare i campioni in TBST 3 volte per 5 minuti ciascuno. Trasferire gli espianti di nuovo ad una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti per aumentare il volume di lavaggio e incubare i campioni in perossido di idrogeno 1% in TBST per 1 h. Lavare i campioni con TBST 3 volte per 5 minuti ciascuno, e poi due volte per 5 minuti ciascuno con PBST prima di assaggiare il montaggio (vedi punto 4).

4. Preparazione del campione per l'imaging

1. Preparare una carica vetrino adesione per ogni coppia espianto aggiungendo 0,12 mm distanziatori di imaging di spessore, che impediscono i campioni possano essere intrappolati con l'aggiunta di un coprioggetto. Rimuovere il rivestimento adesivo da una superficie di un distanziatore e posizionarlo adesivo rivolto verso il basso su un vetrino, premendo firmly per sigillare il distanziatore alla diapositiva.
   NOTA: per i passaggi rimanenti, il possibile per mantenere i campioni in condizioni di scarsa luce o al buio per evitare photobleaching. Pipette coppie espianto su un vetrino preparato con un bicchiere pipetta Pasteur all'interno del centro del distanziatore, assicurando che il lato sezionato del espianto affronta la diapositiva. Disporre coppie controlaterale del lato espianti a fianco.
2. Rimuovere quanto più liquido possibile dal vetrino con un bicchiere pipetta Pasteur e Wick l'eventuale umidità residua che circonda i campioni utilizzando un pezzo di carta velina basso rilascio di fibre piegato.
3. Permettere ai campioni di aderire alla diapositiva per 45 - 60 s, finché il tessuto inizia a comparire appiccicoso e trasparente. Durante questo tempo, togliere il rivestimento adesivo restante dal distanziale con pinze. Non lasciare che i campioni si asciughino.
4. Aggiungere una grande goccia di doppia funzione montante e la soluzione di compensazione (0,5% p-fenilendiammina e 20 mM Tris, pH 8,8, 90% glicerolo) ai campioni all'interno del centrodel distanziale. NOTA: Questa soluzione diventa marrone / nero quando consentito per ossidare.
5. Posizionare con cura un coprioggetto circolare (n. 1.5) attraverso i campioni, in modo che il mezzo di montaggio è distribuito uniformemente e che tutti i bordi del vetrino entrare in contatto con il distanziatore. Posizionare il vetrino di copertura-scivolato a testa in giù su un foglio di carta velina basso rilascio di fibre.
6. Premere con forza per garantire che il coprioggetto aderisce completamente al distanziatore e che ogni montante eccesso viene rimosso. Ripetere fino a quando non le macchie più montante della carta.
7. Pulire ed etichettare la slitta (s) in modo appropriato, e memorizzarli al buio fino a immagini, a breve termine a -20 ° C oa lungo termine a -80 ° C. Dopo aver rimosso le diapositive dalla memoria, permettere loro di scongelare completamente prima di imaging.
8. Immagine campioni montati utilizzando un microscopio confocale con l'acquisizione in maiolica e un obiettivo di alto ingrandimento. Immagine le coppie di espianti con un obiettivo ad immersione 40X a Z-intervalli di 4 micron utilizzando 488 nm, 568 nm e 647 nm laser lines per eccitare i fluorofori verde, rosso e rosso lontano, rispettivamente impiegati per le proteine e la rilevazione di mRNA in questo studio ^12.
   NOTA: Piastrellati immagini sono state cucite post-acquisizione in modo da formare una singola immagine per l'analisi.

5. post-acquisizione Image Analysis

1. Utilizzare immagine software di analisi per definire una regione di interesse all'interno del PSM di ciascun campione sperimentale.
   1. Per quantificare i livelli di espressione, sfondo sottrattivo e immagini soglia al livello di un campione di controllo non-primario prima successiva quantificazione. Definire un'origine, un asse, ed una unità di lunghezza per ogni campione.
2. Calcolare l'intensità di fluorescenza in funzione della posizione lungo l'asse rostro-caudale normalizzato per ciascuna delle M campioni ^12. Dopo normalizzare le trame intensità, posizionare il lato profili di intensità all'altra e formare una matrice di intensità f (i, j) che descrive l'intensità al i ^{° posizione spaziale nel j-esimo del campione.}

6. ordinamento temporale dei campioni

1. Per dedurre ordinamento temporale di un componente orologio noto, definire la matrice di intensità. Poi, riordinare le colonne della matrice intensità in modo da ottenere un modello temporalmente periodica. A tale scopo, definire la funzione
   
   dove A (f _j; k) rappresenta la funzione di autocorrelazione del j ^esima colonna di f e A _T è una funzione target autocorrelazione, scelti per applicare la periodicità temporale del modello, in
   
2. Utilizzare il Metropolis-Hastings (o un altro algoritmo di minimizzazione) ¹² per identificare l'ordine dei campioni che minimizzano la funzione g. Così, determinare l'ordine delM campioni che massimizza la periodicità temporale di una componente di orologio noto.
3. Utilizzando l'ordinamento temporale dedotto di campioni M, costruire un chimografo ordinato per il modello di espressione nel canale partnered ^12.

Risultati

Questo protocollo permette la visualizzazione del profilo spazio-temporale di una proteina di interesse fianco gene orologio trascrizione nel PSM del mouse ^12. Ad esempio, DLL1 (Figura 1A-C) e Notch1 espressione della proteina (Figura 1D-F) sono mostrati oscillare fuori sincronia con la trascrizione nascente del gene orologio di segmentazione Notch-regolata Lfng. Quantificazione di DLL1, Notch1 e Lfng (i) intensità di segnale rispetto all'asse antero-posteriore (AP) del PSM (Figura 1G) rivela chiare dinamiche espressione oscillatorie per questi obiettivi (Figura 1H-J). Il profilo spazio-temporale di espressione proteica DLL1 e Notch1 per tutto il ciclo di clock sono chiaramente visualizzate e quantificato utilizzando questo protocollo attraverso il post-acquisizione di analisi delle immagini dei dati di immagine di tessuto fissate ad alta risoluzione.

Figura 1: visualizzazione spazio-temporale e la quantificazione di DLL1 e NOTCH1 proteine Espressione Dynamics. (AF) Coppie di espianti di sei E10.5 embrioni (AF) mostra la distribuzione spaziale di DLL1 proteine (AC) o proteine Notch1 (DF) in una metà lungo il rilevamento di Lfng pre-mRNA (Lfng (i)) nel corrispondente metà controlaterale di ciascuna coppia. I pannelli sono disposti secondo Fase 1 (A e D), fase 2 (B ed E), e la fase 3 (C e F) del ciclo di clock di segmentazione, come determinato dal profilo spaziale di Lfng (i) espressione. L'estensione dei domini di espressione per DLL1 (verde), Notch1 (rosso), e Lfng (i) (grigio) lungo l'asse antero-posteriore del PSM ha been delimitata da barre colorate. Le linee tratteggiate delimitano le posizioni del somite più recente formazione (s), i bordi esterni del PSM, e il tessuto neurale adiacente (C ed E). Barre di scala (in basso a sinistra di ogni pannello, AF) rappresentano 100 micron. (G) Una trama intensità esempio raffigurante la variazione assiale di intensità del segnale in tutto il PSM. I dati vengono tracciati da due coppie espianto mostrano Lfng pre-mRNA (line hash nera) tra un espianto rispetto al Notch1 proteine (rosso) in espianto controlaterale (Embryo 1), nonché Lfng pre-mRNA (linea continua nera) in un'altra espianto rispetto al DLL1 proteine ​​(verde) nel espianto controlaterale (Embrione 2). intensità di segnale misurato (y) è tracciata contro la posizione assiale (asse x; antero PSM [A] verso destra e posteriore PSM [P] a sinistra). (H) A chimografo mostra la distribuzione spaziale delle DLL1, Notch1 e Lfng (i) di tuttinumerosi PSM. Ciascuna riga della chimografo rappresenta l'intensità di un individuo espianto PSM segnale. Le righe sono disposti in successione temporale in base alla distribuzione spazio-temporale dei Lfng pre-mRNA (I) La distribuzione spazio-temporale dei DLL1, Notch1 e Lfng (i) attraverso molteplici oscillazioni di clock è simulato l'estensione periodica dei dati mostrati in (H) , mettendo in evidenza la natura oscillatoria di DLL1 e NOTCH1 dinamiche di espressione. Espressione della proteina (J) pulsatile Notch1 nella caudale PSM è evidenziata dalla ingrandimento della regione delimitata nella chimografo virtuale mostrato in (I). Modificato da riferimento 12. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Quantificazione delle dinamiche spazio-temporali di DLL1 e Notch1 espressione della proteina. (A) Una trama esempio intensità descrive la variazione assiale di intensità del segnale in tutto il PSM. Dati tracciati da due coppie espianto mostra Lfng pre-mRNA (line hash nera) tra un espianto rispetto al Notch1 proteine (rosso) nella meta espianto controlaterale, nonché Lfng pre-mRNA (linea continua nera) in un mezzo espianto da un secondo coda rispetto al DLL1 proteine ​​(verde) controlaterale espianto metà del secondo coda. intensità misurate (asse y) vengono riportati in posizione assiale (asse x; rostrale [A] verso destra e caudale [P] a sinistra). (BH) Kymographs mostrano la distribuzione spaziale delle Notch1, DLL1, NiCd, e Lfng (i) attraverso numerosi PSM. (B e C) NICD (B) e DLL1 (C) espressione in sezioni PSM; (D ed E) Lfng (i) (D) e DLL1 ( E) a metà espianto controlaterale; (F e G) Lfng (i) (F) e Notch1 (G) a metà espianto controlaterale. Dal riferimento 12. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

I passaggi critici all'interno del protocollo

Il presente protocollo descrive un metodo sensibile per eseguire l'analisi quantitativa di basso livello di espressione proteica e oscillatori dinamiche in espianti E10.5 il mouse PSM. Un protocollo robusto sia per immunoistochimica e ibridazione in situ fluorescente (FISH) segue ad alta risoluzione tutto il montaggio confocale, e quindi mediante analisi di immagine e segmentazione temporale kymographs per generare una mappa spazio-temporale dell'espressione della proteina attraverso la PSM. Un alto rapporto segnale-rumore nel rilevamento di proteine ​​e mRNA è essenziale per garantire il successo di questa tecnica. Bisogna fare attenzione a scambiare accuratamente tutte le soluzioni efficacemente durante le fasi di lavaggio e di mantenere la temperatura di 65 ° C lavaggi nelle fasi pertinenti del passaggio 3. È più vantaggiosa per prendere il tempo a fonte anticorpi efficaci e sonde di RNA contro la obiettivi di interesse e per testare questi reagentiaccuratamente su campioni tutto il montaggio prima di iniziare questo protocollo.

Modifiche e risoluzione dei problemi

I principali problemi che possono verificarsi durante l'esecuzione di questo protocollo nascono dalla scarsa resistenza di rilevamento del segnale e la qualità. Questo dipende in gran parte l'efficacia degli anticorpi o sonde di RNA utilizzati per le immunoistochimica o pesce fasi del protocollo, rispettivamente. Un certo numero di differenti fasi può richiedere l'ottimizzazione prima che sia raggiunto il rilevamento del segnale adeguata. Una causa comune per la rilevazione del segnale è scarsa fissazione improprio; è imperativo che sia fresco PFA o PFA conservati a 4 ° C per non più di una settimana viene utilizzato per fissare i campioni. La lunghezza di determinazione può anche richiedere l'ottimizzazione, in funzione della sonda anticorpo o RNA utilizzato. Per gli anticorpi, si consiglia di seguire le istruzioni del produttore per quanto possibile, mentre per le sonde di RNA, si consiglia la consultazione della letteratura pubblicata.

In questo studio abbiamo utilizzato una sonda di RNA che rileva specificamente il pre-mRNA del gene orologio Lfng. A causa della sua relativa mancanza di abbondanza, rilevamento di Lfng pre-mRNA richiede un lungo periodo di incubazione con la sonda nella miscela di ibridazione contenente 5x citrato salina di sodio (SSC) per buona rilevazione del segnale. Le stesse condizioni si possono verificare ad altre sonde che rilevano mRNA debolmente espresse, ma nella nostra esperienza, la rivelazione di bersagli mRNA più stabili potrebbero richiedere un passo più corto della sonda di ibridazione e le concentrazioni più basse SSC nel mix di ibridazione (ad esempio, 1,3x SSC). Per entrambi immunoistochimica e FISH, il protocollo deve prima essere ottimizzato su embrioni interi, e la concentrazione ottimale di anticorpi o sonda deve essere determinata empiricamente.

LIMITI DELLA TECNICA

Come accennato in precedenza, il successo di questa tecnica è altamente dipendente dalla qualità della proteina e la rilevazione mRNA. We hanno delineato diversi suggerimenti su come proteine ​​e rilevamento mRNA può essere migliorata, ma in assenza di rilevamento del segnale fluorescente ad alta qualità, non c'è modo l'esperimento può procedere. Il numero di proteine ​​bersaglio che può essere analizzato in ogni campione di tessuto è limitata dalla risoluzione spettrale del microscopio confocale e gli epitopi degli anticorpi utilizzati. In questo studio, siamo stati in grado di utilizzare fino a tre epitopi per la rilevazione delle proteine accanto ad una macchia di DNA su ciascun campione ^12. Questo protocollo consente solo il rilevamento di un bersaglio mRNA, nonostante i metodi attuali alternativi potrebbero essere impiegati per aumentare questo fino a tre target ^14.

Importanza della tecnica con rispetto agli attuali metodi alternativi /

Il metodo descritto qui fornisce una tecnica sensibile per rilevare le fluttuazioni di proteine ​​a basso livello in espianti tutto il montaggio PSM. La quantificazione di queste dinamiche èpossibile eseguendo FISH per un gene orologio noto in corrispondenti espianti controlaterale. Una libreria di kymographs viene generato che possono essere organizzate più di un ciclo di clock di segmentazione, mettendo in evidenza le dinamiche spazio-temporali di espressione di un obiettivo di interesse entro questo lasso di tempo. Una differenza chiave in questa tecnica rispetto ad altri è l'uso di automazione computazionale per ordinare temporalmente grandi insiemi di dati, che consente le dinamiche spazio-temporali di espressione dei componenti dell'orologio romanzo da analizzare in modo imparziale. Ad esempio, questa tecnica disponibile comprensione in come DLL1 e Notch1 proteine ​​e loro oscillazioni sono co-regolati attraverso l'intera PSM. Metodi alternativi in ​​questo contesto hanno anche invocato immunostaining, ma non rilevare le piccole fluttuazioni nei livelli di proteina DLL1 e Notch1 nel PSM caudale che erano evidenti utilizzando questo metodo. Invece, hanno riferito una pendenza costante di espressione che è più forte nella regione rostrale ^{9 , 10, 11. Ciò può essere dovuto al fatto che questo protocollo ha una più lunga durata di incubazione anticorpo primario (3 - 5 giorni, al contrario di notte), che può essere richiesta per rilevare i livelli più bassi di proteine. Mentre i livelli di DLL1 ed espressione Notch1 sono relativamente elevati nel rostrale PSM, questo può aver influenzato di immagine gli autori sarebbero necessari i campioni a una impostazione di minore esposizione per rilevare l'espressione della proteina caudale. Un'ulteriore differenza potenziale deriva dall'uso di tessuto non fissato nello studio di Chapman et al. , In cui l'espressione transitoria di DLL1 e Notch1 nel caudale PSM può essere stato meno ben conservato 9.}

Le applicazioni future o Indicazioni Dopo aver imparato la tecnica

Una volta che questo protocollo è stato masterizzato, high-throughput analisi di espressione può essere eseguita per qualsiasi proteina di interesse nel PSM.espianti PSM generati da diverse cucciolate mouse possono essere trattati contemporaneamente per generare il numero elevato campione necessario per l'analisi. Anche se abbiamo usato solo tipo selvatico embrioni in questi studi, è possibile eseguire questa analisi utilizzando embrioni geneticamente modificati al fine di valutare l'importanza di uno o più fattori sulla dinamica di espressione proteica. Al di là del PSM, questo protocollo può essere adattato ad altri sistemi che sono costituiti da due metà controlaterali e possono essere utilizzati per rilevare sensibilmente basso livello di espressione proteica e oscillatorie dinamiche. Un esempio per i quali questo protocollo potrebbe essere adattato è lo studio di espressione della proteina dinamica del tubo neurale del mouse, dal momento che metà controlaterale potrebbero essere generati e colto, e l'attività Notch ha dimostrato di essere presente e importante per il patterning ^15. Incoraggiamo altri gruppi di adattare questo protocollo ad altri sistemi e per fornire un feedback per il miglioramento futuro.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM-F12	Gibco (ThermoFisher Scientific)	11320033
GlutaMAX™-1 (100x)	Gibco (ThermoFisher Scientific)	35050
Siero fetale bovino, qualificato, approvato dall'UE, origine sudamericana	Gibco (ThermoFisher Scientific)	10270106
FGF-basic umano ricombinante (154 a.a.)	Peprotech	100-18B
Penicillina/Streptomicina	Gibco (ThermoFisher Scientific)	15140122
anticorpo monoclonale Notch1 anti-topo^	BD Pharmingen	552466
anticorpo Dll1 policlonale anti-ratto^*	N/A	N/A
Lfng sonda RNA anti-senso intronica^*	N/A	N/A
16% paraformaldeide	Pierce (ThermoFischer Scientific)	PI28908
Proteinasi K, ricombinante, grado PCR	Roche (Sigma-Aldrich)	31158
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,4	Prodotto in casa	N/A
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787
Albumina sierica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	5470
Siero di capra normale (NGS) (trattato termicamente)	Gibco (ThermoFisher Scientific)	16210072
Hoechst 33342	ThermoFischer Scientific	H3570
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416
Etanolo	Sigma-Aldrich	46139
Glutaraldeide	Sigma-Aldrich	340855
Formamide	Sigma-Aldrich	F9037
Citrato salino di sodio (SSC)	Sigma-Aldrich	93017
EDTA	Sigma-Aldrich	798681
tRNA	Roche (Sigma-Aldrich)	101095
Eparina	Sigma-Aldrich	H3149
Soluzione salina tris-tamponata (TBS)	Prodotto internamente	N/A
Reagente tampone bloccante	Roche (Sigma-Aldrich)	11096176001
anticorpo coniugato anti-DIG perossidasi di rafano (HRP) Kit coniugato	Roche (Sigma-Aldrich)	11207733910
Tyramide signal amplification (TSA)	Perkin Elmer	NEL744001KT
*L'anticorpo Dll1 e la sonda RNA utilizzati in questo studio non sono disponibili in commercio. Si prega di consultare i riconoscimenti per le fonti.
^Dovrebbero essere reperite sonde di anticorpi/RNA che siano applicabili agli interessi di ricerca del lettore.