Un semplice passo-dissezione Protocollo per tutto il montaggio Preparazione per adulti Drosophila Brains

Sommario

L'adulto Drosophila cervello è un sistema utile per studiare circuiti neuronali, le funzioni cerebrali superiori, e malattie complesse. Un metodo efficace per sezionare intero tessuto cerebrale dalla testa piccola mosca faciliterà gli studi del cervello-based. Qui si descrive un semplice, one-step protocollo dissezione del cervello adulto con ben conservato morfologia.

Abstract

Vi è un crescente interesse nell'uso di Drosophila per modellare cervello malattie degenerative umane, la mappa circuiterie neuronali nel cervello adulto, e studiare le basi molecolari e cellulari delle funzioni cerebrali superiori. Una preparazione tutto il montaggio del cervello adulto con ben conservato la morfologia è fondamentale per tali studi intero cervello-based, ma può essere tecnicamente impegnativo e richiede molto tempo. Questo protocollo descrive un approccio dissezione one-step facile da imparare, di una testa adulta mosca in meno di 10 s, mantenendo il cervello intatto attaccato al resto del corpo per facilitare le successive fasi di lavorazione. La procedura aiuta a rimuovere la maggior parte dei tessuti oculari e tracheali normalmente associati con il cervello che può interferire con la fase di imaging più tardi, e pone anche meno domanda sulla qualità delle dissettore. Inoltre, si descrive un metodo semplice che consente comoda capovolgimento dei campioni cerebrali montati su un vetrino, che è importante per l'imaging entrambi i lati della bpiogge con intensità di segnale simile e qualità. Come esempio di protocollo, presentiamo un'analisi dopaminergici (DA) neuroni nel cervello adulto di WT (w ¹¹¹⁸⁾ mosche. L'elevata efficacia del metodo di dissezione lo rende particolarmente utile per gli studi basati su cervello adulto su larga scala in Drosophila.

Introduzione

L'organismo modello Drosophila, comunemente nota come la mosca della frutta, è stato a lungo apprezzato per i suoi eleganti strumenti genetici, tempi brevi riproduttivi, e altamente conservata percorsi molecolari e cellulari. Il moscerino della frutta è stato impiegato con successo per analizzare i percorsi di base di segnalazione, i meccanismi patterning di organismi multicellulari, nonché i meccanismi alla base dello sviluppo neuronale, le funzioni e le malattie ^1,2. Con i recenti progressi nelle tecnologie di etichettatura delle cellule e di imaging, il cervello mosca della frutta è diventato particolarmente potente nella mappatura fine di circuiti neuronali e nella dissezione delle basi molecolari e cellulari delle funzioni cerebrali superiori, come l'apprendimento e la memoria, e il ritmo circadiano ^{1,3, 4,5,6,7,8.}

Un particolare vantaggio del sistema Drosophila è la sua dimensione relativamente piccola, permettendo tutto il montaggio la preparazione e l'esame del cervello utilizzando un composto regolare o microscopio confocale. ThiFunzione s consente analisi dettagliate anatomiche e funzionali di circuiti neuronali, o anche un singolo neurone, a livello cellulare e subcellulare, nel contesto di un tessuto cerebrale intera, fornendo quindi sia una visione olistica del soggetto studiato e la sua geometria precisa all'interno dell'intero cervello. Tuttavia, date le dimensioni piuttosto miniatura del cervello, presenta anche una sfida tecnica in sezionare in modo efficiente un tessuto cerebrale intatto fuori dalla custodia protettiva testa esoscheletro in una mosca adulta. Vari metodi dissezione efficaci e relativamente semplici sono state descritte in dettaglio, che di solito comporta un'attenta e graduale rimozione del caso testa ei relativi tessuti compresi gli occhi, trachea, e grasso dal cervello corretta ^{9, 10.} Questi metodi di dissezione microchirurgia pone spesso domande piuttosto stringenti sulla qualità delle pinze dissezione, basandosi su una pinza con punte sottili ben allineati che possono essere facilmente danneggiati. Inoltre, come i cervelli sezionati sono spesso separatcato dal resto del corpo, i cervelli possono essere facilmente perse durante i successivi processi di colorazione e lavaggio a causa delle loro piccole dimensioni e la loro trasparenza nel buffer di elaborazione. Qui, descriviamo un relativamente semplice e facile da imparare, protocollo di dissezione one-step per cervello adulto che mantiene il cervello sezionati attaccati al torso. Il processo di dissezione spesso cancella facilmente via la maggior parte dei tessuti cerebrali associate come l'occhio e la trachea e riduce la domanda di pinze dissezione di buona qualità.

Inoltre, quando l'imaging del cervello al microscopio composto fluorescente o microscopio confocale, la parte del cervello che è lontano dalla sorgente di luce fluorescente spesso produce un segnale più debole e immagini meno chiare a causa dello spessore del cervello intero montaggio. Qui, descriviamo anche un semplice metodo di montaggio che consente una facile capovolgimento dei campioni cerebrali, consentendo comoda immagini di entrambi i lati del cervello con simili intensi segnalety e qualità.

Come un proof-of-concept per l'applicazione di questo metodo per studiare il cervello adulto, abbiamo esaminato ulteriormente la presenza di neuroni DA nel cervello di w ¹¹¹⁸ mosche; un genotipo che viene spesso utilizzato come la linea dei genitori per la generazione di mosche transgeniche e il controllo di tipo selvatico in molti studi di Drosophila.

Protocollo

1. Le soluzioni usate per Brain dissezione e colorazione di immunofluorescenza

1. Sezionare l'adulto volare cervelli in artificiale liquido cerebro-spinale (aCSF): 119 mm NaCl, 26,2 mM NaHCO _3, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH ₂ PO _4, 1,3 mm MgCl _2, e 10 mm di glucosio. Prima dell'uso, gas ACSF con il 5% di CO _2/95% O ₂ per 10 - 15 minuti e picco con 2,5 mM CaCl _2. Sterilizzare la soluzione aCSF filtrando attraverso un filtro di 0,22 micron membrana.
   Nota: Conservare aCSF a 4 ° C per evitare la contaminazione batterica. Mosca cervello può anche essere sezionato in una soluzione salina tampone-fosfato (PBS), anche se non sono stati effettuati confronti dettagliati degli effetti delle due soluzioni dissezione sulla qualità delle immagini finale dei cervelli sezionati.
2. Utilizzare 4% paraformaldeide (PFA) preparato in PBS 1x come soluzione fissativo, che è normalmente aliquotati e conservati a -20 ° C.
   caution: PFA è tossico e corrosivo e deve essere maneggiato con cura.
3. Utilizzare 1x PBS per risciacquare il PFA dal cervello e dopo l'ultima fase di lavaggio, durante la colorazione immunofluorescenza dei cervelli sezionati. Preparare il 1x PBS da 10x soluzione PBS magazzino (1,37 M di NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na ₂ HPO _4, e 18 mm KH ₂ PO _4).
4. Utilizzare 0,3% Tween-20 a 1x PBS (1x PBT) per tutte le successive fasi di lavaggio durante immunofluorescenza colorazione dei cervelli sezionati.

2. microchirurgica dissezione di adulti Fly Heads

Nota: La procedura di dissezione è illustrato nella figura 1.

1. Anestetizzare le mosche adulte con CO _2. Utilizzando pinze, prendere una mosca e brevemente DEWAX sua cuticola immergendolo in etanolo al 70% per 3 - 5 s. Questo assicura che nessuna bolla aderiscano alla cuticola volo quando immerso nella aCSF o soluzione dissezione 1X PBS.
2. Sotto undissezione microscopio con una sorgente di luce ad un angolo che non sarà bloccato da mani, impostare la lente obiettivo di raggiungere una visione chiara della mosca (1.2X ingrandimenti). Utilizzare pinze con la mano non dominante per immobilizzare l'animale ed immergere la mosca nella soluzione dissezione a freddo con il suo addome rivolto verso l'alto, come mostrato nella Figura 1A.
3. Mantenere la pinza a 160 - Angolo ° 170 rispetto alla piastra dissezione, esercitando nel contempo una piccola forza sul ventre di volo (illustrata frecce in figura 1A). Questo passaggio immobilizzare il volo e costringerlo a spostare la testa all'indietro di 15 - 25 ° mentre si estende la proboscide verso l'alto. Nel processo, una regione morbido e traslucido della cuticola, sotto la proboscide, dovrebbe diventare apparente. Aumentare l'ingrandimento e regolare il piano focale su questa regione.
   Nota: Non tenere le pinze troppo stretto, ma piuttosto abbastanza ferma per stabilizzareil volo. Troppo forza causerà gli organi interni rottura nella soluzione.
4. Utilizzare la mano dominante per premere i dissettore modo che le punte sono chiusi, che genererà una forza resistente lieve sulle punte della pinza, in modo che la pinza si molla aperta quando la pressione della mano che regge viene rilasciato. Posizionare la pinza perpendicolarmente alle pinze tengono la mosca, come mostrato nella Figura 1B.
   1. Pierce le punte chiuse della pinza dissezione attraverso la regione morbido e traslucido della cuticola sotto la proboscide, come illustrato dalla freccia rossa nella figura 1B. È importante non penetrare le pinze troppo in profondità che tocca il cervello. Il cervello corretta dovrebbe diventare visibile. Mantenere una stretta stabile al volo con la mano non dominante.
5. Rapidamente ma costantemente, rilasciare le punte della pinza dissezione dalla propria forza e si basano sullo slancio da questa release di strappare via tegli esoscheletro che circonda la testa mosca. Un cervello intatto corretta dovrebbe diventare visibile (tessuto bianco immediatamente sopra la punta della pinza basso nella Figura 1C) Seguire una linea immaginaria per guidare il moto delle punte forcep rilasciati (illustrati come le frecce rosse esteriori mostrato nella Figura 1C). Ciò rimuovere delicatamente l'esoscheletro e più dell'occhio cervello associata e trachea dal cervello. La tempistica adeguata e forza applicata per aprire l'esoscheletro dipenderà esperienza del ricercatore.
   Nota: Questa è la fase più critica durante la dissezione. È importante contare sulla forza naturale generata dal moto della pinza apertura per rimuovere l'esoscheletro lasciando il cervello esposto rimane attaccato al resto del corpo.
6. Utilizzare le pinze nella mano dominante per rimuovere con attenzione i tessuti accessori residuo, come ad esempio la tracheale che appare come strutture fibra bianca remaining attaccato al cervello. Fare attenzione a non tirare o danneggiare il cervello corretta.

3. immunofluorescenza colorazione dei cervelli

1. Fissare i campioni di cervello sezionato con i loro torsi associati in circa 1 ml di PFA 4% per 40 - 60 min.
   Nota: Per questa e le successive fasi, mantenere i tubi o piastre con campioni su un nutator per miscelare correttamente i campioni nella soluzione.
2. Risciacquare con 1 ml di PBS 1x pipettando la soluzione su e giù per 3 volte. Fare attenzione a non aspirare il cervello di distanza.
3. Lavare 5 volte con 1x PBT per 5 minuti ciascuna. Mantenere i campioni sul nutator durante l'incubazione.
4. Incubare con anticorpi primari corretta diluizione O / N a 4 ° C.
5. Il giorno successivo, rimuovere gli anticorpi primari, e lavare i campioni 5 volte con 1x PBT. Lasciare i campioni per 5 - 10 minuti nella soluzione 1x PBT tra ogni lavaggio. Mantenere i campioni sul nutator durante l'incubazione.
6. Incubare il lavatocampioni in opportuni anticorpi secondari con la diluizione ed il tempo di incubazione suggerite.
7. Lavare i campioni sei volte con 1x PBT con 10 minuti di incubazione tra ogni lavaggio.
   Questo passaggio è fondamentale per la rimozione di anticorpi secondari aspecifico legati dal campione.
8. Incubare in una diluizione 1: 10.000 1 mg / mL 4 ', 6'-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) in soluzione 1x PBT per 30 min. DAPI è un colorante DNA che si lega alle regioni AT di DNA e può essere utilizzato per rivelare la morfologia complessiva del cervello.
9. Risciacquare tre volte con PBS 1x.
10. campioni Trasferire in un piatto dissezione, e separare i cervelli dei corpi in un piatto dissezione con pinze.
11. Dopo la procedura di colorazione e lavaggio, montare i cervelli tra due coprioggetto e posizionare il coprioggetto sulla cima di una diapositiva montaggio. In questo modo, i campioni cerebrali possono essere facilmente capovolto in modo che entrambi i lati del cervello può essere ripreso con intensità segnale simile.
    Nota: Montaggio del cervello su vetrino invece che direttamente sulla slitta di montaggio consente capovolgimento dell'orientamento del campione liberamente. Il processo di montaggio è spiegato in dettaglio più avanti.
    1. Inserire un coprioggetto 18 x 18 mm in cima ad una slitta di montaggio. Ampliare l'apertura di un puntale con una lama e utilizzarlo per trasferire i cervelli in soluzione 1x PBS sul vetrino 18 x 18 mm.
    2. Posizionare il cervello a metà del vetrino, rimuovere il liquido in tutto il cervello con una multa punta della pipetta, e poi aggiungere un altro 20 - 40 ml di anti-sbiadimento mezzo di montaggio (0.2% (w / v) n-propil gallato a 99,5 % ACS grado glicerolo) sopra il cervello.
       Nota: La quantità di mezzo di montaggio aggiunto dipende dal numero di cervelli esaminati.
    3. Delicatamente diffondere il cervello, mentre spostando il mezzo di montaggio viscosa verso l'esterno. Posizionare un secondo vetrino 18 x 18 mm sulla parte superiore del cervello abbassando il vetrino da una parte fino al contatto conla superficie della barbottina di montaggio, e poi lentamente abbassare l'altro lato per minimizzare il contatto cervello con bolle d'aria.
       Nota: Non vi è alcuna necessità di utilizzare un distanziale tra le due lamelle, come il volume del mezzo di montaggio e il cervello dovrebbero fornire uno spazio sufficiente per separare le due coprioggetto.
    4. Lasciare le diapositive di stabilirsi. Rimuovere il liquido eccessivo che escono dai lati dei bollettini con un tessuto di laboratorio.
    5. Per evitare che i vetrini con il cervello montati di cadere diapositiva di montaggio durante il trasporto, utilizzare un piccolo pezzo di nastro adesivo per fissare i coprioggetti alla slitta di montaggio.
       Nota: Cervelli montati tra i vetrini possono essere esposte immediatamente o conservati a 4 ° C fino ad una settimana senza significativa perdita di segnale fluorescente, senza necessità di utilizzare un altro sigillante diapositive. Per la conservazione a lungo termine dei cervelli macchiati, il lato dei due foglietti può essere sigillato wesimo smalto e conservati in un congelatore a -20 ° C, anche se i cervelli colorati potrebbero perdere i loro segnali nel corso del tempo. Questo non è raccomandato.
12. Utilizzare un microscopio composto fluorescente appropriato o microscopio confocale a immagine il cervello.
    1. Innanzitutto, acquisire l'immagine dal lato del cervello più vicino all'obiettivo e quindi capovolgere attentamente i coprioggetti disporre i campioni sandwich nel mezzo. Questa fase facilita l'acquisizione dell'immagine dell'altro lato della stessa cervello.
    2. Utilizzare un microscopio verticale composto fluorescente e una lente obiettivo 20X all'immagine l'intero cervello (esempi della Figura 2) e un obiettivo 40X per immagini più piccole regioni del cervello, come neuroni dopaminergici nella regione di cluster appaiati anteriore mediale (PAM) (esempi in figura 3).

Risultati

La Figura 1 illustra le procedure principali per dissezione cervello adulto, come sopra descritto le figure 2 e 3 sono immagini rappresentative di 3 giorni di età WT. (Genotipo: w ¹¹¹⁸⁾ adulto vola cervello, che sono stati costained con un anticorpo contro la tirosina idrossilasi (TH , colorato in rosso nella figura 2 e nero in figura 3), un marker comunemente usato per etichettare ne...

Discussione

Con un crescente interesse ad utilizzare per adulti Drosophila cervello per studiare malattie umane del cervello, circuiti neuronali, e le funzioni cerebrali superiori, è necessario sviluppare metodi semplici e veloci per ottenere il cervello della mosca intatto per tutto il montaggio analisi, che è particolarmente importante per larga scalare schermi cervello-based. Il nostro metodo fornisce una semplice e facile da imparare approccio per sezionare una testa di mosca (spesso in meno di 10 s con esperienza) con...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
w*;   parcoΔ 21/TM3,  P{GAL4-Kr.C}DC2,  P{UAS-GFP. S65T}DC10,  Sb1	Bloomington Drosophila Stock Center	51652	Balancer è stato commutato in TM6B
PBac{WH}parkf01950	Exelixis presso la Harvard Medical School	f01950	Balancer è stato sostituito in TM6C
NaCl	Fisher Scientific	S640-500
Bicarbonato di sodio (NaHCO3)	Fisher Scientific	02-003-990
Cloruro di potassio (KCl)	Fisher Scientific	BP366-500
Fosfato di sodio, monobasico monoidrato (NaHCO3)	Fisher Scientific	02-004-198
Cloruro di magnesio (MgCl2)	Fisher Scientific	02-003-265
D-sorbitolo	Sigma-Aldrich	S1876-500G	Sostituisce il glucosio
Cloruro di calcio diidrato (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C5670-500G
EMD Millipore  Filtri a membrana Durapore PVDF: Idrofili: 0,22 µ m Dimensione dei pori	Fisher Scientific GVWP14250
Soluzione di formalina, 10% (istologica)	Fisher Scientific	SF98-20
Fosfato di potassio, bibasico, polvere, bioreagente ultrapuro	Fisher Scientific	02-003-823
Tween-20 Fisher	Scientific	BP337-500
Excelta Pinzette di precisione con punte molto fini	Fisher Scientific	Il protocollo 17-456-055	non richiede punti molto fini.
Anticorpo anti-tirosina idrossilasi	Pel-Freez Biologicals	P40101
Rat-Elav-7E8A10 anti-elav	Gli studi sullo sviluppo Banca degli ibridomi	Clone 7E8A10
Anticorpo secondario anti-IgG di ratto di capra (H+L), coniugato Alexa Fluor 647	ThermoFisher Scientific	A-21247
Anticorpo secondario IgG (H+L) di capra anti-coniglio, coniugato Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A-11037
Soluzione DAPI (1 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	62248
Polvere di gallato di propile	Sigma-Aldrich	P3130-100G
Reagente ACS al glicerolo, ≥ 99.5%	Sigma-Aldrich	G7893-500ML
Zeiss Axioimager Z1	Zeiss	Preventivo
Zeiss Apotome.2	Zeiss	Preventivo
Zen lite software		Preventivo