Quantificazione dei batteri istidina chinasi autophosphorylation usando un test nitrocellulosa Binding

Sommario

Segnaliamo e dimostriamo un saggio ottimizzato di legame della nitrocellulosa che può essere utilizzato per quantificare l'autofosforilazione delle istidina chinasi batteriche purificate. Il nostro metodo presenta diversi vantaggi rispetto alle tradizionali tecniche basate su SDS-PAGE, fornendo una valida alternativa per la caratterizzazione di queste importanti proteine.

Abstract

Dimostriamo un metodo utile per quantificare l'autofosforilazione delle istidina chinasi batteriche purificate. Le istidina chinasi sono note per il loro coinvolgimento nella trasduzione del segnale a due componenti, un sistema ubiquitario attraverso il quale i batteri percepiscono e rispondono agli stimoli ambientali. La segnalazione a due componenti è caratterizzata dall'autofosforilazione di un'istidina chinasi, seguita dal fosfotrasferimento al dominio ricevente di una proteina regolatrice della risposta, che alla fine porta a una risposta di uscita. L'autofosforilazione dell'istidina chinasi risponde alla presenza di uno stimolo ambientale affine, fornendo così ai batteri un mezzo per rilevare e rispondere ai cambiamenti nell'ambiente. Nonostante la loro importanza nella biologia batterica, le istidina chinasi rimangono poco conosciute a causa della labilità intrinseca della fosfoistidina. I metodi convenzionali per lo studio di queste proteine, come l'autoradiografia SDS-PAGE, presentano carenze significative. Abbiamo sviluppato un saggio di legame della nitrocellulosa che può essere utilizzato per caratterizzare le istidina chinasi. Il protocollo per questo test è semplice e facile da eseguire. Il nostro metodo è più produttivo, richiede meno tempo e offre una gamma dinamica maggiore rispetto all'autoradiografia SDS-PAGE.

Introduzione

risposta adattativa è cruciale per la sopravvivenza dei batteri. Al fine di rilevare e rispondere a cambiamenti ambientali, batteri usano un sistema stimolo-risposta nota come segnalazione bicomponente. ^1,2 In un tipico sistema a due componenti, la chinasi istidina rileva uno stimolo affine, autophosphorylates suo residuo istidina conservati, poi trasferisce fosfato ad un residuo aspartato conservati nel dominio ricevente di una proteina regolatore di risposta. ³ Questo evento attiva un cambiamento nell'attività del regolatore di risposta, che stimola un effetto valle. ^4,5 Così, i batteri sono in grado di rilevare e adattarsi ai c....

Protocollo

Attenzione: Questo protocollo richiede una formazione adeguata per l'uso e la manipolazione di materiali radioattivi. Si prega di utilizzare il dispositivo di protezione individuale richiesto durante l'esecuzione di questo test, tra cui schermatura contro le radiazioni beta. I rifiuti radioattivi deve essere maneggiato con cura, come i grandi volumi di rifiuti sono generati durante la fase di lavaggio dell'esperimento. Assicurarsi che la rifiuti sono stoccati in un contenitore in posizione verticale, come un grande secchio o una bottiglia che non sarà facilmente rovesciato o fuoriuscita. Una volta che l'esperimento è concluso, trasferire accuratamente tutti i rifiuti liqu....

Risultati

Un insieme di dati rappresentativi è stato generato con un'immagine catturata con un imager fosforo (Figura 1), Ponceau S macchia della membrana di nitrocellulosa (Figura 2), e dati di conteggio a scintillazione (Figura 3). La figura 3A mostra le costanti cinetiche degli enzimi in una trama Lineweaver-Burk. Questi risultati sono stati ottenuti utilizzando una chinasi istidina purificata dalla specie gram-negati.......

Discussione

Il saggio di legame nitrocellulosa che abbiamo descritto ha molti vantaggi rispetto ai metodi utilizzati in precedenza per caratterizzare chinasi istidina. Rispetto ai tradizionali SDS / PAGE autoradiografia-based, il nostro metodo è maggiore produttività e meno tempo. La membrana di nitrocellulosa è facile da gestire rispetto gel SDS, e non deve essere fissato. Ponceau macchiare la nitrocellulosa consente per le macchie di proteine ​​per essere visualizzati. Questo fornisce un modo semplice per tagliare ogni spot per i.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Acido fosforico	VWR	AAAA18067-AP	Per reazioni di quenching e lavaggio nitrocellulosa
Tris base	RPI	T60040-5000.0	Tris-HCl pH 8.0, per tampone di reazione chinasica
Cloruro di potassio	RPI	P41000-2500.0	Per tampone di reazione chinasi
Cloruro di magnesio	RPI	M24000-500.0	Per tampone
di reazione chinasiGlicerolo	RPI	G22020-4000.0	Per tampone di reazione chinasica
5'-ATP	Promega	E6011	Substrato chinasi
[γ-32P]-5'-ATP	Perkin Elmer	NEG002Z250UC	6.000 Ci/mmol
Apparecchio a 96 pozzetti per macchie	Bio-rad	1706545	Per reazioni di spotting
Nitrocellulosa	Whatman	32-10401396-PK	Per reazioni di spotting
Ponceau S	Sigma aldrich	P3504-50G	Per la colorazione di nitrocellulosa