Articolo metodologico

Quantificazione dei batteri istidina chinasi autophosphorylation usando un test nitrocellulosa Binding

DOI:

10.3791/55129

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11 gennaio 2017

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1Department of Chemistry, Stony Brook University, 2Department of Physiology and Biophysics, Stony Brook University

In questo articolo

Sommario

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Segnaliamo e dimostriamo un saggio ottimizzato di legame della nitrocellulosa che può essere utilizzato per quantificare l'autofosforilazione delle istidina chinasi batteriche purificate. Il nostro metodo presenta diversi vantaggi rispetto alle tradizionali tecniche basate su SDS-PAGE, fornendo una valida alternativa per la caratterizzazione di queste importanti proteine.

Abstract

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Dimostriamo un metodo utile per quantificare l'autofosforilazione delle istidina chinasi batteriche purificate. Le istidina chinasi sono note per il loro coinvolgimento nella trasduzione del segnale a due componenti, un sistema ubiquitario attraverso il quale i batteri percepiscono e rispondono agli stimoli ambientali. La segnalazione a due componenti è caratterizzata dall'autofosforilazione di un'istidina chinasi, seguita dal fosfotrasferimento al dominio ricevente di una proteina regolatrice della risposta, che alla fine porta a una risposta di uscita. L'autofosforilazione dell'istidina chinasi risponde alla presenza di uno stimolo ambientale affine, fornendo così ai batteri un mezzo per rilevare e rispondere ai cambiamenti nell'ambiente. Nonostante la loro importanza nella biologia batterica, le istidina chinasi rimangono poco conosciute a causa della labilità intrinseca della fosfoistidina. I metodi convenzionali per lo studio di queste proteine, come l'autoradiografia SDS-PAGE, presentano carenze significative. Abbiamo sviluppato un saggio di legame della nitrocellulosa che può essere utilizzato per caratterizzare le istidina chinasi. Il protocollo per questo test è semplice e facile da eseguire. Il nostro metodo è più produttivo, richiede meno tempo e offre una gamma dinamica maggiore rispetto all'autoradiografia SDS-PAGE.

Introduzione

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risposta adattativa è cruciale per la sopravvivenza dei batteri. Al fine di rilevare e rispondere a cambiamenti ambientali, batteri usano un sistema stimolo-risposta nota come segnalazione bicomponente. 1,2 In un tipico sistema a due componenti, la chinasi istidina rileva uno stimolo affine, autophosphorylates suo residuo istidina conservati, poi trasferisce fosfato ad un residuo aspartato conservati nel dominio ricevente di una proteina regolatore di risposta. 3 Questo evento attiva un cambiamento nell'attività del regolatore di risposta, che stimola un effetto valle. 4,5 Così, i batteri sono in grado di rilevare e adattarsi ai c....

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Protocollo

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Attenzione: Questo protocollo richiede una formazione adeguata per l'uso e la manipolazione di materiali radioattivi. Si prega di utilizzare il dispositivo di protezione individuale richiesto durante l'esecuzione di questo test, tra cui schermatura contro le radiazioni beta. I rifiuti radioattivi deve essere maneggiato con cura, come i grandi volumi di rifiuti sono generati durante la fase di lavaggio dell'esperimento. Assicurarsi che la rifiuti sono stoccati in un contenitore in posizione verticale, come un grande secchio o una bottiglia che non sarà facilmente rovesciato o fuoriuscita. Una volta che l'esperimento è concluso, trasferire accuratamente tutti i rifiuti liqu....

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Risultati

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Un insieme di dati rappresentativi è stato generato con un'immagine catturata con un imager fosforo (Figura 1), Ponceau S macchia della membrana di nitrocellulosa (Figura 2), e dati di conteggio a scintillazione (Figura 3). La figura 3A mostra le costanti cinetiche degli enzimi in una trama Lineweaver-Burk. Questi risultati sono stati ottenuti utilizzando una chinasi istidina purificata dalla specie gram-negativi Vib.......

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Discussione

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Il saggio di legame nitrocellulosa che abbiamo descritto ha molti vantaggi rispetto ai metodi utilizzati in precedenza per caratterizzare chinasi istidina. Rispetto ai tradizionali SDS / PAGE autoradiografia-based, il nostro metodo è maggiore produttività e meno tempo. La membrana di nitrocellulosa è facile da gestire rispetto gel SDS, e non deve essere fissato. Ponceau macchiare la nitrocellulosa consente per le macchie di proteine ​​per essere visualizzati. Questo fornisce un modo semplice per tagliare ogni spot per i.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento della Pubblica Istruzione attraverso l'assistenza Laurea in Aree di programma di fabbisogno nazionale (P200A100044).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Acido fosforicoVWRAAAA18067-APPer reazioni di quenching e lavaggio nitrocellulosa
Tris baseRPIT60040-5000.0Tris-HCl pH 8.0, per tampone di reazione chinasica
Cloruro di potassioRPIP41000-2500.0Per tampone di reazione chinasi
Cloruro di magnesioRPIM24000-500.0Per tampone
di reazione chinasiGliceroloRPIG22020-4000.0Per tampone di reazione chinasica
5'-ATPPromegaE6011Substrato chinasi
[γ-32P]-5'-ATPPerkin ElmerNEG002Z250UC 6.000 Ci/mmol
Apparecchio a 96 pozzetti per macchieBio-rad1706545Per reazioni di spotting
NitrocellulosaWhatman32-10401396-PKPer reazioni di spotting
Ponceau SSigma aldrichP3504-50GPer la colorazione di nitrocellulosa

Riferimenti

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  1. Stock, A. M., Robinson, V. L., Goudreau, P. N. Two-component signal transduction. Annu. Rev. Biochem. 69, 183-215 (2000).
  2. Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. Histidine kinases and response regulators in networks. Curr. Opin. Microbiol. 15 (2), 118-124 (2012).
  3. Parkinson....

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Histidine Kinase AutophosphorylationNitrocellulose Binding AssayTwo Component SignalingRadioactive Ligand DetectionScintillation CountingGamma 32P ATPPonceau S StainingPhosphoric Acid WashStandard Curve GenerationProtein Phosphorylation Quantification

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